全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(11): 19051913 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(31371609)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 陈耀锋, E-mail: chenyf3828@126.com; 李宏伟, E-mail: hwli@genetics.ac.cn
第一作者联系方式: E-mail: chenkunmeisummer@126.com
Received(收稿日期): 2014-03-03; Accepted(接受日期): 2014-09-16; Published online(网络出版日期): 2014-10-20.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20141020.1015.003.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.01905
利用病毒介导基因沉默方法研究小麦抗光氧化相关基因
陈坤梅 1,2 李宏伟 2,* 林凡云 2 陈耀锋 1,* 李 滨 2 郑 琪 2 李振声 2
1 西北农林科技大学农学院, 陕西杨凌 712100; 2中国科学院遗传与发育生物学研究所, 植物细胞与染色体工程国家重点实验室, 北
京 100101
摘 要: 为了鉴定可能的小麦抗光氧化基因, 利用大麦条斑病毒(barley stripe mosaic virus, BSMV)介导的基因沉默
(virus-induced gene silencing, VIGS)系统, 对 6个小偃 54响应强光的基因进行了沉默表达研究。以 BSMV:GFP植株
为对照, 分析了这些基因的减量表达植株在低温强光、DCMU、MV、H2O2等处理下的 PSII 最大光化学效率(Fv/Fm)
和光合性能指数(P.I.)、MDA含量及整株生物量变化。结果显示, Ta23008和 Ta92165均参与小麦对低温强光、DCMU、
MV和 H2O2等胁迫的响应过程; Ta106078参与小麦对 DCMU、MV和 H2O2等胁迫的响应过程; Ta27787参与小麦对
低温强光、DCMU 和 H2O2等胁迫的响应过程; Ta24695 参与小麦对低温强光和 H2O2胁迫的响应过程; 而 Ta119251
仅参与小麦对 DCMU 的响应过程。此外, Ta23008、Ta92165、Ta106078、Ta119251 四个基因被抑制表达后, 其转化
株系的生物量比对照显著降低, 推测其可能参与调控小麦生物量的积累。
关键词: 小麦; 大麦条斑病毒(BSMV); 病毒介导的基因沉默; 基因功能; 光氧化
Functional Analysis of Photo-Oxidative Stress Responsive Genes in Wheat
Using Virus-Induced Gene Silencing System
CHEN Kun-Mei1,2, LI Hong-Wei2,*, LIN Fan-Yun2, CHEN Yao-Feng1,*, LI Bin2, ZHENG Qi2, and LI
Zhen-Sheng2
1 College of Agronomy, Northwest A&F University, Yangling 712100, China; 2 State Key Laboratory of Plant Cell and Chromosome Engineering,
Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China
Abstract: Functional analysis of photo-oxidative stress responsive genes in wheat (Triticum aestivum L.) may benefit wheat im-
provement for high radiation use efficiency. A Chinese variety Xiaoyan 54 developed from distant hybridization between common
wheat (T. aestivum, 2n=42) and tall wheatgrass (Thinopyrum ponticum, 2n=70) shows significant tolerance to high light induced
photo-oxidative stress. Based on previous transcriptome analysis of Xiaoyan 54 in response to high light stress, six genes were
selected in this study to assess their possible roles in photo-oxidative stress response using barley stripe mosaic virus (BSMV)
mediated virus-induced gene silencing (VIGS) system in Xiaoyan 54. The BSMV induced silencing of the targeted genes together
with the BSMV:GFP control plants were exposed to low temperature and high light (LTHL), N-(3,4-dichlorophenyl)-N’,N’-
dimethylurea (DCMU), methylviologen (MV), and hydrogen peroxide (H2O2) stress, respectively. The maximum photochemical
efficiency of photosystem II (Fv/Fm), the photosynthetic performance index (P.I.), malondialdehyde (MDA) content, and biomass
were evaluated. The results showed that Ta23008 and Ta92165 were involved in the responses of wheat to LTHL, DCMU, MV,
and H2O2, respectively. Ta106078 was responsible for wheat tolerance to DCMU, MV, and H2O2 while Ta27787 was responsible
for LTHL, DCMU, and H2O2 stress. Ta24695 participated in the response of wheat to both LTHL and H2O2. However, Ta119251
seemed to be only responsible for the DCMU stress in wheat. Additionally, four genes, Ta23008, Ta92165, Ta106078, and
Ta119251, were likely to regulate biomass accumulation because the biomass was significantly reduced when they were silenced
in wheat. These results provided new hints toward understanding the molecular mechanism of tolerance to photo-oxidative stress
in Xiaoyan 54.
Keywords: Triticum aestivum; Barley stripe mosaic virus; VIGS; Genomic function; Photo-oxidative stress
1906 作 物 学 报 第 40卷


小麦灌浆中后期经常面临的强光高温等引起的
光氧化胁迫是限制小麦产量的重要生理原因之一 ,
提高小麦抗光氧化能力对提高小麦的产量具有重要
意义。20 世纪 80 年代提出的作物高光效育种现已
成为提高作物产量的重要方向之一[1]。高光效育种
是一个内涵较广的概念, 如寻找光、暗呼吸比低的
材料, 通过基因工程手段改造光合机构组分从而提
高作物光合速率等[2]都属于高光效育种的范畴。此
外, 提高作物抗光氧化或光抑制能力也是作物高光
效育种的重要内容之一[3]。
对小麦抗光氧化相关基因的研究既可以解析小麦
抗光氧化的遗传机制又可为小麦高光效分子改良提供
基因资源及分子标记。病毒诱导的基因沉默(virus-
induced gene silencing, VIGS)是指携带目标基因片段
的病毒侵染植物后, 可诱导植物内源基因抑制表达,
根据侵染植株的表型及生理生化变异研究目标基因的
功能[4]。VIGS 必须依赖于在寄主植物上建立有效的
VIGS 载体, 大麦条斑花叶病毒(barley stripe mosaic
virus, BSMV)基因组包括 α、β、γ, 其中经改造的 γ载
体是在小麦中实现 VIGS的有效载体[5]。与传统的基因
功能分析方法相比, VIGS能够在侵染植物当代对目标
基因进行沉默和功能分析, 可以高通量对小麦基因展
开功能研究。该方法仅用目的基因的一段序列(一般小
于 200 bp)即可对特定目的基因进行沉默表达, 因此不
受限于基因全长序列。在当前植物表达序列标签
(expressed sequence tags, EST)大量测定的情况下, 利
用 VIGS的方法可以快速高通量研究这些基因的功能,
该方法已被广泛运用于小麦基因功能研究[6-10]。
小偃54是李振声等利用远缘杂交获得的优质小
麦品种, 具有耐光氧化特性[11-13]。李宏伟等[14]对小
偃54响应连续强光处理不同时间的光合参数、抗氧
化酶及光系统色素结合蛋白基因表达变化作了检测,
发现以连续强光处理8 h为临界点, 小偃54响应连续
强光的过程可分为光合诱导期(连续强光小于8 h)和
光氧化期(连续强光大于8 h)。此外, 李振声课题组对
小偃54响应连续强光处理不同时间的基因转录组做
了检测(未发表)。本研究以此数据为基础, 从中选取
6个小偃54强光响应基因, 利用 BSMV 介导的 VIGS
体系研究其响应光氧化胁迫的功能, 为深入研究其
功能提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
小偃 54种子经 1.5% H2O2浸泡 12 h后, 用去离
子水冲洗数遍, 摆于育苗盘上, 置植物培养箱中生
长。培养条件为光强 100~150 μmol m–2 s–1, 光周期
14 h, 温度 23℃ (昼)/18℃ (夜), 相对湿度 60%左
右。培养 1周后转入 Hoagland小麦全营养液中培养
至两叶一心期。
1.2 目的基因片段分离与 BSMV载体构建
利用 Primer3 软件 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-
0.4.0/primer3/)设计基因引物, 并在引物的 5端引入
Nhe I 酶切位点, 所有引物(表 1)均由生工生物工程
(上海)有限公司合成。利用这些引物从小偃 54 的
cDNA 中扩增目的基因片段。PCR 反应体系 25 μL,
含 10×buffer 2.5 μL、10 μmol L–1 正反向引物各
0.5 μL、dNTP 0.25 mmol L–1、Mg2+ 0.1 mmol L–1、
KOD酶 0.5 U、cDNA模板 2 μL及双蒸水。PCR扩
增程序为 94℃预变性 5 min, 35个循环(94℃变性 30
s, 57~59℃退火 30 s, 68℃延伸 30 s), 68℃延伸 8 min,
结束后加入 Taq酶(上海申能博彩科技生物有限公司)
在 72℃下保温 20 min, 使平末端的扩增产物变为黏
性末端。PCR产物经 1%琼脂糖凝胶电泳分离后回收
目的片段, 与 PMD18-T 克隆载体(TaKaRa)连接, 转
化大肠杆菌感受态细胞并进行蓝白斑筛选。对经菌落
PCR检测阳性的克隆进行测序确认。用 Nhe I酶切目
的基因片段并连接至大麦条斑病毒 γ 载体中, 构建
BSMV表达载体, 转化大肠杆菌, 提取质粒备用。

表 1 目的基因探针号及引物序列
Table 1 Probe sets and primer sequences of the investigated genes
引物序列 Primer sequence (5′–3′) 基因
Gene
探针
Probe 正向 Forward 反向 Reverse
退火温度
Annealing temp. (ºC)
Ta23008 TaAffx.23008.1.S1_at AAGAAAGCGGCTCGTGTATG GTTGTTGCTGCAATCTGTCG 57
Ta24695 TaAffx.24695.1.S1_at GATCGGCGATGAAGAAGTGC CTGAATGGTTCCATTGAGGGC 58
Ta27787 Ta.27787.1.S1_s_at GATGCAAGTGCAAAGAAGTCG CTGTTTCAGAGCAGGCCGAA 58
Ta92165 TaAffx.92165.1.S1_at GACGAGGTGCTTGTGGTGAT CCGTGTCAGAAAGGATGTAGC 58
Ta119251 TaAffx.119251.1.S1_s_at TCGTATGCCATCGACTTGAC CCGAGTACACCAATCAGCAA 57
Ta106078 TaAffx.106078.1.S1_at TCGCAACAACAGGAACAGC CTCTGGTGCTTCGTCATGGA 59
第 11期 陈坤梅等: 利用病毒介导基因沉默方法研究小麦抗光氧化相关基因 1907


1.3 BSMV侵染转化小麦
用 Mlu I 酶将构建的 γ:gene与 γ:GFP 质粒线性
化, 同时分别用 Mlu I和 Spe I线性化 BSMV的 α、β
载体。用 RiboMAX Large Scale RNA Production
System-T7试剂盒(Promega)分别进行体外转录 α、β、
γ:gene、γ:GFP 的 RNA。将体外转录 α、β、γ:GFP
的 RNA各 10 μL等量混合, 加入 300 μL GKP缓冲
液(50 mmol L–1甘氨酸, 30 mmol L–1磷酸氢二钾, 1%
膨润土, 1%硅藻土, pH 9.2), 作为对照(BSMV:GFP);
将 α、β、γ:gene 的 RNA 各 10 μL 等量混合, 加入
300 μL GKP 缓冲液 , 作为处理 (BSMV:gene); 以
GKP 缓冲液侵染的小麦植株为非病毒侵染对照
(Mock)。侵染时戴乳胶手套手工磨擦接种二叶一心
期小偃 54幼苗第 2片叶, 每株 10 μL, 每次侵染 30
株左右。每个基因重复 3次。
1.4 BSMV侵染小麦后目的基因表达检测
分别取 5个 BSMV侵染小麦第 4叶(BSMV:gene
和 BSMV:GFP)混 合 研 磨 后 , 用 TRIzol 试 剂
(Invitrogen)提取总 RNA, 经 DNase 消化、酚/氯仿/
异戊醇纯化后, 用 PrimeScript RT Perfect Real-time
试剂盒(TaKaRa)反转录成第 1 链 cDNA。以小麦
TaTubulin基因(F: 5′-ACCGCCAGCTCTTCCACCCT
-3′; R: 5′-TCACTGGGGCATAGGAGGAA-3′)作内参,
采用分离目的基因片段的 PCR程序进行 RT-PCR半
定量法检测目的基因表达量。
1.5 叶绿素荧光测定
小麦叶片经 15 min暗适应后, 用 Handy-PEA叶
绿素荧光仪(英国Hansatech公司)测定 PSII最大光化
学效率(Fv/Fm)和光合性能指数(P.I.), 饱和闪光光强
为 3000 μmol m–2 s–1, 闪光时间为 1 s。
1.6 低温光抑制处理
将待检测小麦植株从室温转入 6℃恒温冷室 ,
用 1000 μmol m–2 s–1光强处理不同时间。光源为 5×5
的金属卤化物灯(HQI-TS 150 W/D, OSRAM)[15], 与
样品之间有 5 cm流动水层用于隔热, 整个处理在 6℃
中进行。
1.7 氧化剂胁迫处理离体叶片
将 BSMV 侵染植株的第 5 叶分别剪去 2 cm 的
叶尖和叶基部, 叶片中间部分剪成 2~3 cm叶段, 分
别于 20 μmol L–1 DCMU、20 μmol L–1 MV 和
200 mmol L–1 H2O2 溶液中黑暗放置 2 h。经 500~
600 μmol m–2 s–1光强处理后测叶绿素荧光。
1.8 丙二醛(MDA)含量测定
称取约0.05 g叶片, 装入2.0 mL离心管, 加入钢珠,
液氮冷冻后用植物组织粉碎仪TissueLyser II (Qiagen)研
磨成粉末, 加 1.5 mL预冷的 10%三氯乙酸(TCA)提取液,
振荡混匀后于冰上浸提 2 h, 然后 4℃下 12 000 ×g离心
15 min。取 200 μL上清液, 加入 10% TCA 200 μL混匀
作为对照; 另取 200 μL上清液, 加入 0.6%硫代巴比妥
酸(TBA) 200 μL混匀作为处理。对照和处理均在沸水浴
中煮沸 10 min, 冰上冷却, 10 000×g、4℃离心 2 min。
取 200 μL上清液, 用酶标仪(Thermo)扫描波长 440、532
和 600 nm下的吸光值[16], 以 10% TCA调空白。利用
Hodges[17]描述的公式计算MDA含量。
1.9 数据处理及统计分析
数据计算在 Microsoft Excel 2007 中完成。用
SPASS17.0 软件进行方差分析(ANOVA), 用最小显
著差数法(Least-significant difference, LSD)检验显著
性, 使用 SigmaPlot 10.0软件作图。
2 结果与分析
2.1 目的基因在 BSMV侵染植株中的表达
从小偃 54响应强光的差异表达基因中选取 6个
基因, 其中 4个编码转录因子, 另外 2个功能未知。
利用设计的特异引物(表 1), 从小偃 54 中分离这 6
个基因的片段, 目的基因片段大小在 150~250 bp之
间。利用构建的 BSMV基因沉默表达载体转化小偃
54 三叶期幼苗。RT-PCR 半定量表达结果显示, 与
BSMV:GFP 对照植株相比, 各沉默株系的目的基因
的表达均受到明显抑制(图 1)。
2.2 BSMV侵染小麦对低温强光的响应
低温强光处理后, 各 BSMV 侵染植株的 Fv/Fm

图 1 目的基因在 BSMV侵染植株中的表达
Fig. 1 Expression of the investigated genes in BSMV infected plants
1: BSMV:GFP; 2: BSMV:gene. Ta23008: Ethylene-responsive transcription factor; Ta24695: bZIP transcription factor; Ta27787: MYB
transcription factor; Ta92165: GRAS family transcription factor; Ta119251: Function unknown; Ta106078: Function unknown;
TaTubulin: Tubulin (internal reference).
1908 作 物 学 报 第 40卷


和 P.I.明显降低, 例如 BSMV:GFP植株叶片的 Fv/Fm
比处理前下降 16.0%~28.4%, 而 P.I.更是下降 75.8%~
87.2%。经低温强光处理后, BSMV:Ta23008、BSMV:
Ta24695 和 BSMV:Ta27787 植株的 Fv/Fm和 P.I.显著
低于 BSMV:GFP植株。此外, BSMV:Ta92165植株低
温强光处理前后的 P.I.也显著低于 BSMV:GFP植株。
尽管BSMV:Ta119251植株在低温强光处理后与对照
无显著差异, 但低温强光处理前其 Fv/Fm和 P.I.均显
著低于对照(表 2)。
2.3 BSMV侵染小麦对 DCMU的响应
经 DCMU 和光照处理后 , BSMV:Ta27787、
BSMV:Ta119251、BSMV:Ta23008、BSMV:Ta92165
和 BSMV:Ta106078 植株的 Fv/Fm和 P.I.均显著低于
BSMV:GFP 对照植株。其中 BSMV:Ta92165 和
BSMV:Ta106078 植株的 Fv/Fm和 P.I.甚至在 DCMU
和光照处理前也均显著低于对照。而 BSMV:Ta24695
植株的 Fv/Fm和 P.I.在 DCMU 和光照处理前后与对
照均无显著差异(表 3)。

表 2 BSMV侵染小麦对低温强光的响应
Table 2 Chlorophyll fluorescence parameters in BSMV infected wheat subjected to low temperature and high light
最大光化学效率
Maximum photochemical efficiency of PSII (Fv/Fm)
光合性能指数
Photosynthetic performance index (P.I.)
BSMV侵染小麦
BSMV infected
wheat 0HPT 3HPT 0HPT 3HPT
BSMV:GFP 0.81±0.000 0.64±0.046 4.54±0.258 1.10±0.272
BSMV:Ta23008 0.82±0.002 0.51±0.052* 4.43±0.089 0.58±0.174*
BSMV:Ta24695 0.81±0.001 0.45±0.032** 4.14±0.184 0.41±0.063**
BSMV:Ta92165 0.81±0.004 0.57±0.016 3.84±0.290* 0.62±0.067*

BSMV:GFP 0.81±0.002 0.68±0.014 4.49±0.180 1.01±0.125
BSMV:Ta27787 0.81±0.002 0.57±0.034** 4.23±0.139 0.69±0.092*
BSMV:Ta119251 0.79±0.004** 0.62±0.012 3.32±0.344** 0.84±0.049

BSMV:GFP 0.81±0.001 0.58±0.029 4.84±0.203 0.62±0.152
BSMV:Ta106078 0.81±0.003 0.55±0.047 4.22±0.164 0.47±0.085
0HPT: 处理前; 3HPT: 处理后 3 h。*和**分别表示 BSMV:gene小麦与对照(BSMV:GFP)在 0.05和 0.01概率水平有显著差异。
0HPT: before treatment; 3HPT: 3 h post treatment. * and ** indicate significant difference between the BSMV:gene wheat and the con-
trol (BSMV:GFP) at 0.05 and 0.01 probability levels, respectively.

表 3 BSMV侵染小麦对 DCMU的响应
Table 3 Chlorophyll fluorescence parameters in BSMV infected wheat subjected to DCMU
最大光化学效率
Maximum photochemical efficiency of PSII (Fv/Fm)
光合性能指数
Photosynthetic performance index (P.I.)
BSMV侵染小麦
BSMV infected
wheat 处理前 Before treatment 处理后 After treatment 处理前 Before treatment 处理后 After treatment
BSMV:GFP 0.81±0.001 0.72±0.013 4.14±0.159 0.61±0.091
BSMV:Ta27787 0.80±0.004 0.67±0.018* 3.81±0.216 0.30±0.068*
BSMV:Ta119251 0.80±0.003 0.67±0.016** 3.83±0.271 0.23±0.064*

BSMV:GFP 0.80±0.002 0.60±0.025 3.46±0.331 0.25±0.082
BSMV:Ta23008 0.80±0.002 0.49±0.039* 3.01±0.105 0.03±0.017**
BSMV:Ta24695 0.80±0.002 0.56±0.031 2.98±0.210 0.11±0.048
BSMV:Ta92165 0.78±0.005** 0.45±0.025** 2.07±0.220* 0.02±0.011**
BSMV:Ta106078 0.77±0.012** 0.48±0.032* 2.23±0.473* 0.04±0.020*
*和**分别表示 BSMV:gene小麦与对照(BSMV:GFP)在 0.05和 0.01概率水平有显著差异。
* and ** indicate significant difference between the BSMV:gene wheat and the control (BSMV:GFP) at 0.05 and 0.01 probability levels,
respectively.

2.4 BSMV侵染小麦对 MV的响应
MV 处理的所有 BSMV 植株经中等光强照射,
其 Fv/Fm 和 P.I.均显著降低。与光照处理后的
BSMV:GFP 相比, BSMV:Ta23008小麦叶片的 Fv/Fm
第 11期 陈坤梅等: 利用病毒介导基因沉默方法研究小麦抗光氧化相关基因 1909


与 P.I.均显著降低 ; BSMV:Ta92165 和 BSMV:
Ta106078的 P.I.也显著降低; BSMV:Ta106078的 P.I.
即使在未经光照处理时也显著较对照(BSMV:GFP)
降低; 而 BSMV:Ta24695、BSMV:Ta27787和 BSMV:
Ta119251植株的 Fv/Fm与 P.I.值, 在经MV和光照处
理后尽管比对照低, 但差异不显著(表 4)。

表 4 BSMV侵染小麦对 MV的响应
Table 4 Chlorophyll fluorescence parameters in BSMV infected wheat subjected to MV
最大光化学效率
Maximum photochemical efficiency of PSII (Fv/Fm)
光合性能指数
Photosynthetic performance index (P.I.)
BSMV侵染小麦
BSMV infected
wheat 处理前 Before treatment 处理后 After treatment 处理前 Before treatment 处理后 After treatment
BSMV:GFP 0.80±0.001 0.70±0.010 2.35±0.179 1.21±0.065
BSMV:Ta23008 0.80±0.007 0.47±0.096* 2.38±0.340 0.45±0.184*
BSMV:Ta24695 0.81±0.002 0.60±0.060 2.32±0.353 0.85±0.239
BSMV:Ta27787 0.80±0.001 0.55±0.117 2.20±0.166 0.80±0.374
BSMV:Ta92165 0.78±0.012 0.60±0.031 1.87±0.274 0.58±0.166*
BSMV:Ta119251 0.78±0.014 0.62±0.043 1.98±0.359 0.81±0.234
BSMV:Ta106078 0.78±0.007 0.50±0.115 1.64±0.142* 0.29±0.139**
*和**分别表示 BSMV:gene小麦与对照(BSMV:GFP)在 0.05和 0.01概率水平有显著差异。
* and ** indicate significant difference between the BSMV:gene wheat and the control (BSMV:GFP) at 0.05 and 0.01 probability levels,
respectively.

2.5 BSMV侵染小麦对 H2O2的响应
在 H2O2及光照处理前, BSMV:Ta23008、BSMV:
Ta24695、BSMV:Ta27787、BSMV:Ta92165和 BSMV:
Ta106078小麦叶片的 Fv/Fm与对照叶片几乎无差异,
而在 H2O2 及光照处理后 , 分别比对照低 7.8%、
6.4%、3.2%、8.7%和 6.2%, 其中 BSMV: Ta92165达
显著水平。处理前, BSMV:Ta23008、BSMV:Ta24695、
BSMV:Ta27787、BSMV:Ta92165和 BSMV:Ta106078
小麦叶片的 P.I.比对照略低, 而在处理后显著低于对
照(表 5)。

表 5 BSMV侵染小麦对 H2O2的响应
Table 5 Chlorophyll fluorescence parameters in BSMV infected wheat subjected to H2O2
最大光化学效率
Maximum photochemical efficiency of PSII (Fv/Fm)
光合性能指数
Photosynthetic performance index (P.I.)
BSMV侵染小麦
BSMV infected
wheat 处理前 Before treatment 处理后 After treatment 处理前 Before treatment 处理后 After treatment
BSMV:GFP 0.81±0.001 0.72±0.005 4.81±0.175 1.21±0.081
BSMV:Ta23008 0.81±0.001 0.66±0.023 4.27±0.104 0.70±0.051**
BSMV:Ta24695 0.81±0.002 0.67±0.027 4.09±0.258 0.76±0.072**
BSMV:Ta27787 0.81±0.003 0.70±0.007 3.45±0.197 0.92±0.069*
BSMV:Ta92165 0.81±0.001 0.66±0.021* 4.53±0.003 0.72±0.106**
BSMV:Ta119251 0.80±0.003 0.70±0.014 4.02±0.302 1.04±0.100
BSMV:Ta106078 0.81±0.003 0.67±0.025 4.22±0.164 0.83±0.127**
*和**分别表示 BSMV:gene小麦与对照(BSMV:GFP)在 0.05和 0.01概率水平有显著差异。
* and ** indicate significant difference between the BSMV:gene wheat and the control (BSMV:GFP) at 0.05 and 0.01 probability levels,
respectively.

2.6 BSMV侵染小麦 MDA含量
与 BSMV 未侵染的对照(Mock)植株相比 , 除
BSMV:Ta27787外的 5个基因沉默株系, 其 MDA含
量均显著升高(图 2)。BSMV:Ta23008、BSMV:Ta24695、
BSMV:Ta92165、BSMV:Ta119251和BSMV:Ta106078
植株的MDA含量分别比病毒侵染对照(BSMV:GFP)
植株高 18.4%、16.4%、85.2%、11.7%和 36.4%, 其
中 BSMV:Ta92165 与对照差异达显著水平。该结果
显示, 除 BSMV:Ta27787外, 其他 5个基因沉默株系
的细胞膜膜脂过氧化程度不同程度地加剧。
1910 作 物 学 报 第 40卷



图 2 BSMV侵染小麦叶片 MDA含量
Fig. 2 MDA content in BSMV infected wheat leaves
误差线上不同字母表示株系间有显著差异(P < 0.05)。Mock: 非病毒侵染对照; BSMV:GFP: 病毒侵染对照。
Different letters above error bars indicate significant difference among wheat lines (P < 0.05). Mock: non-virus control; BSMV:GFP: viral control.

2.7 BSMV侵染小麦的生物量
BSMV:Ta23008、BSMV:Ta92165、BSMV:Ta119251
和 BSMV:Ta106078 植株的生物量显著低于对照, 表明
Ta23008、Ta92165、Ta119251和 Ta106078基因可能参与
小麦生物量的积累过程; 而 BSMV:Ta24695 和 BSMV:
Ta27787植株的生物量与对照相当, 无显著差异(图 3)。

图 3 BSMV侵染小麦植株的生物量
Fig. 3 Biomass in BSMV infected wheat plants
**表示 BSMV介导的基因沉默株系与对照有显著差异(P < 0.01)。
Double asterisks (**) indicate significant difference between the BSMV
infected gene-silenced line and the control (BSMV:GFP) (P < 0.01).
3 讨论
低温强光等逆境胁迫促使植物体内产生大量活
性氧 , 造成细胞膜的损伤进而引起光合系统破坏 ,
导致植物光能利用率的下降。DCMU 是一种电子传
递抑制剂, 它可以结合在光反应中心 D1 蛋白的 QB
位点上, 阻止 QB 的还原, 从而阻断电子的传递, 导
致光化学效率变化。MV作为 PSI电子传递到 O2的
有效人工次生电子受体, 是细胞内产生氧化胁迫的
促进剂, 常被用来研究超氧自由基介导的植物氧化
伤害。低浓度的 H2O2可以作为植物细胞的信号分子,
增加植物的耐受性, 但高浓度时它将作为一种活性
氧对植物造成氧化伤害。Fv/Fm和 P.I.是反映植物叶
片光合活性的重要叶绿素荧光参数, 其中 Fv/Fm 反
映 PSII 反应中心光能转换效率, 正常条件下该参数
变化不大, 约为 0.80~0.85, 不受物种和生长条件的
影响, 而在逆境胁迫下会明显下降[18]。P.I.反映植物
光合机构的状态, 它对某些胁迫比 Fv/Fm更敏感, 能
更好地反映胁迫对光合机构的影响[19-20]。利用这 2
个参数可有效评价 BSMV介导的基因沉默株系的光
合活性对低温强光、DCMU、MV和 H2O2等胁迫的
第 11期 陈坤梅等: 利用病毒介导基因沉默方法研究小麦抗光氧化相关基因 1911


响应。在本研究中, Ta23008和 Ta92165均参与小麦
同时对低温强光、DCMU、MV和 H2O2等胁迫的响
应过程, Ta106078同时参与小麦对 DCMU、MV 和
H2O2等胁迫的响应过程 , Ta27787同时参与小麦对
低温强光、DCMU 和 H2O2等胁迫的响应过程 ,
Ta24695参与小麦对低温强光和 H2O2胁迫的响应过
程, 而 Ta119251参与小麦对 DCMU 的响应过程(表
6), 表明这6个目的基因参与调控小麦抗光氧化胁
迫能力。此外 , Ta23008、 Ta92165、Ta119251和
Ta106078被抑制表达后, 其转化株系的生物量比对
照显著降低 , 因此推测这4个基因可能参与调控小
麦生物量的积累。
MDA是膜脂过氧化的重要产物, 可与蛋白质、
核酸、氨基酸等活性物质交联, 形成不溶性的化合
物(脂褐素)沉积, 干扰细胞的正常生命活动。本研究
中, BSMV:Ta23008、BSMV:Ta24695、BSMV:Ta92165、
BSMV:Ta119251 和 BSMV:Ta106078 小麦叶片的
MDA含量比 BSMV:GFP高 11.7%~85.2%, 表明这 5
个基因沉默株系的细胞膜完整性受到不同程度损
伤。细胞膜的稳定性可用来判断植物的抗逆性, 这
可能是导致 BSMV:Ta23008、BSMV:Ta24695、BSMV:
Ta92165、BSMV:Ta119251和 BSMV:Ta106078小麦
抗光氧化胁迫能力下降的重要原因。

表 6 目的基因对光氧化胁迫的响应及 MDA与生物量积累
Table 6 Responses of investigated genes to photo-oxidative
stress and accumulation of MDA and biomass
基因
Gene
低温强光
LT+HL
DCMU MV H2O2
丙二醛
MDA
生物量
Biomass
Ta23008 + + + + +
Ta92165 + + + + + +
Ta106078 + + + +
Ta27787 + + +
Ta24695 + +
Ta119251 + +
+表示目的基因可能参与的响应。DCMU、MV 和 H2O2为
不同氧化剂。
+ denotes possible response of the gene. LT+HL: low tem-
perature and high light; MDA: malondialdehyde. DCMU, MV, and
H2O2 are different oxidants used in this study.

Ta23008 编码一个 AP2 相关转录因子, 其功能
在小麦中未见报道, 在水稻中它的同源基因编码的
蛋白为 ERT (ethylene-response transcription factor)
114, 在拟南芥中为 RAP2.6L。水稻 ERT114 相关功
能未见报道, 而在拟南芥中发现 RAP2.6L 响应茉莉
酸、水杨酸、脱落酸、乙烯等植物激素, 同时对盐
和干旱胁迫响应, 在拟南芥中超表达后能提高植株
抗盐和抗干旱能力[21]。大豆中 AP2/ERT类转录因子
与植物耐盐和耐干旱相关 [22]。本研究有类似发现 ,
小麦 Ta23008 在光氧化胁迫中起重要作用 , 说明
Ta23008 在植物中具有抗逆功能。前人研究表明 ,
RAP2.6L 通过调节植物体内激素水平来调节细胞分
化 , 这对受损组织愈合起重要作用 , 并且发现
AtRAP2.6L 表达受抑制时髓细胞分裂也受阻[23]。我
们推测, BSMV:Ta23008小麦植株的生长受到严重抑
制可能与植物体内激素变化有关, 但尚需更多实验
证据予以验证。
Ta24695 编码一个光诱导蛋白 CPRF2, 包含
bZIP 转录因子蛋白结构域。拟南芥中 bZIP 转录因
子家族功能主要是抵御真菌侵害、调节光或胁迫信
号、调节种子成熟和花的发育等[24]。CPRF2在主要
谷类作物(小麦、水稻、玉米等)中研究较少。在西芹
(Petroselinum crispum L.)中研究表明, CPRF2是一个
受光诱导的蛋白[25]; 在烟草中它能控制花器官的大
小[26]。本研究证实 Ta24695 参与植物抗光氧化胁迫
过程, 表明 Ta24695 是与植物抗逆相关的基因, 这
与前人在拟南芥中对 bZIP蛋白功能研究结果类似。
Ta27787 (TaMYB1)属于 R2R3-MYB转录因子。
Chen等[27]研究发现, 渗透胁迫 8 h后, TaMYB1在根
中下调表达 ; 而 Lee 等 [28]试验表明 , 在渗透胁迫
18 h 后, TaMYB1 在根中略微上调表达, 而在胁迫
36 h 后则下调表达, 并且受盐胁迫和在根中缺氧条
件下上调表达。可见, TaMYB1主要参与抵御渗透和
盐等逆境胁迫。本研究也有类似结果, TaMYB1参与
由低温、DCMU和 H2O2引起的光氧化胁迫抗性的调
节。有报道指出, 植物中 MYB转录因子具有高度保
守的 DNA 结合域[29], 因此我们推测这可能是它们
功能上具有相似性的原因。前人对 TaMYB1 在植物
抗逆方面的研究大多停留在 mRNA 水平变化上, 在
生物学功能的验证以及可能作用机理方面的研究未
见报道。
Ta92165编码一个 GRAS转录因子, GRAS蛋白
主要参与调节植物生长发育以及植物抗盐、干旱和
抗真菌等胁迫。拟南芥中与 Ta92165 同源的基因为
AtSCL14, 该基因突变后导致植株变得矮小, 另外它
受渗透和干旱胁迫诱导[30]。类似地, 我们也观察到
BSMV:Ta92165小麦植株生长受到严重抑制。Czikkel
等[31]发现, 烟草中与 AtSCL14 同源的基因 NtGRAS1
1912 作 物 学 报 第 40卷


受 H2O2、水杨酸及抗霉素 A等诱导表达, 并且伴随
着活性氧水平的增加。由于细胞膜的完整性会影响
植物体内活性氧水平的清除, 结合 BSMV:Ta92165
小麦叶片细胞膜完整性受损的结果 , 我们推测
Ta92165 在光氧化胁迫抗性调节方面可能与活性氧
水平有关。
4 结论
通过分析 6 个小麦强光响应基因 (Ta23008、
Ta24695、Ta27787、Ta92165、Ta119251和 Ta106078)
在小偃 54植株中沉默或减量表达, 初步认为它们可
能参与小麦抗光氧化过程, 同时 Ta23008、Ta92165、
Ta119251和 Ta106078还表现与小麦生物量积累有关。
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