全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2016, 42(1): 110 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(31471528), 国家博士后基金面上项目(2014M552297)和中央高校基本科研业务费专项资金(SWU113104,
XDJK2014B035, 2362015xk05)资助。
This study was supported by National Natural Science Foundation of China (31471528), Postdoctoral Science Foundation of China
(2014M552297) and Fundamental Research Funds for the Central Universities of China (SWU113104, XDJK2014B035, 2362015xk05).
* 通讯作者(Corresponding authors): 李加纳, E-mail: ljn1950@swu.edu.cn, Tel: 13509496702; 唐益雄, E-mail: yixiongtang@sohu.com, Tel:
010-62121506
第一作者联系方式: E-mail: haidu81@aliyun.com, Tel: 18223480008
Received(收稿日期): 2015-06-08; Accepted(接受日期): 2015-09-06; Published online(网络出版日期): 2015-10-08.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20151008.1403.026.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2016.00001
GmMYB042基因对类黄酮生物合成的调控作用
杜 海 1 冉 凤 1 马珊珊 1 柯蕴倬 1 孙丽萍 1 李加纳 1,* 唐益雄 2,*
1西南大学农学与生物科技学院, 重庆 400715; 2中国农业科学院生物技术研究所, 北京 100081
摘 要: MYB 类转录因子是植物中最大的转录因子基因家族之一, 广泛参与植物生长发育全过程, 对植物次生代谢
等具有重要的调控作用。本研究对大豆 GmMYB042基因的表达特性和功能进行了系统研究, 针对该基因 C端的保守
氨基酸基序(PDLNLELTIS)和锌指结构进行了一系列的序列删除突变, 并将各缺失突变体在烟草中进行了过表达, 以
验证目的基因及其特殊基序的功能。表达特性分析结果表明, GmMYB042 基因在大豆的根瘤、根、茎、叶、花、荚
果皮和种子中均有表达, 且在茎、种子和花中的表达量相对较高; GmMYB042基因在大豆中的表达受 PEG、高盐、低
温和 UV-B辐射的诱导。过表达分析结果表明, GmMYB042基因的过表达使转基因烟草类黄酮代谢途径部分关键酶基
因(如 PAL、CHS和 FLS)的表达量明显上升, 转基因烟草总黄酮的含量明显高于对照; 各缺失突变体的转基因烟草类
黄酮代谢途径相应酶基因的表达量发生了相应的变化, 进一步证明目的基因对类黄酮生物合成的调控作用; 各缺失
突变体的转基因烟草的叶缘有明显皱褶, 说明目的基因可能还参与调控叶的形态建成。
关键词: MYB转录因子; 类黄酮; 缺失突变; 功能研究
Regulating Effects of GmMYB042 Gene on Flavonoid Biosynthesis
DU Hai1, RAN Feng1, MA Shan-Shan1, KE Yun-Zhuo1, SUN Li-Ping1, LI Jia-Na1,*, and TANG Yi-Xiong2,*
1 College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2 Biotechnology Research Institute, Chinese Academy of
Agricultural Sciences, Beijing 100081, China
Abstract: MYB transcription factor is one of the largest transcription factor gene families in land plants, and is involved in a
myriad of regulatory processes, such as secondary metabolism. In the present study, the expression profiles and function of
GmMYB042 gene were systematically studied. In order to investigate the roles of the conserved amino acid motif PDLNLELTIS
and a predicted zinc finger region at its C-terminal, a series of sequence deletions of these two regions were made by PCR method.
Subsequently, the corresponding over-expression constructs of GmMYB042 gene and its mutants were made and transformed into
tobacco NC89 with Agrobacterium LBA4404, respectively. Expression analyses revealed that GmMYB042 gene was expressed in
nodule, root, stem, leaf, flower, pod, and seed of soybean, and with a relative higher expression level in stem, flower, and seed; its
expression could be induced by PEG, high salt, low temperature, and UV-B radiation stresses. Over-expression analyses showed
that the expressions of some enzyme genes in flavonoid biosynthesis pathway (including PAL, CHS, CHI, and FLS) were
obviously increased in GmMYB042 transgenic lines, resulting in an increased content of the flavonoid compounds. Accordingly,
the transcription levels of the corresponding enzyme genes involved in flavonoid biosynthesis pathway were decreased in the
transgenic lines of GmMYB042 mutants, further supporting the conclusion of regulating role of GmMYB042 gene in tobacco fla-
vonoid biosynthesis pathway.
Keywords: MYB transcription factor; Flavonoid; Deletion mutation; Functional research
2 作 物 学 报 第 42卷


MYB 类转录因子以其 N 端含有的一段保守
DNA 结合域(DNA-binding domain)为共同特征, 广
泛存在于真核生物界, 是植物基因组中最大的转录
因子家族之一[1]。MYB结构域一般由 1~4个串联的、
不完全重复的 MYB重复区域(R1、R2和 R3)组成。
通常根据 MYB 重复区的数量对该类转录因子分类,
如含有 1 个重复区或含 2 个彼此间隔开的 MYB 重
复区的为 MYB-related 类(1R-MYB), 含有 2 个串联
MYB 重复区的为 2R-MYB 类(R2R3-MYB), 含有 3
个串联 MYB 重复区的为 3R-MYB 类 (R1R2R3-
MYB), 含有 4个串联 MYB重复区的则 4R-MYB类
(R1R2R2R1/2-MYB)[2-4]。它们共同组成了植物基因
组中一个庞大的 MYB 转录因子基因家族。其中 ,
2R-MYB 类是植物中数量最多、最为典型的 MYB
类转录因子。MYB转录因子的 C端则为其转录激活
区(Transcription activation domain), 富含酸性氨基
酸, 一般折叠成双亲性的螺旋发挥作用。
首个 MYB 转录因子基因 v-MYB 是从引起禽急
性成髓细胞白血病病毒 AMV 和 E26 (avian mye-
loblastosis virus (AMV))中发现的[1]。随后, v-MYB的
同源基因, A-MYB、B-MYB和 C-MYB在多种脊椎动
物中也相继被鉴定, 并被证实参与调控细胞增殖、
分化和凋零过程[5]。植物中鉴定的第一个 MYB转录
因子基因是参与调控玉米花青素生物合成的 C1 基
因[6]。随后在许多植物基因组中陆续发现了大量的
MYB 基因。例如 , 在拟南芥基因组中就有 126个
2R-MYB基因[7]、大豆基因组中有 255个有完整读码
框的 2R-MYB基因[8]、杨树中则有 191个 2R-MYB基
因[9]等。大量功能研究表明该类转录因子基因广泛
参与植物生长发育全过程, 如次生代谢调控、激素
和环境因子的应答、细胞分化、形态建成等[10-15]。
类黄酮广泛分布于植物界 , 在许多植物组织 ,
如根、叶、花和果实中均有大量分布[16-17]。该类化
合物具有多种生物学功能, 如调节植物生长、参与
植物抗逆胁迫、作为植物抗毒素和活性氧清除剂等。
相关药理和临床实验证实黄酮类化合物具有非常重
要的药理功能 , 是药用植物的主要活性成分之一 ,
对人体健康具有非常重要的影响。如抗癌、抗氧化、
降低胆固醇、抑制和预防冠心病以及其他老年和妇
科疾病等[18-19]。因此, 类黄酮类化合物一直备受人
们的重视, 被认为是一类极富医疗和保健价值的天
然物质, 具有广泛的开发前景。类黄酮是植物苯丙
烷类代谢途径的一类重要次生代谢产物, 其代谢途
径和木质素代谢途径是苯丙烷类代谢途径的两大主
要分支。
近年来研究证实 2R-MYB转录因子广泛参与植
物苯丙烷代谢途径[20-23], 对类黄酮的生物合成有重
要的调控作用 [24-25]。大豆是世界重要的油料作物 ,
也是类黄酮的重要来源。因此, 克隆和鉴定大豆中
调控类黄酮生物合成的 MYB 转录因子基因、研究
它们的调控机理具有重要的学术意义和广阔的应用
前景。本研究在前期研究基础上[26-27], 采用 RT-PCR
技术进一步分析了 GmMYB042 (GmMYBZ2)基因在
大豆不同组织和逆境胁迫下(ABA、PEG、NaCl、低
温等)的表达模式; 基于 PCR技术对该基因C端特殊
的保守氨基酸基序(PDLNLELTIS)和锌指结构进行
了一系列的序列删除突变, 并将各缺失突变体在烟
草中过表达, 以验证它们的功能, 以期能为进一步
阐明该基因调控类黄酮生物合成的分子机制提供实
验证据。
1 材料与方法
1.1 材料、菌株、载体和试剂
烟草品种 NC89、大肠杆菌(E. coli) DH5α、农杆
菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株 LBA4404、植物
表达载体 pCAMBIA2301 均由本实验室保存。植物
总 RNA 提取试剂 TRNzol 购于天根生化科技(北京)
有限公司 ; 反转录试剂盒 (PrimeScript 1st Strand
cDNA Synthesis Kit)和限制性内切酶购于 TaKaRa公
司 ; 质粒提取试剂盒 (EasyPure Plasmid MiniPrep
Kit)、胶回收试剂盒(EasyPure Quick Gel Extraction
Kit), pEASY-T1 Simple载体、普通 Taq酶购于北京
全式金生物技术有限公司; RQ1 RNase-Free DNase
购于美国 Promega公司; 实时荧光定量 PCR试剂盒
(SsoAdvanced Universal超混合液)购自Bio-Rad公司;
大豆苷元(Daidzein)标准品购于中国药品生物制品
检定所; ABA、6-BA、NAA等激素购于 Sigma公司;
卡那霉素、头孢拉定购于 Amersco 公司; X-Gluc 购
于 Inalco公司。其他常规生化试剂均为国产分析纯。
1.2 胁迫处理和表达特性分析
高盐和干旱处理是分别将大豆幼苗置含 300
mmol L–1 NaCl和 10% PEG-8000的 B5液体培养基
中, 室温下分别于 0、6、12、24、48和 72 h时取样。
低温处理是将大豆幼苗置 4℃培养箱中, 分别于 0、
6、12、24、48和 72 h时取样。激素处理是分别将
大豆幼苗置含 100 μmol L–1 ABA、100 μmol L–1 GA3、
第 1期 杜 海等: GmMYB042基因对类黄酮生物合成的调控作用 3


75 μmol L–1 NAA和 75 μmol L–1 6-BA的 B5液体培
养基中, 室温下分别于 0、1、3、6、12和 24 h时取样。
液氮速冻所有样品, 于–80℃超低温冰箱保存备用。
1.2.1 qPCR法分析目的基因的组织表达特性
采用 TRIzol 法分别提取大豆不同组织(根瘤、
根、茎、叶、花和未成熟种子)总 RNA, 经 DNase I
处理去除 RNA 中残留的痕量基因组 DNA, 根据
TaKaRa 公司的反转录试剂盒说明书合成第 1 链
cDNA。使用 SsoAdvanced Universal Mix (SYBR
Green)试剂盒和 Bio-Rad 公司的 CFX96 Touch 荧光
定量 PCR仪进行 Real-time PCR扩增。以反转录获
得的 cDNA为模板, 以大豆泛素基因 Subi-1 (D16248)
为内标基因(UBQ-qF: 5-GACCCTTACGGGTAAGA
CTATTAC-3和 UBQ-qR: 5-GTCCTTCCATCCTCTA
GCTGT-3), 以基因特异引物 MYB042-qF (5-GCAA
CTGCTGCAACTGTTACA-3)和 MYB042-qR (5-CA
AACCCAAACTGCAAACG-3) 进行 Real-time PCR
扩增。采用两步法反应程序, 95℃ 5 min; 95℃ 15 s,
61℃ 20 s, 40个循环; 绘制熔解曲线。设 3 次重复,
取平均值, 采用 2–ΔΔCt 法计算基因在不同样品中的
相对表达量。
1.2.2 RT-PCR 法分析目的基因在胁迫诱导下的表
达特性 同理, 分别提取大豆胁迫和诱导处理材
料的总 RNA, 并反转录合成第 1 链 cDNA。以反转
录获得的 cDNA为模板, 预实验确定RT-PCR指数扩
增循环数, 以保证在此循环数内 PCR 产物呈指数增
长(28 个循环)。以大豆泛素基因 Subi-1 (D16248)为
内标基因(UBQ-F: 5-CTCTGACAGGGAAGACCGT
AAC-3和 UBQ-R: 5-GAGACCGTGCATAGCAAGC
TA-3)对模板进行均一化处理。以基因特异引物
MYB042-F (5-CGGGGAGAACAGACAATGAAATA
AA-3)和 MYB042-R (5-CAAACCCAAACTGCAAA
CGAAAC-3) 进行 PCR扩增, 检测目的基因在不同
组织或胁迫处理下的表达模式。PCR 程序为 94℃
5 min; 94℃ 30 s, 57℃ 30 s, 72℃ 30 s, 28个循环; 72
℃ 10 min, 琼脂糖凝胶电泳法检测 RT-PCR结果。
大豆 RNA-Seq 表达谱数据来源于共享数据[28]
和 SoyBase (http://soybase.org/AffyChip/)[29]。
1.3 植物过表达载体的构建及烟草的遗传转化
前期我们对GmMYB042基因 C端保守的氨基酸
基序和锌指结构进行了一系列的序列删除突变 [28]
(图 1-A), 此基础上, 本研究分别将目的基因及其突
变体序列克隆到植物表达载体 pCAMBIA2301上(前
引物含有 EcoR I酶切位点, 后引物含有 Sal I酶切位
点 ), 构建相应的植物过表达载体 p2301-35S::
GmMYB042, p2301-35S::TB1, p2301-35S::TB2, p2301-
35S::TB3 和 p2301-35S::TB4 (图 1-B)。采用农杆菌
LBA4404 介导法, 将重组质粒和空载体(对照)分别
转入烟草 NC89, 利用 Kan抗性筛选转基因抗性苗。
1.4 转基因烟草的鉴定
挑选生长良好的转基因 Kan 抗性苗, 剪取少许
叶片浸入 GUS 染液进行组织染色(37℃放置过夜),

图 1 GmMYB042基因及其缺失突变体的植物过表达载体的构建示意图
Fig. 1 Sketch map of the overexpression constructs of GmMYB042 gene and its mutants
A: GmMYB042及其相应突变体序列(TB1、TB2、TB3和 TB4)的结构示意图。GmMYB042表示 cDNA全长序列; 斜线方框为保守的
DNA结合域; 黑色方框为保守的氨基酸基序 PDLNLELTIS; 灰色方框为 C端的锌指结构; TB1: 删除 GmMYB042基因 C端锌指结构后
面的序列, 保留锌指结构; TB2: 删除 GmMYB042基因的锌指结构及其后面的序列; TB3: 删除 GmMYB042基因 PDLNLELTIS基序后
面的序列; TB4: 删除 GmMYB042基因 PDLNLELTIS基序及其后面的序列。B: GmMYB042及其相应突变体序列的植物过表达载体的
构建示意图。
A: sketch map of GmMYB042 gene and its mutants. GmMYB042 contained the full length cDNA sequence; Bias in gray indicates the con-
served DNA binding domain; Box in black denotes the conserved amino acid motif PDLNLELTIS; Box in gray represents the zinc finger;
TB1: deletion of the C-terminal domain behind the zinc finger of GmMYB042; TB2: deletion of C-terminal domain withhold the zinc finger of
GmMYB042; TB3: deletion of the C-terminal domain behind the PDLNLELTIS motif of GmMYB042; TB4: deletion of C-terminal domain
withhold the PDLNLELTIS motif of GmMYB042. B: sketch map of the overexpression constructs of GmMYB042 gene and its mutants.
4 作 物 学 报 第 42卷


以 75%乙醇脱色 2~3次(以转空质粒和野生型的烟草
为对照), Nickon SME 1000体视显微镜观察 GUS染
色结果。选择 GUS 染色为阳性的转化植株 , 以
TRIzol法提取叶片总 RNA, 反转录获得的 cDNA为
模板, 利用基因特异引物(MYB042-F和 MYB042-R,
同 1.2)通过 RT-PCR法检测转化苗。进一步经多代扩
繁获得转基因 T3代阳性株系, 并对 T3代转基因植株
和阴性对照(转化空载体)进行表型观察。
1.5 转基因烟草总黄酮含量的测定
1.5.1 标准曲线的建立 大豆苷元标准品和样品
以 50%甲醇为空白, 在紫外分光光度计上 200~700
nm范围内全波段扫描, 以确定标准品的最大吸收波
长。精密称取大豆苷元标准品 2.0 mg置 25 mL容量
瓶中, 以 50%甲醇溶解定容(浓度为 80 μg mL–1); 制
备一系列的标准品溶液(表 1), 在最大波长处以 50%
甲醇为空白测定吸光度值, 以浓度(x)与吸光度(y)进
行线性回归, 求得回归方程及相关系数。
1.5.2 样品的提取 植物材料经液氮中充分研磨
后称取约 0.1 g (3次重复), 按照 0.1 g mL–1鲜重甲醇
的比例加入预冷的色谱纯甲醇, 密闭、避光、超声
波处理 15 min, 7100 × g离心 10 min, 吸取上清液;
0.45 μm微孔膜过滤, 密闭, 4℃保存备用。
1.5.3 样品的测定 吸取 0.5 mL样品转入 15 mL
比色管, 加 5% NaNO2溶液 1 mL, 摇匀, 静置 6 min;
加 5%的 AlCl3溶液 1 mL, 摇匀, 静置 6 min; 再加
4%的 NaOH溶液 5 mL, 用蒸馏水定容至 10 mL, 静
置 15 min。在波长 510 nm处测定吸收值。
1.6 以RT-PCR法分析苯丙烷代谢途径各关键酶
基因的表达量
分别设计类黄酮代谢途径关键酶基因 PAL、
C4H、4CL、CHS、CHI、F3H和 FLS的特异引物(表
2)。提取转基因植株的总 RNA, 反转录获得总 cDNA,
以烟草 Actin基因(X63603)为内标基因, 设计基因特
异引物 N-Act-F和 N-Act-R, 预实验进行模板均一化
处理。以 PCR法检测相关酶基因在转基因烟草中的
表达量(方法同 1.2)。
2 结果与分析
2.1 大豆 GmMYB042基因的表达特性
2.1.1 GmMYB042基因在大豆中的组织表达特性
图 2 表明, 目的基因在大豆的根瘤、根、茎、
叶、花、果荚皮和未成熟种子中均表达。其中, 在
茎中的表达量最高, 比叶和根瘤中的表达量约高 4
倍; 在花和种子中的表达量也较高, 在根瘤和叶中
的表达量则相对较低。

表 1 大豆苷元标准品的制备
Table 1 Preparation of daidzein standards
编号
Number
标准品溶液
Standards (mL)
50%甲醇
50% methanol (mL)
含量
Content (μg mL–1)
1 0 10 0
2 0.625 9.375 5
3 1.25 8.75 10
4 2.5 7.5 20
5 5 5 40
6 10 0 80

表 2 烟草类黄酮合成途径关键酶基因的特异引物
Table 2 Primers of key enzyme genes in flavonoid biosynthesis pathway in tobacco
引物编号
Number of primer
上游引物序列
Forward primer sequence (5–3)
下游引物序列
Reverse primer sequence (5–3)
PAL TGCCAAGCTATAGACTTGAGGCATT CTAACAGATAGGAAGAGGAGCACCATT
4CL TTGCTTTCATTGGTGCATCGTA CCTTTAGGTAATCCAGTCGTCCC
C4H AGCAGAAGGGAGAAATCAACGA TGTTTGCTAGCCACCAAGCAT
CHS GGCAGCCGCGGTCATTATAG GCAACACTGTGGAGAACAACAGTCT
CHI ATATCGTCACAGGTCCCTTTGAG CATGTTTGCCAATTATGGATTCC
F3H CGACTCGTGATGGTGGCA ACTTCTTGAGGCGAGCCAACTC
FLS TGAGGTTGTACCACAAGAGGAGA GTCCTTTGTCACTGTTGTCCTATG
N-Act GGATTCTGGTGATGGTGTTAGCC ACATAGTCGAACCGCCACTGAGTA

第 1期 杜 海等: GmMYB042基因对类黄酮生物合成的调控作用 5



图 2 不同大豆组织器官中 GmMYB042基因的表达量
Fig. 2 Expression pattern of GmMYB042 gene in soybean
F: 花; L: 叶; N: 根瘤; P: 荚果皮; R: 根; S: 未成熟种子;
St: 茎。
F: flower; L: leaf; N: nodule; P: pod; R: root; S: immature seed;
St: stem.

为进一步验证 GmMYB042 基因的表达特性, 我
们还利用 2组公共的大豆 RNA-Seq表达谱数据分析
了目的基因在大豆不同发育时期和组织中的表达模
式。在第 1组转录组表达谱数据中(图 3), 目的基因
在大豆根、茎尖分生组织、荚果皮、花、叶和毛状
根中均有表达, 且在花中的表达量最高。此外, 目的
基因在毛状根中的表达还受到大豆根瘤菌
(Bradyrhizobium japonicum)的诱导(24 h), 说明该基
因可能参与调控大豆根瘤的形成过程。
在第 2组转录组表达谱数据中(图 4), GmMYB042
基因在大豆花、根和荚果皮中均有较高的表达量。
同理, 目的基因在花中的表达水平明显高于其他组
织, 说明该基因可能参与花的发育过程。此外, 目的
基因在种子发育 14~35 d 的表达量比种子发育早期
(10 d)和晚期(42 d)高, 暗示该基因可能与种子发育
中期相关。
综上所述, qPCR法分析的结果与两组转录组数
据的结果一致性较好, 均证明目的基因在大豆花中
有较高的表达量。此外, 本研究还证明目的基因在
大豆茎中的表达水平相对最高, 暗示目的基因可能
还与茎的发育相关。
2.1.2 GmMYB042 基因在紫外和红光诱导下的表达
谱 如图 5所示, 目的基因的表达量随着UV-B辐
射处理时间的增加逐渐增高, 在 3~6 h达到峰值, 此
后又逐渐降低。在受红光诱导时, 则先减小, 后增加,
在 12 h达到峰值。证明目的基因参与了植物对这 2
种光信号的应答反应, 且对 UV-B 的诱导相对更加
敏感。因为类黄酮类化合物在植物中具有抗紫外辐
射的作用, 暗示 GmMYB042 基因可能通过调控类黄
酮类物质的合成来抵御紫外辐射对植物的伤害。
2.1.3 GmMYB042基因受激素和环境因子胁迫诱导的
表达情况 为探究 GmMYB042 基因受激素诱导的
表达情况, 本研究分析了目的基因受 ABA、GA3、NAA
和 6-BA 4种激素诱导的表达模式。结果如图 6-A所示,
4 种激素处理后目的基因的表达量没有发生明显变化,
说明该基因的表达不受这 4种激素的诱导。

图 3 GmMYB042基因在大豆 RNA-Seq数据组 1中的表达模式
Fig. 3 Expression patterns of GmMYB042 gene in soybean in the first RNA-Seq dataset
RH84和 RH120: 播种后 84 h和 120 h的毛状根细胞; N: 根瘤; SAM: 茎尖分生组织; F: 花; GP: 青荚果; L: 叶: R: 根; RT: 根尖:
12HI、24HI和 48HI: 受根瘤菌诱导 12、24和 48 h的毛状根; 24HU: 未受根瘤菌诱导 24 h的毛状根; 48HS: 受根瘤菌诱导 48 h的离
体毛状根。
RH84 and RH120: root hair cells isolated at 84 h and 120 h after sowing; N: nodule; SAM: shoot apical meristem; F: flower; GP: green pod;
L: leaf; R: root; RT: root tip; 12HI, 24HI, and 48HI: root hairs inoculated by B. japonicum for 12, 24, and 48 h, respectively; 24HU: root hairs
not inoculated by B. japonicum for 24 h; 48HS: stripped roots inoculated by B. japonicum for 48 h.
6 作 物 学 报 第 42卷



图 4 GmMYB042基因在大豆 RNA-Seq数据组 2中的表达分析
Fig. 4 Expression profiles of GmMYB042 gene in soybean in the second RNA-Seq dataset
YL: 幼叶; F: 花; P1: 1 cm荚果; P10和 P14: 开花后 10和 14 d的荚果; S10~S42: 开花后 10、14、21、25、28、35、42 d的种子;
R: 根; N: 根瘤。
YL: young leaf; F: flower; P1: one cm pod; P10 and P14: pod shell at 10 and 14 days after flowering; S10–S42: seeds at 10, 14, 21, 25, 28,
35, and 42 days after flowering; R: root; N: nodule.

图 5 GmMYB042基因受 UV-B和红光诱导的表达情况
Fig. 5 Expressions of GmMYB042 gene induced by UV-B and red-light radiation
A: UV-B诱导的表达谱; B: 红光诱导的表达谱; UBQ: 内标基因(D16248)。
A: expression profile induced by UV-B radiation; B: expression induced by red-light radiation; UBQ: the house-keeping gene (D16248).

同理, 本研究还分析了目的基因受高盐、低温
和 PEG 诱导的表达情况。结果如图 6-B 所示 ,
PEG-8000 处理后, 目的基因的表达量在 24 h 最高;
NaCl处理后在 12 h的表达水平相对最高; 低温胁迫
时, 基因的表达水平则在 24 h达到峰值。说明该基
因的表达受到 PEG-8000、NaCl和低温的胁迫诱导。
2.2 以RT-PCR法分析转基因烟草类黄酮合成途
径关键酶基因的表达量
提取转基因烟草阳性苗 T3代叶片的总 RNA, 反
转录合成第 1 链 cDNA, 分别对类黄酮代谢途径各

图 6 GmMYB042基因受激素和非生物胁迫诱导的表达情况
Fig. 6 Expression patterns of GmMYB042 gene induced by phytohormone and abiotic stresses
A和 B分别表示 GmMYB042基因受激素和非生物胁迫诱导的表达情况。
A and B indicate the expression patterns of GmMYB042 under phytohormones and abiotic stresses, respectively.
第 1期 杜 海等: GmMYB042基因对类黄酮生物合成的调控作用 7


关键酶基因的表达量进行 RT-PCR 检测分析(方法同
1.2)。结果如图 7所示, GmMYB042基因的导入明显
提高了转基因烟草中类黄酮生物合成途径 PAL、
CHS、CHI 和 FLS 酶基因的表达量。相反, 苯丙烷
类代谢途径的另一主要支路, 木质素生物合成途径
的 CAD、CAOMT和 OMT酶基因的表达量没有明显
的变化。说明目的基因的导入提高了烟草中类黄酮
代谢途径酶基因的表达量, 进而促进类黄酮化合物
的生物合成。
如图 7 所示, GmMYB042 基因各缺失突变体的
转基因烟草中类黄酮代谢途径各关键酶基因的表达
量则随着其 C 端序列的缩短而逐渐降低, 而木质素
代谢途径相关酶基因的表达量则没有明显变化。进
一步验证目的基因对类黄酮代谢途径 PAL、CHS、
CHI和 FLS酶基因的表达有调控作用。
2.3 转基因烟草总黄酮含量的测定
对转 GmMYB042 基因烟草的 4 个株系(MYB042-
2、MYB042-5、MYB042-16 和 MYB042-17)和对照
NC89进行总黄酮含量的测定。每个株系测定 3个植

图 7 GmMYB42基因及其 C端缺失突变体的转基因烟草的类黄
酮代谢途径酶基因的表达量
Fig. 7 Expressions of flavonoid biosynthetic enzyme genes in
transgenic tobacco lines of GmMYB042 gene and its C-terminal
mutations
MYB042: p2301-35S::GmMYB042转基因株系; TB1:
p2301-35S::TB1转基因株系; TB2: p2301-35S::TB2转基因株系;
TB3: p2301-35S::TB3转基因株系; TB4: p2301-35S::TB4转基因
株系。
MYB042: p2301-35S::GmMYB042 transgenic line; TB1:
p2301-35S::TB1 transgenic line; TB2: p2301-35S::TB2 transgenic
line; TB3: p2301-35S::TB3 transgenic line; TB4: p2301-35S::TB4
transgenic line.
株, 每株重复测 3 次。方差分析结果表明处理间差
异显著(结果未显示)。进一步利用 LSD 法进行多重
比较分析表明, MYB042-16 株系与对照总黄酮的含
量差异显著; 其他 3 个株系虽然与对照差异不显著,
但也有明显提高(表 3)。说明转基因植株的总黄酮含
量均有提高, 进一步证明目的基因可能参与调控烟
草中类黄酮的生物合成。

表 3 GmMYB042转基因烟草总黄酮含量的多重比较分析
Table 3 Multiple comparison analysis of flavonoids in
GmMYB042 transgenic lines
处理
Treatment
3次重复的平均值
Mean value of three times (μg g–1)
方差
Variance (μg)
MYB042-16 949.04 614.86**
MYB042-5 514.07 179.89
MYB042-17 491.34 157.16
MYB042-2 376.72 42.54
NC89 (CK) 334.18 —
**表示在 1%水平上差异显著。
** Significant difference at the 1% probability level.

2.4 转基因烟草的表型观察
将转基因烟草阳性苗及对照植株经炼苗后移栽到
花盆中种植, 定期观察其表型。结果发现 GmMYB042
基因及其突变体 TB1 的转基因植株与对照 NC89 的
表型没有明显差异。但是 TB2~TB4突变体的转基因
植株的表型与对照 NC89有明显的差异(图 8-A)。这
3个突变体的转基因烟草均表现为节间增长、叶片变
小、叶缘有明显的皱褶(图 8-B), 暗示目的基因可能
还参与叶的形态建成。
3 讨论
MYB转录因子基因在植物基因组数量庞大, 是
植物中最大的转录因子家族之一。虽然目前已有很
多 MYB 基因的功能已被证明, 如参与次生代谢调
控、激素和环境胁迫的应答、器官发育等[6-15], 但是
这些研究进展主要集中在模式植物拟南芥中。拟南
芥是研究基因功能的重要模式植物, 但是农艺性状
差, 其研究结果的应用价值有限。相对于拟南芥, 在
具有重要农艺性状的农作物中开展相关基因的挖掘
和功能研究, 不仅具有重要的理论意义, 还具有重
要的应用前景。类黄酮类化合物广泛分布于豆科植
物中, 具有非常重要的医疗和保健价值[16-19]。大豆
是人类食物和类黄酮的主要来源, 因此挖掘和研究
大豆中调控类黄酮生物合成的 MYB转录因子基因、
明确其功能, 可以为分子育种提高大豆类黄酮的含
8 作 物 学 报 第 42卷



图 8 GmMYB042基因及其 C端突变体转基因烟草的表型
Fig. 8 Phenotypic traits of transgenic tobacco lines of GmMYB042 gene and its C-terminal mutations
A和 B分别表示 GmMYB042基因及其 C端突变体转基因烟草植株和叶片的表型。
A and B indicate the plants and leaves phenotypic traits of transgenic tobacco lines of GmMYB042 gene and its C-terminal mutants, respectively.

量提供重要的基因资源和理论参考。鉴于此, 本研
究对从大豆中克隆得到的GmMYB042基因在类黄酮
生物合成的调控作用进行了系统的研究。
目前, 绝大多数的 MYB 转录因子被证实在植
物生长发育过程中起转录激活作用, 但也有少数起
转录抑制作用。例如, 矮牵牛中的 AmMYB308 基因
抑制 C4H、4CL 和 CAD 基因的表达[30], 拟南芥的
AtMYB4 基因抑制 C4H 基因的表达[31]等。前期, 我
们对 MYB 基因家族在陆生植物中分子进化机制的
系统研究发现, 该类基因属于一个在进化过程保守
的 S4亚家族。序列分析发现这类基因的 C端均有一
个保守氨基酸基序 pdLNLD/ELXiG/S 和一个锌指结
构[32], 推测它们可能与该类基因的转录抑制作用有
关。GmMYB042基因也属于 S4亚家族, 其 C端同样
含有一个保守的氨基酸基序 PDLNLELTIS和锌指结
构(图 1-A)。鉴于此, 我们前期基于 PCR技术对目的
基因的这两个结构域进行了序列删除突变(图 1-A),
并通过酵母单杂交实验证明了该基序对目的蛋白的
转录激活活性具有抑制作用[28]。为了进一步证实该
基序的功能, 本研究在模式植物烟草中过表达了目
的基因及其相应的缺失突变体序列。结果发现 ,
GmMYB042 基因及其突变体的过表达植株中类黄酮
合成途径的 PAL、CHS、CHI、FLS基因的表达量有
明显的变化(图 7); GmMYB042转基因植株的总黄酮
含量明显高于对照植株。上述研究结果说明
GmMYB042 基因对类黄酮的生物合成具有正调控作
用。因此, 我们推测 GmMYB042 基因可能是通过抑
制苯丙烷类代谢途径中类黄酮代谢途径的竞争性分
支(共用同一代谢底物, 如木质素代谢途径)相关酶
基因的表达以提高类黄酮合成支路的代谢流量, 进
而增加类黄酮的生物合成; 当 GmMYB042蛋白因 C
端缺失 PDLNLELTIS 基序后, 其抑制作用降低, 代
谢能量重新流向类黄酮合成途径的竞争性分支, 进
而导致类黄酮代谢途径相关酶基因的表达量随之降
低(图 7)。以上结果为我们后续深入挖掘 GmMYB042
基因调控的下游靶基因, 利用定点突变技术研究该
基序在目的蛋白抑制其下游靶基因表达的过程中的
分子作用机制奠定了理论依据。
此外, 近年来有研究发现植物 MYB 转录因子
广泛参与植物对激素和抗逆胁迫的应答过程[10-15]。
因此, 为了解析 GmMYB042 基因在大豆抗逆胁迫过
程中的作用, 本研究还分析了目的基因在大豆中受
激素和环境因子诱导的表达情况。结果证明
GmMYB042基因的表达没有明显受到 ABA、GA3、
BA 和 NAA 的诱导, 说明其不依赖于这 4 种激素的
信号转导途径(图 6-A); 但是其表达明显受到 PEG、
高盐、低温和 UV-B 辐射的诱导(图 5 和图 6-B), 说
明该基因可能参与植物的抗逆胁迫应答过程。本研
究结果还表明GmMYB042基因的导入使烟草的叶形
发生了明显的变化, 证明目的基因可能还参与调控
植株叶的形态建成(图 8)。本研究的相关工作主要是
在模式植物烟草中完成的, 目的基因在大豆中的功
能还有待我们进一步在大豆加以验证和解析。
4 结论
GmMYB042 基因在茎、花等组织中优势表达 ,
而且其表达受 PEG、高盐、低温和 UV-B 的胁迫诱
导, 证明该基因可能参与调控植物对这些环境因子
的应答过程。GmMYB042 基因及其突变序列的过表
达明显影响转基因烟草中类黄酮合成途径酶基因的
第 1期 杜 海等: GmMYB042基因对类黄酮生物合成的调控作用 9


表达量 , 且明显提高了转基因烟草总黄酮的含量 ,
证明该基因参与调控类黄酮的生物合成; 该基因 C
端保守氨基酸基序和锌指结构对其功能具有转录抑
制作用, 影响其对类黄酮生物合成的调控作用。
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