全 文 :作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(8): 1409−1415 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家高技术研究发展计划(863 计划)项目(2011AA10A100), 国家科技支撑计划项目(2011BAD35B02-05)和重庆市攻关项目
(CSTC, 2012ggc8002)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 何光华, E-mail: hegh@swu.edu.cn
第一作者联系方式: E-mail: zhuxiaoyans@sina.com
Received(收稿日期): 2012-11-15; Accepted(接受日期): 2013-03-22; Published online(网络出版日期): 2013-04-23.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20130423.1333.007.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.01409
水稻叶脉白化突变体 wpsm的遗传分析与基因定位
朱小燕 徐芳芳 桑贤春 蒋钰东 代高猛 王 楠 张长伟 何光华*
西南大学水稻研究所 / 转基因植物与安全控制重庆市市级重点实验室 / 南方山地农业教育部工程研究中心, 重庆 400716
摘 要: 叶绿素是植物生长发育必不可缺的元件。叶色突变体的发掘与研究在叶绿体发育、叶绿素代谢、光合作用
等研究中具有重要作用。利用化学诱变剂 EMS诱变水稻(Oryza sativa L.)籼型恢复系缙恢 10号, 从其后代中筛选出
一份突变性状稳定遗传的叶脉白化突变体 wpsm (white primary and secondary midrib)。与野生型相比, 该突变体苗期
表现正常, 孕穗后期剑叶、倒二叶、倒三叶整张叶片的主叶脉和次级叶脉白化, 叶肉细胞无显著变化, 该性状一直持
续到成熟期。抽穗期突变体 wpsm 的光合色素含量极显著低于野生型, 净光合速率(Pn)及表观电子传递速率(ETR)极
显著降低, 株高、每穗实粒数、千粒重、结实率等农艺性状均显著降低。该突变性状受一对隐性核基因调控。利用
892株西农 1A/wpsm的 F2隐性定位群体, 将该基因定位在第 6染色体上引物 InDel 10与 InDel 4之间, 遗传距离分别
为 0.06 cM和 0.12 cM, 物理距离约为 56 kb。本研究为 WPSM基因的克隆和功能研究奠定了基础。
关键词: 水稻(Oryza sativa L.); 叶脉; 白化; 基因定位
Genetic Analysis and Gene Mapping of a Rice White Midrib Mutant wpsm
ZHU Xiao-Yan, XU Fang-Fang, SANG Xian-Chun, JIANG Yu-Dong, DAI Gao-Meng, WANG Nan, ZHANG
Chang-Wei, and HE Guang-Hua*
Rice Research Institute of Southwest University / Chongqing Key Laboratory of Application and Safety Control of Genetically Modified Crops /
Engineering Research Center of South Upland Agriculture, Ministry of Education, Chongqing 400716, China
Abstract: A white midrib mutant temparily designated as wpsm (white primary and secondary midrib) was screened out in the
progeny of an excellent indica restorer line Jinhui 10 with seeds treated by ethyl methane sulfonate (EMS). The wpsm mutant
displayed normal leaves during the seedling stage. In the late booting stage, the primary and secondary midrib of the first, second
and third leaves of the wpsm mutant showed a bleached appearance, compared with those of the wild type, while mesophyll cells
kept normal. This mutational character was maintained to maturity. The photosynthetic pigment of the wpsm was significantly
lower than that of the wild type, so were Pn and ETR. Agronomic traits such as plant height, filled grain number per panicle, seed
setting rate and 1000-grain weight were significantly decreased when compared with the wild type. Genetic analysis suggested
that the mutational characters were controlled by a single recessive nuclear gene. Xinong 1A was crossed with the wpsm, 892
recessive mutants from the F2 segregation population were used for gene mapping. WPSM was mapped on chromosome 6, be-
tween InDel 10 and InDel 4, with physical distance of about 56 kb. This result provides a foundation for WPSM gene cloning by
map-based strategy as well as its functional analysis.
Keywords: Oryza sativa L.; Midrib; White; Gene mapping
叶片是植物进行光合作用的重要器官。叶片的
颜色、形态、结构不同程度地影响植物光合作用进
而影响植株生长、发育及繁殖过程。叶色突变是自
然界中常见的突变性状之一。由于叶色突变往往直
接或间接影响叶绿素代谢途径, 故叶色突变又被称
为叶绿素缺陷突变。叶色突变体是研究高等植物光
合作用机制、叶绿素代谢途径、叶绿体结构与功能
的理想材料, 叶色突变基因的克隆及功能研究已成
1410 作 物 学 报 第 39卷
为研究热点[1-5]。水稻不仅是世界上最重要的粮食作
物之一, 也是重要的单子叶模式植物。目前, 国内外
针对自然诱变或物理化学诱变的水稻叶色突变体进
行了大量研究, 筛选到大量水稻叶色突变体, 并克
隆了数个叶色突变相关基因。对这些基因功能的深
入研究有助于揭示叶绿体发育调控机制及指导生产
实践。
叶脉白化是一类比较少见的叶色突变性状。
已发现的叶脉白化突变体有 : virescent-1(v1) [6-8]、
wp(t) [9]、Oswm [10]和 Oswm2 [11]。v1突变体苗期表现
叶脉、叶肉完全白化, 随后叶片逐渐恢复成淡绿色,
成熟植株叶片中脉及穗白化, v1 编码一个定位于叶
绿体的蛋白 NUS1。NUS1 参与调控叶绿体 RNA 代
谢, 冷胁迫条件下, 在早期叶绿体发育过程中促进
质体遗传系统的建立。wp(t)突变体植株基部少数叶
片中脉呈现白色, 成熟植株的穗呈白色, wp(t)基因
被定位于第 1 染色体 SSR 标记 SSR101 和 SSR63.9
之间[9]。李娜等[10]将白色中脉基因 OWSM定位在第
4 染色体 CH413 和 CH415 之间约 122 kb 范围内,
oswm突变性状主要表现为叶的近轴面中脉白化, 叶
远轴面及其他部位表现正常。胡景涛等[11]将白色中
脉突变体基因 OWSM2 定位在第 7 染色体 SSR标记
RM21478 和 RM418 之间, 遗传距离分别为 8.7 cM
和 15.9 cM, oswm2突变体主要表现为剑叶以下叶片
的中下部中脉白色 , 且白色中脉附近叶片为淡
黄色。
本研究利用 EMS 诱变水稻籼型恢复系缙恢 10
号, 从其后代中筛选出一份稳定遗传的叶脉白化突
变体, 暂命名为 wpsm (white primary and secondary
midrib)。与野生型相比, 该突变体苗期表型正常, 孕
穗后期的剑叶、倒二叶、倒三叶整张叶片的主叶脉
及次级叶脉白化 , 而叶肉细胞未发生明显变化。
wpsm 的突变性状与目前已报道的叶色突变性状均
不相同, 可能是一份新的叶色突变材料, 本文报道
了其遗传分析和基因定位研究结果。
1 材料与方法
1.1 试验材料
于西南大学水稻研究所连续种植 wpsm 多代 ,
突变性状稳定遗传。利用 892株西农 1A/wpsm的 F2
隐性分离群体进行遗传分析和基因定位。
1.2 农艺性状考查
成熟期, 分别从缙恢 10 号和 wpsm 种植小区中
随机选择长势相对一致的单株各 10株, 考查株高、
有效穗、每穗粒数、每穗实粒数、千粒重、结实率
等主要农艺性状, 重复 3次。
1.3 测定光合色素含量、光合特性及叶绿素荧光
动力学参数
抽穗期上午 9:00, 分别从缙恢 10 号和 wpsm 种
植小区中随机选择长势相对一致的单株各 5 株, 参
考 Wellburn[12]的方法测定全展剑叶中部的光合色素
含量。称取 0.1 g叶片细丝装入离心管中, 加入 25 mL
丙酮与无水乙醇 (1∶1, V/V)的混合液封口并置暗
处浸提 , 经常摇动 , 直到叶丝完全变白为止 , 重复
3次。
在抽穗期, 随机选取长势相对一致的单株各 5
株, 利用 LI-6400 型便携式光合作用测定仪在天气
晴朗的上午 8:30开始测定剑叶的光合特性、叶绿素
荧光动力学参数, 重复 3次, 取平均值。叶绿素荧光
动力学参数包括初始荧光(Fo)、PSII最大光能转化效
率(Fv/Fm)、非光化学淬灭系数(qN)、表观光合电子传
递速率(ETR)[35]。Fv/Fm=(Fm−Fo)/Fm, qN=(Fm−Fm)/Fm,
ETR = ΦPSII×PAR×0.84×0.5。
1.4 基因定位
利用BSA法筛选连锁标记[13], 从 F2植株中分别
选取 10 株正常株和 10 株突变株剪取等量叶片, 采
用改良的 CTAB法提取 DNA, 构建正常基因池和突
变基因池用于筛选连锁标记。采用改良 CTAB 法提
取 F2隐性定位群体突变单株的基因组 DNA 用于连
锁分析[14]。
参照 http://www.gramene.org/设计 SSR 引物序
列。根据西农 1A与缙恢 10号的差异序列设计 InDel
引物。PCR反应总体积为 25 μL, 包括 2.5 μL 10×PCR
buffer, 2.0 μL 2.5 mmol L–1 dNTPs, 2.0 μL 10 μmol
L–1引物, 2.0 μL模板 DNA, 0.2 μL 5 U μL–1 Easy Taq
DNA聚合酶和 16.3 μL ddH2O。PCR反应程序为 94℃
预变性 5 min; 94℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 30 s, 35
个循环; 72℃延伸 10 min。将 PCR 产物在 10%非
变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离 , 快速银染后观
察[15]。
1.5 遗传图谱的构建
选取西农 1A/wpsm F2群体中的隐性叶脉白化突
变单株为作图群体。将具有西农 1A带型的单株记为
A, 具有 wpsm带型的单株记为 B, 具有 F1带型的单
株记为 H, 用 Mapmaker3.0 分析数据和作图[16], 用
Kosambi函数将重组率转化为遗传距离[17]。
第 8期 朱小燕等: 水稻叶脉白化突变体 wpsm的遗传分析与基因定位 1411
2 结果与分析
2.1 叶脉白化突变体 wpsm的表型分析
野生型缙恢10号在整个生育期所有叶片的叶脉和
叶肉均保持正常, wpsm突变体在孕穗后期表现出叶
脉白化性状, 该性状一直持续到成熟期。苗期 wpsm
与野生型相比无明显差异, 到孕穗后期 wpsm剑叶、
倒二叶、倒三叶整张叶片主叶脉、次级叶脉白化, 而
叶肉细胞无明显变化, 其他性状未发生显著变化(图
1)。该突变令 wpsm除有效穗和每穗粒数外的其他农
艺性状如株高、每穗实粒数、结实率、千粒重显著
图 1 孕穗后期突变体 wpsm和野生型(WT)的表型特征
Fig. 1 Plant morphology of the wild type (WT) and the wpsm
mutant at the late booting stage
A: 野生型(WT)和突变体 wpsm的植株; B: 野生型(WT)和突变体
wpsm的剑叶。
A: plants of the wild type and the wpsm mutant; B: the first fully
expanded leaf of the wild type and the wpsm mutant.
下降, 其中, 每穗实粒数降低了 36.2%, 结实率仅为
野生型的 69.0%, 而千粒重下降幅度不大, 仅减少
了 1.876 g (表 1)。
2.2 光合色素含量、光合特性及叶绿素荧光动力
学参数
叶色突变往往直接或间接影响叶绿素代谢途径,
为了进一步研究突变体光合色素含量的变化, 测定
和比较了抽穗期野生型和突变体剑叶的光合色素含
量。结果表明, 突变体剑叶的光合色素含量均极显
著低于野生型对照, 其中叶绿素 a (Chl a)含量是野
生型的 92.36%, 叶绿素 b (Chl b)含量是野生型的
87.87%, 总叶绿素(Total Chl)含量占野生型的 91.51%,
类胡萝卜素(Car)含量仅为野生型的 57.71% (表 2)。
抽穗期野生型和突变体剑叶的光合特性比较表
明(表 3), 突变体wpsm的净光合速率(Pn)极显著低于
野生型, 而气孔导度(Gs)、细胞间 CO2浓度(Ci)、蒸
腾速率(Ti)均极显著高于野生型。光合色素是植物进
行光合作用的必要条件, wpsm光合色素均显著降低
可能是导致净光合速率降低 , 引起光合作用原料
CO2、H2O积累, 从而最终导致细胞间 CO2浓度及蒸
腾速率升高的主要原因。
表 4表明, 与野生型相比, 突变体 wpsm的初始
荧光(Fo)、PSII最大光能转化效率(Fv/Fm)均升高, 但
不显著, 非光化学猝灭效率(qN)显著高于野生型, 表
观光合电子传递速率(ETR)极显著降低 , 仅占野生
型的 40.78%。表明突变体 PSII光能固定率升高, 光
能转化效率升高, 但其吸收的光能大部分以热形式
散失导致其光能利用率较低。
表 1 野生型(WT)和突变体(wpsm)农艺性状分析
Table 1 Agronomic trait of the wild type (WT) and the wpsm mutant
材料
Material
株高
Plant height
(cm)
有效穗
Effective
panicle
每穗粒数
Grain number
per panicle
每穗实粒数
Filled grain
number per
panicle
结实率
Seed setting rate
(%)
千粒重
1000-grain
weight
(g)
WT 115.32±4.24 7.33±1.97 174.77±9.80 155.60±8.99 89.01±0.78 26.52±0.12
wpsm 107.22±9.82* 7.60±2.19 161.09±12.47 99.14±18.18** 61.55±9.85** 24.64±0.18**
*在 0.05水平上差异显著; **在 0.01水平上差异显著。
* Significant difference at P<0.05 by t-test; ** Significant difference at P<0.01 by t-test.
表 2 野生型(WT)和突变体 wpsm叶片光合色素含量
Table 2 Content of various photosynthetic pigments in leaves of the mutant and the wild type (mg g−1 FW)
材料
Material
叶绿素 a
Chl a content
叶绿素 b
Chl b content
总叶绿素
Total Chl content
胡萝卜素
Car content
WT 3.3065±0.2618 0.7838±0.0634 4.0902±0.3241 1.8889±0.1011
wpsm 3.0541±0.2236** 0.6887±0.0934** 3.7428±0.3049** 1.0921±0.0858**
*在 0.05水平上差异显著; **在 0.01水平上差异显著。
* Significant difference at P<0.05 by t-test; ** Significant difference at P<0.01 by t-test.
1412 作 物 学 报 第 39卷
表 3 野生型(WT)与突变体(wpsm)叶片的光合特性
Table 3 Photosynthetic characteristics of mutant and the wild type
材料
Material
净光合速率
Pn
(μmol CO2 m–2 s–1)
气孔导度
Gs
(mol H2O m–2 s–1)
细胞间 CO2浓度
Ci
(μmol CO2 m–2 s–1)
蒸腾速率
Ti
(mol H2O m–2 s–1)
WT 15.849±1.3838 0.9201±0.0753 322.0117±7.8655 5.2743±0.3643
wpsm 9.8231±2.0728** 1.8967±0.9976** 337.6714±3.9715** 8.7081±1.1276**
*在 0.05水平上差异显著; **在 0.01水平上差异显著。
* Significant difference at P<0.05 by t-test; ** Significant difference at P<0.01 by t-test.
表 4 野生型(WT)与突变体(wpsm)叶片的叶绿素荧光动力学参数
Table 4 Chlorophyll fluorescence kinetic parameters of the wpsm mutant and the wild tpye
材料
Material
初始荧光
Fo
PSII最大光能转化效率
Fv/Fm
非光化学猝灭系数
qN
表观光合电子传递速率
ETR
WT 84.38±33.16 0.816±0.016 1.810±0.0668 106.499±16.411
wpsm 119.25±29.99 0.824±0.013 2.781±0.2010** 43.227±0.982**
*在 0.05水平上差异显著; **在 0.01水平上差异显著。
* Significant difference at P<0.05 by t-test; ** Significant difference at P<0.01 by t-test.
2.3 遗传分析
西农 1A 与突变体 wpsm 杂交的 F1植株表型正
常, F2群体出现分离, 从 3651株 F2代单株中获得 892
株突变体单株 , 正常株 (2759)∶突变株 (892)符合
3∶1 分离比[χ2=0.606<3.84 (χ2(0.05,1))], 表明该突变
性状受一对隐性核基因控制。
2.4 分子定位
利用平均分布在 12 条染色体上的 400 对 SSR
引物扩增西农 1A 和 wpsm, 96 对引物表现出多态
性。其中, RM253、RM5850 在正常基因池和突变
基因池之间表现出差异 , 推测可能与 wpsm 位点
连锁。用 F2定位群体中的 72 株突变单株验证表明,
2 个标记与目的基因连锁 , 并将 WPSM 定位在
RM253和 RM5850之间, 遗传距离分别为 13.80 cM
和 5.55 cM。
在标记 RM253 和 RM5850 之间合成 7 对 SSR
引物和 11对 InDel引物, 其中 4对 SSR引物和 8对
InDel引物在两亲本之间表现多态性。利用 817株隐
性定位群体, 最终把 WPSM 基因定位在 InDel 10
(5-CGCTAGCTTGAACCAACGAAC, 5-CCCGGGT
TCAAGATAGTGTAT)和 InDel 4 (5-GTAACCATA
TAGGACTAG, 5-CTCCTATGTCGGATGGCTTGC)
之间, 遗传距离分别为 0.06 cM和 0.12 cM, 物理距
离约为 56 kb (图 2)。该定位区间内的 13个注释基因
(表 5)包含 3 个假定蛋白、4 个逆转座子蛋白、1 个
信号识别颗粒蛋白、1个核糖核苷二磷酸还原酶小亚
基、1 个类 GDSL 脂酶、2 个 C3HC4 锌指蛋白和 1
个 ODORANT1蛋白。
图 2 WPSM基因在第 6染色体上连锁图谱
Fig. 2 Linkage map of WPSM on chromosome 6 of rice
第 8期 朱小燕等: 水稻叶脉白化突变体 wpsm的遗传分析与基因定位 1413
表 5 定位区间内基因及预测功能
Table 5 Genes and their putative functions in the target region
基因名称
Gene names
推测功能
Putative functions
LOC_Os06g14550 Signal recognition particle 9 kDa protein, putative, expressed
LOC_Os06g14560 Hypothetical protein
LOC_Os06g14570 Retrotransposon protein, putative, Ty3-gypsy subclass
LOC_Os06g14580 Hypothetical protein
LOC_Os06g14590 Retrotransposon protein, putative, Ty3-gypsy subclass
LOC_Os06g14600 Retrotransposon protein, putative, Ty3-gypsy subclass
LOC_Os06g14610 Ransposon protein, putative, Ty3-gypsy subclass
LOC_Os06g14620 Ribonucleoside diphosphate reductase small chain, putative, expressed
LOC_Os06g14630 GDSL-like lipase/acylhydrolase, putative, expressed
LOC_Os06g14640 Zinc finger, C3HC4 type domain containing protein
LOC_Os06g14650 Zinc finger, C3HC4 type domain containing protein
LOC_Os06g14660 Hypothetical protein
LOC_Os06g14670 ODORANT1, putative, expressed
3 讨论
叶绿素是植物进行光合作用的必要条件, 叶绿
素吸收的光能可经光合作用最终转化成可利用的化
学能贮存在有机物中, 叶绿素生物合成及降解途径
是一个相当复杂的过程, 目前已经克隆的水稻叶色
突变相关基因直接或间接影响叶绿素代谢途径。白
化突变体基因 OsCHLH [18]、Chlorina-1、Chlorina-9 [19]
分别编码镁-螯合酶 H亚基、D亚基和 I亚基; 黄绿
叶突变体基因 ygl1编码叶绿素合成酶[20]; OsCAo1和
OsCAo2 [21]编码叶绿素 a氧化酶; OsRPoTP [22]编码
叶绿体 RNA 聚合酶; 常绿基因 SGR [23]编码叶绿体
转运肽蛋白; 温度敏感型淡绿色突变体基因 V2编码
鸟苷酸激酶(pt/mt GK)[24]; 温控淡绿色突变体基因
V3 和条斑突变体基因 St1 分别编码核糖核苷二磷酸
还原酶大亚基(RNRL1)和小亚基(RNRS1) [25]。其中
V2、V3 和 St1 独立于叶绿素代谢途径之外, 它们调
控叶色变化的机制尚不明确。
造成突变体光合色素含量异常的原因主要是其
叶绿素合成途径受阻 (如 ygl1 [20]、 chlorina-1、
chlorina-9 [19]等)或叶绿素降解途径受阻(如 sgr [23]、
nycl [26]等)。本研究中, 叶脉白化基因 WPSM突变可
能影响叶绿素代谢途径, 造成突变体光合色素含量
极显著降低, 导致 wpsm净光合速率极显著降低。初
始荧光(Fo)反映了 PSII 反应中心完全开放时即原初
电子受体 QA全部氧化时的荧光水平[27-28,34]; PSII最
大光能转化效率(Fv/Fm)反映了 PSII潜在活性[29]; 非
光化学猝灭系数(qN)是指 PSII 天线色素吸收的光能
不能用于光合电子传递而以热形式耗散掉的光能部
分, 它是一种自我保护机制, 对光合系统具有一定
的保护作用 [30]; 表观电子传递速率(ETR)反映出在
实际光强条件下, 植物光合电子传递速率[31]。本研
究中 wpsm 的 Fo、Fv/Fm及 qN高于对照, 而 ETR 极
显著降低。因此, 我们推测, 突变体 PSII 反应中心
叶绿素捕获并转化的光能大部分以热形式损失, 致
使可用于暗反应中光合碳同化的能量大幅度减少 ,
碳同化的转运和光合产物的积累受到抑制。这也可
能是突变体净光合速率、农艺性状低于野生型的原
因之一。
目前已报道的 4个叶脉白化突变体(v1、wp(t)、
oswm和 oswm2), 均属于中脉白化突变体, 即仅在主
叶脉处白化, 其他部分正常, 而 wpsm 与它们不同,
除中脉白化外, 次级叶脉也褪绿白化。上述 4个叶脉
白化基因已被定位, v1位于第 3染色体, wp(t)位于第
1染色体, oswm位于第 4染色体, oswm2位于第 7染
色体, 第 6染色体上并未发现叶脉白化基因。在第 6
染色体上已定位了 st1 [25]、gws [32]及 st(t) [33] 3个白条
纹突变体, 其中 st1与 gws是等位突变体, 编码核糖
核苷二磷酸还原酶小亚基。Yoo 等[25]认为叶片核糖
核苷二磷酸还原酶小亚基突变, 导致核糖核苷二磷
酸还原酶活性不足, 质体DNA合成受阻以优先保证
核基因组复制顺利进行满足植株正常生长需要。st1
受温度控制, 20℃或 30℃条件下严重褪绿白化, 白
天 30℃、夜晚 20℃交替条件下表现为无规则白条
纹。gws也是低温敏感型条纹突变体, 于二叶期后即
表现出白条纹; 22℃环境时, 苗期叶片白化; 提高苗
1414 作 物 学 报 第 39卷
期生长温度, 突变体叶片逐渐变绿。桑贤春等[33]报道
的条斑突变体 st(t)在三叶期时即出现条斑性状, 该
突变体也可能受温度影响, 苗期严重白化, 随后逐
渐复绿, 呈现不规则白条纹。本研究所报道的叶脉
白化突变体定位区间与上述 3 个白纹突变体相同,
但突变性状与之不同, 在苗期 wpsm 叶片并无任何
变化, 到孕穗后期, wpsm 剑叶、倒二叶、倒三叶整
个叶片主叶脉及次级叶脉白化, 而叶肉细胞未发生
明显变化, 表明 wpsm 突变位点可能仅影响维管细
胞叶绿体发育或功能。
4 结论
从 EMS 诱变缙恢 10 号后代中筛选到一份孕穗
后期功能叶主叶脉和次级叶脉白化, 叶肉细胞无变
化的叶脉白化突变体 wpsm。与野生型相比, wpsm光
合色素含量显著降低, 净光合速率降低, 表观光合
电子传递速率显著降低, 农艺性状变差。该突变性
状受一对隐性核基因控制。该基因被定位在第 6 染
色体 InDel 10和 InDel 4之间, 遗传距离分别为 0.06
cM和 0.12 cM, 物理距离约为 56 kb。
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