全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2016, 42(8): 12531258 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由高等学校博士学科点专项科研基金项目(20120204110033)和旱区作物逆境生物学国家重点实验室基金项目(CSBAA2015007)资助。
This study was supported by the Projects for Doctoral Research Funding in Higher Education Institutions Function and Structure of Dehydrin
Protein in Different Water Content (20120204110033) and the Foundation of State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas of
Northwest A&F University (CSBAA2015007).
* 通讯作者(Corresponding author): 张林生, E-mail: linszhang@nwsuaf.edu.cn, Tel: 029-87092379
第一作者联系方式: E-mail: qiangsir0934@qq.com
Received(收稿日期): 2016-01-23; Accepted(接受日期): 2016-05-09; Published online(网络出版日期): 2016-06-02.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160602.1442.010.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2016.01253
小麦 wzy2-1基因的克隆及功能分析
强治全 1 梁雅珺 1 于正阳 1 杜 娅 1 张 帅 1 朱维宁 2 张林生 1,*
1西北农林科技大学生命科学学院 / 旱区作物逆境生物学国家重点实验室, 陕西杨凌 712100; 2西北大学生命科学学院, 陕西西安
710069
摘 要: 脱水素是一类植物胚胎发育后期丰富蛋白(late embryogenesis abundant protein, LEA蛋白), 属于 LEA D-11家族,
植物受非生物胁迫会大量表达。利用同源克隆技术, 从郑引 1号小麦中克隆了 1个 Kn型脱水素基因, 命名为 wzy2-1。
该基因全长 1740 bp, 编码 579个氨基酸, 含有 9个保守的 K片段, 与大麦的 Dhn5基因具有较高同源性。生物信息学预
测该蛋白属于高度亲水性的无序蛋白。通过该蛋白对大肠杆菌的保护作用研究表明, WZY2-1蛋白能够提高大肠杆菌对
低温、高温、高盐以及高渗胁迫的耐受性。荧光实时定量 PCR分析表明, wzy2-1基因受低温、盐渍、干旱诱导表达, 但
不受外源 ABA诱导, 说明 wzy2-1基因属于非 ABA依赖型脱水素基因。
关键词: 小麦; 脱水素; 荧光实时定量 PCR; 原核表达
Cloning and Functional Analysis of wzy2-1 Gene in Wheat
QIANG Zhi-Quan1, LIANG Ya-Jun1, YU Zheng-Yang1, DU Ya1, ZHANG Shuai1, ZHU Wei-Ning2, and
ZHANG Lin-Sheng1,*
1 College of Life Science / State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas, Northwest A&F University, Yangling 712100, China;
2 College of Life Science, Northwest University, Xi’an 710069, China
Abstract: Dehydrins (DHNs) are identified as the group II of LEA proteins and involved in plant abiotic stress tolerance. In this
study, we isolated a novel Kn-type dehydrin gene from wheat cultivar Zhengyin 1, which was designated wzy2-1. The full length
of wzy2-1 is 1740 bp, encoding 579 amino acids and containing nine conserved K-fragments. Sequence alignment indicated that
wzy2-1 had high homology to Dhn5 gene in Hordeum vulgare. The WZY2-1 protein was predicted to be a highly-hydrophilic and
disordered protein. The WZY2-1 protein was successfully expressed in E. coli strain BL21 (DE3). We found that WZY2-1 protein
improved the tolerance to low or high temperature, salt and osmotic stresses in E. coli. The qRT-PCR assay indicated that the ex-
pression of wzy2-1 gene was induced by low temperature, PEG, and salt stresses rather than ABA. Thus, we conclude that wzy2-1
is an ABA-independent gene.
Keywords: Wheat; Dehydrins; Real-time PCR; Procaryotic expression
植物赖以生存的环境并不总是适合植物生长。干旱、
盐渍、低温、高温等都会影响植物生长发育, 严重时会导
致植物死亡。为了适应各种逆境胁迫, 植物在进化过程中,
已经形成了多种生理生化机制, 以抵御不利环境因素, 通
常在逆境胁迫下, 植物会积累一系列逆境相关蛋白, 如胚
胎发育后期丰富蛋白(late embryogenesis abundant protein,
LEA)、分子伴侣、解毒酶等[1]。其中, LEA蛋白对提高植
物的逆境胁迫耐受性具有非常重要的作用。
LEA 蛋白是胚胎发生后期大量积累的一类蛋白, 最
早发现于胚胎发育后期的棉花子叶中[2]。LEA蛋白的共同
特点是含有大量极性氨基酸 , 其中赖氨酸和甘氨酸含量
最高, 具有较强的亲水性和热稳定性[3]。LEA蛋白是一大
类逆境响应蛋白, 根据 LEA 蛋白氨基酸序列的同源性分
为 6个家族, 即 LEA-D19 (1族)、LEA-D11 (2族, 又称脱
水素)、LEA-D7 (3族)、LEA-D113 (4族)、LEA-D29 (5族)
和 LEA-D95 (6族), 后两族为附加族[4]。
1254 作 物 学 报 第 42卷


脱水素属于 LEA2家族, 是目前研究较为深入的一类
LEA 蛋白[5], 根据脱水素保守序列, 可以分为 YnSKm、
Kn、KnS、SKn 和 YnKm 共 5 个亚类。该类蛋白的特点
是含有 3个保守的区域, 分别是 K、Y和 S片段。其中, K
片段富含赖氨酸, 是所有脱水素共有的, 一般由 15个氨
基酸残基组成(EKKGIMDKIKEKLPG)[6]; K片段可以形成
两亲性的 α-螺旋, 在植物失水情况下, 两亲性的 α-螺旋可
以保持细胞膜和细胞内蛋白的稳定性[7]。S片段是一段富
含丝氨酸的保守序列(SSSSSS), 可被磷酸化, 并可能与脱
水素的入核有关[8-9]。Y片段的保守序列为(VT)DEYGNP,
但目前尚不清楚其功能。除了这 3个保守的序列外, 脱水
素还有另外一些保守区域, 这些区域富含极性氨基酸, 称
作Φ片段, 通常分布于K片段之间, 可能与参与细胞质组
分的相互作用有关[10]。
近些年对于脱水素的研究有了许多重要发现。将小麦
DHN5 (YSK2)转入大肠杆菌中, 发现 DHN5 可以提高大
肠杆菌的耐逆性, 这可能与 DHN5 可以防止大肠杆菌体
内的蛋白聚集有关, 并且发现 DHN5 能够保护 LDH 酶和
葡萄糖苷酶的活性[11-12]。通过对小麦 WZY2 和 DHN5 K
片段的缺失, 发现 K 片段在提高大肠杆菌耐逆性和 LDH
等酶活保护中起着最主要的作用[13]。当植物遭受低温、
干旱、盐渍等逆境时, 体内会大量积累脱水素蛋白, 例如,
小麦 WCOR410[14]、拟南芥 COR15[15]、马铃薯 CI7[16]均
可响应低温胁迫; 大麦 DHN5可以响应干旱、低温和盐渍
胁迫[17]; 对辣椒的 CaDHN1研究表明, CaDHN1可以响应
低温、盐和水杨酸胁迫, 但不响应 ABA 诱导[18]。本研究
通过同源克隆, 从郑引 1 号小麦中成功克隆了小麦 Kn 型
脱水素基因 wzy2-1, 对其进行生物信息学分析, 并且研究
了不同胁迫下的 wzy2-1 表达模式以及 WZY2-1 蛋白对大
肠杆菌的保护作用。
1 材料与方法
1.1 植物材料和胁迫处理
小麦品种郑引 1号, 由西北农林科技大学生命科学学
院中心实验室提供。将小麦种子经 75%酒精消毒 2 min,
蒸馏水浸泡 6 h, 置培养皿中培养。培养条件为光/暗 16 h/
8 h, 昼/夜温度 25℃/19℃。当小麦长到二叶一心期时, 分
别进行干旱(10%的 PEG-6000)、低温(4℃培养箱)、盐(500
mmol L–1 NaCl溶液)和外源 ABA (100 μmol L–1ABA溶液)
处理。在处理 0、12、24、36、48和 60 h取样, 液氮速冻
后保存于–80℃。
1.2 小麦 RNA的提取及反转录合成 cDNA
取干旱处理 2 d 小麦叶片 , 在液氮中研磨 , 按照
TRIzol 试剂 (Invitrogen)的操作说明 , 提取小麦幼苗总
RNA。以提取的 RNA 为模板 , 按照反转录试剂盒
PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (TaKaRa)的
操作说明反转录成 cDNA。
1.3 目的基因全长 cDNA克隆
根据大麦 DNH5 (GenBank 登录号为 AF181455)的
cDNA 序列设计引物 (F1: 5′-ATGCACGACGCCGAC-3′;
R1: 5′-TTAGTTCAGTCCAGGC-3′), 以小麦 cDNA为模板
进行 PCR 扩增。反应体系 20 L, 包含 2×Taq PCR Su-
permix (全式金公司) 8 μL, cDNA模板 1 μL, 上、下游引
物各 1 μL, ddH2O 9 μL。PCR反应参数为 94℃预变性 5 min;
94℃ 30 s, 63℃ 30 s, 72℃ 1 min, 35个循环; 72℃ 10
min。将扩增产物回收(天根公司), 连接到 pMD18-T载体上,
转化 TOP10感受态细胞, 涂板, 挑单克隆, 菌液 PCR检测,
送 3个阳性菌落到上海生工生物工程有限公司测序。
1.4 目的基因的生物信息学分析
利用DNAMAN分析wzy2-1基因序列及蛋白序列; 通
过 Blast, 利用 MEGA5.0 对 wzy2-1 进行同源性分析。利
用 ExPAsy 软件(http://web.expasy.org/protscale/)对 WZY2-
1 蛋白进行疏水性预测; 利用 Metaprediction 软件(http://
iimcb.genesilico.pl/metadisorder/metadisorder.html)对 WZY2-1
蛋白无序化程度进行分析[13,19]。
1.5 目的基因的原核表达及 Western blot验证
设计含有 Xho I 和 BamH I 酶切位点的引物 (F:
5′-CGCGGATCCATGCACGACGCCGAC-3′; R: 5′-CCGCT
CGAGTTAGTTCAGTCCAGGC-3′), 以 pMD18-T-wzy2-1
质粒为模板进行 PCR 扩增 , 回收产物 , 然后对产物和
pET28a质粒酶切。酶切体系 20 L, 含 PCR产物或 pET28a
质粒 10 μL, Xho I 1 μL, BamH I 1 μL, 10×K buffer 2 μL,
ddH2O 6 μL。将酶切产物进行胶回收, 再将回收的 PCR
产物和 pET28a质粒进行 16℃连接, 转化 TOP10感受态细
胞, 涂板, 挑单克隆, 双酶切检测, 选 3 个阳性菌落送生
工生物工程(上海)股份有限公司测序。
将构建好的原核表达载体 pET28a-wzy2-1转入大肠杆
菌 BL21 (DE3), 经 0.2 mmol L–1 IPTG诱导 0、2、4、6、8
h, 收集 3 mL菌体, 10 000×g离心 2 min, 加入 1 mol L–1
Tris-HCl 100 μL和 2×蛋白 loading buffer 100 μL, 在沸水
浴中煮 10 min, 冰上冷却, 10 000×g离心 10 min, 取上清
液 10 μL进行 SDS-PAGE检测, 并且用 K片段抗体进一步
验证[20-21]。
1.6 WZY2-1蛋白对大肠杆菌的耐逆性实验
将转 pET28a-wzy2-1 和 pET28a 空载体的大肠杆菌
BL21 (DE3)接种到 50 mL液体 LB中, 于 37℃摇床培养至
OD值为 0.6, 再加入 0.2 mmol L–1 IPTG诱导 2 h。取该诱
导菌液 1 mL, 加入含 10% PEG-6000、500 mmol L–1 NaCl
或 500 mmol L–1 KCl的 50 mL液体 LB中, 测定波长 600
nm下每小时的菌液 OD值, 以无处理的菌液作对照。
采用涂板技术法进行目的基因表达蛋白对大肠杆菌
的温度耐逆性分析。对 IPTG诱导 2 h的重组菌和空菌进
行 45℃ 30 min或者20℃ 2 h的处理, 然后稀释 1000倍,
于 37℃过夜, 统计菌落数, 以无胁迫处理作对照, 计算菌
存活率[11,22]。
第 8期 强治全等: 小麦 wzy2-1基因的克隆及功能分析 1255


1.7 不同胁迫处理的实时定量 PCR分析
提取不同处理的小麦样品 RNA, 以小麦 β-actin
(KC775780.1)为内参基因进行定量 RT-PCR分析。引物序
列为 wzy2-1-F: 5′-CGGAGTGACCGATAAGG-3′, wzy2-1-
R: 5′-TGCCAGTTGTTTCGTTGT-3′; actin-F: 5′-TCCAATC
TAGGGATACACGC-3′, actin-R: 5′-TCTTCATTAGATTAT
CCGTGAGGTC-3′。反应体系 25 μL, 包括 2×SYBR Premix
12.5 μL, 模板 2 μL, 上、下游引物各 1 μL。反应程序为
95℃预变性 30 s, 然后 95℃ 5 s, 55℃, 20 s, 39个循环。
2 结果与分析
2.1 目的基因的克隆
以干旱处理 24 h 的小麦 RNA 为模板, 反转录得到
cDNA, 利用合成的特异引物 F1/R1 扩增得到 1740 bp 的
产物。回收该产物, 并连接到 pMD18-T载体上, 转入大肠
杆菌 TOP10 中。通过对阳性菌落测序, 得到完整开放阅
读框序列, 定名为 wzy2-1基因, 提交到 GenBank, 登录号
为 KU230444。
2.2 wzy2-1基因的生物信息学分析
利用 DNAMAN 软件分析表明, wzy2-1 编码产物由
579个氨基酸组成, 其分子量约为 60.3 kD, 等电点为 5.8;
该蛋白含有 9个保守的 K片段基序, 属于典型的 Kn型脱
水素(图 1)。利用 MEGA5.0 构建了 wzy2-1 基因的系统进
化树, 发现 wzy2-1和大麦的脱水素基因 Dhn5具有较高的
同源性(图 2)。利用 ExPAsy 软件(http://web.expasy.org/
protscale/)分析表明, WZY2-1蛋白平均疏水系数为–1.307
(图 3), 具有较强的亲水性。用 Metprediction (http://iimcb.
genesiico.pl/metadisorder/metadisorder.html)软件分析表明,
WZY2-1 蛋白是无序状蛋白 (图 4)。以上结果显示 ,
WZY2-1 蛋白在生理条件下是一种高度亲水性的无序蛋
白, WZY2-1蛋白属于 IDPs家族。
2.3 wzy2-1基因的原核表达以及Western blot验证
构建了 pET28a-wzy2-1原核表达载体, 并用 0.2 mmol
L–1 IPTG 诱导重组菌 BL21 (DE3), 通过对热溶性蛋白
SDS-PAGE电泳检测, 发现在 100 kD附近有一条带, 比预

图 1 wzy2-1基因编码的氨基酸序列
Fig. 1 Amino acid sequence of wzy2-1 gene
下画线表示保守的 K片段。
Conserved sequences of K fragment are underlined.

图 2 小麦 wzy2-1基因编码区与多种植物脱水素基因的遗传进
化树
Fig. 2 Phylogenetic tree of wzy2-1 and other dehydrin genes
from different plant species
DHN5: 大麦; DHN4: 伞穗山羊草; DHN: 高粱; WCS66: 小麦;
ESI18-2: 长穗偃麦草; WSC120: 小麦; DHN3: 伞穗山羊草;
WZY2-1: 小麦; Rab 16B-Like: 短花药野生稻; DHN1: 雀稗
COR39: 小麦; SPV462: 高粱。
DHN5: Hordeum vulgare; DHN4: Aegilops umbellulata; DHN:
Sorghum bicolor; WCS66: Triticum aestivum; ESI18-2: Lophopy-
rum elongatum; WCS120: Triticum aestivum; DHN3: Aegilops
umbellulata; WZY2-1: Triticum aestivum; Rab 16B-Like: Oryza
brachyantha; DHN1: Paspalum quadrifarium; COR39: Triticum
aestivum; SPV462: Sorghum bicolor.

图 3 WZY2-1蛋白的疏水性预测
Fig. 3 Hydrophobicity prediction of WZY2-1 protein

图 4 WZY2-1蛋白无序化程度预测
Fig. 4 Disorder prediction of WZY2-1 protein
1256 作 物 学 报 第 42卷


测的结果偏大, 这可能是 K 片段与蛋白胶的特殊作用导
致电泳条带略滞后移。Western blot 验证结果显示, 该条
带是 WZY2-1重组蛋白(图 5)。

图 5 用 K片段抗体进行 Western blot验证
Fig. 5 Western blot with K-fragment antibody

2.4 WZY2-1蛋白对大肠杆菌的耐逆性
在正常条件下, 重组菌和对照菌生长情况基本一致,
但在 10% PEG-6000、500 mmol L–1 NaCl和 500 mmol L–1
KCl 处理后, 重组菌表现出较好的生长趋势(图 6), 说明
WZY2-1蛋白能够提高大肠杆菌对逆境胁迫的耐受性。分
别将对照菌和重组菌进行 45℃ 30 min和20℃ 2 h处理,
结果表明, 重组菌的存活率显著高于对照菌(图 7), 说明
重组菌对温度胁迫有较高的耐受性。

图 6 不同处理条件下重组菌(wzy2-1)和对照菌(Epet)的生长
曲线
Fig.6 Growth of recombinant (wzy2-1) and control E. coli
(Epet) under different treatments

2.5 不同胁迫处理下 wzy2-1表达的定量 RT-PCR分析
在冷胁迫处理下, wzy2-1基因表达量在 12 h达到最高,
为对照的 30倍; 在盐胁迫处理下, wzy2-1基因的表达量在
36 h达到最高, 是对照的 30倍; 然而在干旱胁迫下, 直到
48 h wzy2-1的表达量才达到峰值, 是对照的 8倍(图 8)。
同时还发现, 在 ABA 处理条件下, wzy2-1 基因表达量在
60 h内没有明显上调的趋势(图 8)。推测 wzy2-1基因属于
非 ABA依赖型的冷、渗透、干旱响应的脱水素基因。
3 讨论
植物在生长过程中会产生一系列应对非生物胁迫的

图 7 重组菌(wzy2-1)和对照菌(Epet)在经 45℃ 30 min和20℃
2 h处理后的存活率
Fig. 7 Survival rate of recombinants (wzy2-1) and control E.
coli (Epet) under 45 C for 30 min and 20C for 2 h conditions
柱状图上星号表示重组菌(wzy2-1)和对照菌(Epet)存活率的差异
显著性(*, P<0.05; **, P<0.01)。
Different asterisk on top of bars indicate the significant differences
of the survival rate between recombinants (wzy2-1) and control
E. coli (Epet) (*, P<0.05; **, P<0.01).

图 8 不同胁迫处理下小麦叶片 wzy2-1基因的表达模式
Fig. 8 Transcript accumulation of wzy2-1 in wheat leaves in
response to different abiotic stresses as determined by qRT-PCR

机制 , 像上调某些基因的表达以适应外界多变的环境。
LEA蛋白就是其中之一, 它能够提高植物对干旱、盐渍、
低温等逆境胁迫的耐受性。脱水素具有的 K 片段能形成
A2 型双亲性 α-螺旋, 能与囊泡膜、酸性磷脂、磷脂双分
子层结合, 提高细胞膜的稳定性, 提高植物对不利环境的
耐受性[24-26]。小麦 wzy2-1基因含有 9个保守的 K片段, 分
子量为 60.3 kD, 等电点为 5.8, 属于 Kn 型酸性脱水素。
具有较强的亲水性和高度的无序化 , 这种高度亲水性的
无序蛋白在细胞失水情况下表达 , 对于细胞水分子有较
强的束缚能力 , 以利保护细胞免于逆境下过度失水而发
生膜的损伤[27]。
研究表明, 脱水素可能具有分子伴侣、防冻剂、离子
缓冲剂、膜的稳定剂、抗氧化剂等功能[21]。本实验结果
表明, WZY2-1蛋白能够提高大肠杆菌对低温、高温、高
盐以及高渗胁迫的耐受性(图 6 和图 7), 脱水素能够提高
大肠杆菌对逆境胁迫的耐受性 , 这为后续转基因相关研
第 8期 强治全等: 小麦 wzy2-1基因的克隆及功能分析 1257


究奠定了基础。
植物响应非生物胁迫依赖于一系列的信号途径 , 包
括 ABA依赖型和非 ABA依赖型[23,28-29]。在本研究中, 低
温、干旱、盐渍胁迫处理诱导 wzy2-1 基因上调表达, 但
是基因对各胁迫处理的敏感程度不尽相同。低温胁迫 12 h
wzy2-1 基因表达至峰值, 而盐胁迫 36 h 基因表达才到峰
值; 干旱胁迫 48 h, 基因表达量比对照上调 8倍, 与低温
和盐胁迫上调 wzy2-1 表达量 30 倍有较大差距。可见 ,
wzy2-1对各种胁迫的敏感程度为低温>盐渍>干旱。这与以
前报道结果相似, 即 Kn型脱水素主要响应低温胁迫[17,30]。
ABA处理 60 h未引起wzy2-1基因表达量明显变化(图 8), 因
此我们认为, wzy2-1可能属于非 ABA依赖型脱水素基因。
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