全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(3): 423430 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(30871471), 河北省自然科学基金项目(C2011205085), 河北省自然科学基金基地项目(08B019)和河北
师范大学博士基金(L2005B20)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 赵宝存, E-mail: baocunzh@126.com, Tel: 0311-80787526
第一作者联系方式: E-mail: linfangfang1227@163.com
Received(收稿日期): 2012-07-09; Accepted(接受日期): 2012-11-16; Published online(网络出版日期): 2013-01-04.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20130104.1734.013.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.00423
利用分裂泛素酵母双杂交技术钓取小麦 TaSC互作蛋白质
蔺芳芳 杨 旭 武小翠 刘晓梅 葛荣朝 赵宝存*
河北师范大学生命科学学院, 河北石家庄 050024
摘 要: TaSC (Triticum asetivum L. salt-tolerance related gene, GenBank 登录号为 AY956330)是从小麦耐盐突变体
RH8706-49中克隆的高盐诱导表达的耐盐相关基因。以该基因编码的蛋白质 TaSC为诱饵, 运用分裂泛素酵母双杂交技
术从小麦 cDNA 表达文库中钓取互作蛋白质 , 筛选到一个编码小麦未知功能蛋白质的基因 (GenBank 登录号为
AK336035), 命名为 TaSCIP1 (TaSC interaction protein 1)。双分子荧光互补(BiFC)实验证实 TaSCIP1与 TaSC存在互作。
该互作蛋白的分离有利于进一步研究 TaSC基因的耐盐机制。
关键词: TaSC; 小麦; cDNA表达文库; 分裂泛素酵母双杂交; 双分子荧光互补技术
Fishing TaSC Interacting Protein in Wheat Using Split Ubiquitin Yeast Two
Hybrid System
LIN Fang-Fang, YANG Xu, WU Xiao-Cui, LIU Xiao-Mei, GE Rong-Chao, and ZHAO Bao-Cun*
College of Life Science, Hebei Normal University, Shijiazhuang 050024, China
Abstract: The TaSC (Triticum asetivum L. salt-tolerance related gene, GenBank accession number AY956330) has been cloned
from wheat salt tolerant mutant RH 8706-49, which is induced by high salinity. To fish interacting proteins of this gene, we used
TaSC protein as bait to hybrid with the wheat cDNA expression library using the split ubiquitin yeast two hybrid system in this
experiment. A novel wheat gene (GenBank accession number AK336035) encoding a protein with unknown function was isolated,
which was designated TaSCIP1 (TaSC interaction protein 1). Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) experiment con-
firmed the interaction between proteins TaSCIP1 and TaSC. The separation of TaSC-interacting protein is beneficial to disclose
the mechanism of salt tolerance gene TaSC.
Keywords: TaSC; Triticum asetivum L.; cDNA expression library; Split ubiquitin yeast two-hybrid system; BiFC
近年来, 植物抗逆, 尤其是耐盐分子机制已成
为一个研究热点。在盐胁迫下, Na+通过离子运输进
入植物体后, 当 Na+/Ca2+比值超过 0.11 时, Na+会置
换膜系统中的 Ca2+, 破坏膜系统, 使膜丧失选择性,
从而使细胞内的大量元素外流[1]。研究表明, 质膜及
膜蛋白在逆境胁迫过程中对外部信号的传输及维持
离子平衡和调节渗透压起着非常重要的作用 [2]。
PMP3 (plasma membrane protein 3)是一类小分子疏
水性多肽, 玉米中多个 ZmPMP3 可以在逆境条件下
保持膜电位, 又可以调节细胞内的离子平衡, 从而
显著提高植株的耐盐性[3]。在拟南芥中编码液泡膜
Na+/H+逆向转运蛋白的 AtNHX1 基因在小麦、番茄以
及油菜中过表达, 均可提高转基因植株的耐盐性[4]。
在盐胁迫下, 拟南芥中位于细胞质膜上的 Na+/H+反
转运蛋白 SOS1与RCD1相互作用, 调节活性氧的积
累, 从而应对盐胁迫[5]。蛋白质互作是提高植物抗性
的重要方式。Sade等[6]发现烟草水通道蛋白 NtAQP1
的二聚体可以提高植物逆境下的水利用效率 , Giri
等[7]发现水稻胁迫相关蛋白 OsSAP11 和类受体激酶
OsRLCK253 的相互作用提高了转基因拟南芥的耐
盐性和水利用效率[7]。
应用分裂泛素酵母双杂交系统是研究膜蛋白质
424 作 物 学 报 第 39卷

相互作用的重要方法。泛素在一个细胞内分段表达
后能重组表现出野生型泛素的结构与功能, 同时泛
素水解酶能够识别并切割完整泛素分子和蛋白质复
合物, 使其恢复成单个分子; 当将 Nub (泛素的 N端
片段)中第 3位的异亮氨酸用甘氨酸代替后, NubI就
突变为 NubG, 失去与 Cub (泛素 C端片段)的结合能
力 , 二者不能主动形成具有正常功能的泛素分子 ,
但当二者之间的空间距离被拉近时, 可以恢复泛素
的功能。因此, 先将转录因子与 Cub连接在一起, 之
后将不同蛋白质分别与 Cub和 NubG形成融合蛋白,
若 2 个蛋白能够相互作用, 则使 NubG 和 Cub 相互
靠近并发生部分重构, 被 UBPs识别并切割, 切割后
转录因子成为单体进入细胞核, 从而激活报告基因
令其表达[8]。目前, 分裂泛素酵母双杂交系统已成功
用于分析膜蛋白的互作, 证实了植物蔗糖转运蛋白之
间[9]及 TOM1 与 TOM1 跨膜蛋白之间的相互作用[10],
并用该系统成功地从人类 cDNA 表达文库中筛选出
与人类 ERB3 [11]和 BAP31 [12]蛋白质互作的蛋白质。
但是酵母双杂交技术本身容易出现假阳性结果 ,
因此需要进一步验证, 具有可视化的 BiFC 技术成
为首选[13]。
RH8706-49是本研究室培育的耐盐突变体, 是经
花药愈伤组织EMS诱变得到的, 已经稳定遗传 15年,
耐盐指数≥1.3 [14], 从中已克隆了多个耐盐相关基因,
其中之一就是 TaSC (Triticum asetivum L. salt-tole-
rance releted gene, GenBank登录号为 AY956330)。
TaSC蛋白被定位在细胞质膜上, 过表达该基因可以
提高转基因拟南芥在盐胁迫下的萌发率、幼苗生长
量和整株耐盐性, 而且可以挽救拟南芥同源基因突变
体的敏盐性, 因此推测 TaSC基因与耐盐密切相关[15]。
鉴于该基因是个膜蛋白, 我们推测其功能可能与信
号传导有关, 而信号传导往往伴随着分子之间的相
互作用。为了进一步研究 TaSC基因的作用机制, 我
们以 TaSC蛋白为诱饵蛋白, 运用分裂泛素系统的酵
母双杂交技术从小麦 cDNA 表达文库中筛选到一个
编码小麦未知功能蛋白的基因(GenBank 登录号为
AK336035), 命名为 TaSCIP1; 经 BiFC实验验证, 二
者存在相互作用。
1 材料与方法
1.1 试验材料
小麦(Triticum aestivum L.)耐盐突变体 RH8706-
49 及普通烟草 (Nicotiana tabacum L.)小叶烟草
(Nicotiana benthamiana)的种子 , 均由本实验室保
存。分裂泛素酵母双杂交试剂盒及酵母 (Saccharo-
myces cevevisiae)菌株 NMY51 购自 MoBiTec 公司
(Göttingen, Germany)。BiFC 载体质粒 pSPYCE 和
pSPYNE由河北师范大学孙颖教授惠赠。
1.2 小麦 cDNA表达文库的构建
将 RH8706-49 幼苗水培至二叶一心时以 170
mmol L−1 NaCl处理, 从处理后 72 h的根中, 用 Easy
Clone cDNA Library Construction Kit (Dualsystem
Biotech), 按说明书方法提取总 RNA。利用 SMART
(Switching Mechanism at 5′ End of RNA Template)技
术进行反转录, 再以 sscDNA 为模板进行 RT-PCR,
扩增得到 dscDNA, 对扩增产物进行 Sfi I 酶切并纯
化, 将纯化后 dscDNA 产物和 pPR3-N 质粒的 Sfi I
酶切产物连接, 转化大肠杆菌, 所得阳性克隆即为
cDNA 表达文库。用于反转录的 SMART 和锚定引
物分别是 PlugOligo-3M (5′-AAGCAGTGGTATCAA
CGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGGGG-3′)和 CDS-
3M adapter (5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGG
GCCGAGGCGGCC(T20)-3′); RT-PCR 的引物为 Pri-
mer M1 (5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′)。
1.3 酵母双杂交
1.3.1 pBT3-N-TaSC 诱饵载体构建及转化酵母
为了在 TaSC 基因两端加上酶切位点, 以含有 TaSC
基因的 pMD18-T-TaSC 载体为模板, 以带有 Sfi I酶
切位点的序列 BTaSC-S (5′-GGCCATTACGGCCAT
GGAGAACCTGGCGATGCTGTG-3′)和 BTaSC-A (5′-
GGCCGAGGCGGCCTTAATCCTCGGTGTGGCAC
GTCC-3′)为引物, 用高保真DNA聚合酶 PrimeSTAR
(TaKaRa)进行 PCR扩增。产物回收加 A后与 T载体
连接 , 转化大肠杆菌 , 酶切鉴定并测序 , 将测序正
确的克隆载体用 Sfi I 酶切, 分离酶切得到的目的片
段和 Sfi I酶切的 pBT3-N载体片段连接。连接产物
转化大肠杆菌, 筛选阳性克隆进行酶切鉴定, 鉴定
正确后用 PEG/LiAc方法转化酵母菌株 NMY51。
1.3.2 诱饵蛋白的自激活鉴定 将质粒组合
pBT3-N-TaSC/pOst-NubI和 pBT3-N-TaSC/pPR3-N分
别共转化酵母菌NMY51, 将转化混合物分别涂布在
SD/–Trp–Leu平板上, 生长 2~3 d。得到阳性克隆后
将单克隆接种到二缺(SD/–Trp–Leu)液体培养基中摇
培过夜, 将菌液在分别含 0、5、7.5和 10 mmol L−1 3-
氨基-1,2,4-三唑(3-AT)的三缺培养基(SD/–Trp–Leu–
His)上画线, 30℃培养 2 d后观察。
1.3.3 酵母双杂交及初步鉴定 将小麦 cDNA表
第 3期 蔺芳芳等: 利用分裂泛素酵母双杂交技术钓取小麦 TaSC互作蛋白质 425


达文库质粒与诱饵 pBT3-N-TaSC质粒分别提取后共
同转化酵母菌 NMY51, 将转化产物涂在 SD–Trp–
Leu–His +10 mmol L−1 3-AT的培养基上, 用封口膜封
板后于 30℃培养 4 d, 观察菌落生长情况, 将画线 3
次仍能在四缺培养基上正常生长并具有-半乳糖苷
酶活性的克隆确定为阳性克隆。从阳性酵母菌菌落
中提取质粒回转大肠杆菌后提取 Prey质粒后再次与
pBT3-N-TaSC共同转化NMY51酵母菌, 进行双杂交,
用四缺培养基(SD/–Trp–Leu–His–Ade+10mmol L−1 3-
AT)鉴定杂交结果。从四缺培养基上生长的阳性菌落
中分离互作基因。
1.4 BiFC互补实验
将分别含有不含终止密码子序列的 TaSC 基因
与钓到的 TaSCIP1 基因的中间载体分别用 BamH I
和 Kpn I及 BamH I和 Xba I进行双酶切, 得到二者
去掉终止密码子的开放阅读框 (ORF)序列。将
TaSCIP1基因的 ORF序列(381 bp)插入到 BiFC载体
的 pSPYCE 中构建融合表达载体 pSPYCE-TaSCIP1,
酶切鉴定融合正确的载体转化农杆菌 GV3101 感受
态, 从农杆菌转化子中提取质粒并回转大肠杆菌后
提取质粒, 进行酶切鉴定。同理, 将 TaSC 基因的
ORF序列(423 bp)插入载体 pSPYNE质粒中, 构建融
合表达载体及转化农杆菌和鉴定。将连接正确的克
隆分别命名为 pSPYNE-TaSC和 pSPYCE-TaSCIP1, 并
转化农杆菌, 鉴定正确的农杆菌菌株用于 BiFC实验。
参考Walter等[16]的方法进行BiFC互补实验, 略
有改动。将含 pSPYNE-TaSC和 pSPYCE-TaSCIP1重
组载体的农杆菌分别培养 24 h, 各取 1 mL菌液离心
收集菌体, 重悬菌体后将二者混合并用注射缓冲液
悬浮稀释至 1 mL, 再次离心并洗涤, 重复 2 次。最
后用注射缓冲液稀释成 A600为 0.5 的菌悬液。将生
长 28 d的烟草从培养室中取出, 放在白光灯下培养
1 h, 使叶片的气孔完全张开, 选取幼嫩但完全伸展
的叶片, 用去除针头的注射器将农杆菌悬浮液缓慢
注射入叶片中, 之后移回培养室继续培养 40~48 h,
剪下转化的叶片在激光共聚焦显微镜下观察荧光。
为了排除假阳性, 以多组不同质粒组合做对照, 其
中 pSPYNE/pSPYCE 做空载对照 , pSPYNE-TaSC/
pSPYCE 及 pSPYCE-TaSCIP1/pSPYNE 做阴性对照,
操作方法同上。
2 结果与分析
2.1 小麦 cDNA表达文库构建
小麦根部总 RNA 的甲醛变性胶电泳结果显示,
RNA 完整性好, 无 DNA 及蛋白质污染, 满足构建
cNDA文库的要求(图 1-A)。反转录后 PCR扩增、酶
切并纯化的 dscDNA 在 1.0%琼脂糖凝胶中呈 smear
条带, 在 750~5000 bp之间分布比较集中, 适合用来
构建 cDNA文库(图 1-B)。将 cDNA和 pPR3-N载体
的 Sfi I酶切产物(图 1-C)回收后进行连接, 转化大肠
杆菌 , 得到大量转化子(图 1-D), 说明转化效率较
高。4 次重复实验共获得阳性克隆约 6000 个, 构成
cDNA表达文库。



图 1 小麦 cDNA表达文库构建
Fig. 1 Construction process of cDNA expression library in
wheat
A: 小麦耐盐突变体 RH8706-49盐胁迫 72 h的根部总 RNA电泳
图谱; B: 纯化的 Sfi I酶切 dscDNA电泳图谱(右泳道为 DNA
marker D2000); C: 捕获载体 pPR3-N的 Sfi I酶切结果(右泳道为
环状质粒 DNA对照); D: Sfi I酶切 cDNA和载体 pPR3-N的连接
产物转化大肠杆菌。
A: Electrophoresis pattern of total RNA extracted from the root of
salt tolerant mutant RH8706-49 under salt stress for 72 h; B: Puri-
fied dscDNA digested by Sfi I (the right lane shows banding pattern
of DNA marker D2000); C: Prey vector pPR3-N digested by Sfi I
(the right lane shows the banding pattern of circle plasmid DNA
control); D: Transformation of E. coli by the ligation of the digested
production of pPR3-N and dscDNA.

2.2 诱饵载体的构建、诱饵蛋白的自激活特性检
测和抑制 His本底表达的 3-AT浓度筛选
将质粒 B-TaSC1和 pBT3-N的 Sfi I酶切片段回
收后连接并转化大肠杆菌, 得到阳性克隆, 用 Sfi I
酶切鉴定, 对鉴定正确的克隆测序, 筛选到构建成
功的 bait载体, 命名为 pBT3-N-TaSC。
由于 pBT3-N-TaSC 质粒不能和 pPR3-N 载体上
的NubG重建, 转录因子不被切离, 不能激活酵母菌
中的启动子, 因此二者共转化的酵母菌不应该在三
缺板上生长。但是 His有一定程度的本底表达, 因此
需要用 3-AT来抑制 His的本底表达。在添加不同浓
度 3-AT 的三缺(SD/–Trp–Leu–His)培养基上画线培
养来鉴定自激活活性 , 结果表明 , 只有在含 1 0
mmol L1 3-AT的三缺培养基上 His本底表达被完全
抑制, 不能正常生长, 而阳性对照质粒能正常生长
(图 2-A)。-半乳糖苷酶活性检测结果显示, pBT3-
426 作 物 学 报 第 39卷



图 2 诱饵蛋白自激活特性检测及抑制 His本底表达的 3-AT浓度筛选
Fig. 2 Identification of auto-activation for bait protein TaSC and screening of the concentration of 3-AT inhibiting
His background expression
A: 在 SD/–Trp–Leu–His + 10 mmol L1 3-AT培养基上画线培养; B: 图 2-A中菌落的-半乳糖苷酶活性检测。1和 3: 阳性质粒对照组
合 pBT3-N-TaSC/pOst-NubI的转化子; 2: 质粒组合 pBT3-N-TaSC/pPR3-N的转化子。
A: Streak culture of yeast NMY51 transformant on the SD/–Trp–Leu–His medium containing 10 mmol L1 3-AT; B: -galactosidase
activity detection of yeast NMY51 in Fig. 2-A. 1 and 3: Transformants of positive control pBT3-N-TaSC/pOst-NubI combination; 2: Trans-
formant of pBT3-N-TaSC/pPR3-N combination.

N-TaSC/pOst-NubI 的转化子在很短的时间内变为蓝
色, 而含有 pBT3-N-TaSC/pPR3-N的转化子在 8 h之
内没有颜色改变(图 2-B), 表明 pBT3-N-TaSC没有自
激活活性, 可以作为诱饵蛋白进行文库筛选, 而且
抑制 His本底表达的 3-AT浓度是 10 mmol L1。
2.4 酵母双杂交及初步鉴定
将诱饵表达载体 pBT3-N-TaSC和不同文库质粒
分别共同转化酵母菌株 NMY51 后, 转化液涂布在
含 10 mmol L1 3-AT的三缺培养基上, 30℃培养 3~4
d, 将生长的酵母克隆转接到一个新的四缺平板上
观察生长情况, 连续转接 3 次。经过 3 次转接还能
够正常生长的克隆有 16个(图 3-A), 对其进行-半乳
糖苷酶活性检测, 发现这 16个菌落在 8 h内全部变
成蓝色(图 3-B), 初步认为这 16 个菌落为酵母双杂
交的阳性克隆。



图 3 酵母双杂交阳性克隆的生长和检测
Fig. 3 Growth and validation of positive clones from yeast
two-hybrid
A: 阳性克隆在 SD/–His/–Leu/–Trp/–Ade + 10 mmol L1 3-AT培
养基上生长; B: 图 3-A中菌落的 -半乳糖苷酶活性检测。
A: Positive clones growing on SD/–His/–Leu/–Trp/–Ade medium
containing 10 mmol L1 3-AT; B: Detection of -galactosidase
activity of positive clones in Fig.3-A.
2.5 阳性克隆的复筛
将获得的 16个克隆分别提取质粒回转大肠杆
菌, 筛选具有氨苄青霉素抗性的转化子即为包含文
库质粒的转化子。从该转化子中提取质粒后分别单
独与诱饵载体 pBT3-N-TaSC 共转化酵母菌株
NMY51 进行双杂交鉴定, 结果仅有 6个克隆可在 SD/
–His/–Leu/– Trp/–Ade+10 mmol L1 3-AT培养基上生
长(图 4-A), 显示也具有半乳糖苷酶活性(图 4-B), 将
得到阳性双杂交结果的文库质粒分别命名为 Prey1~
Prey6。PCR扩增结果显示, Prey3和 Prey4所含 cDNA
片段具有相同的分子量, 而其他 4 个文库质粒所含
cDNA片段的分子量相同(图 4-C)。将这些片段回收
并与 pMD18-T载体连接, 连接产物转化大肠杆菌并
测序。
2.6 TaSC互作蛋白编码基因的获得
将 6 个阳性 cDNA 克隆测序后进行 BLAST 比
对, 发现 Prey3和 Prey4具有相同序列(图 5), 并与一
个编码小麦未知功能蛋白的基因(GenBank登录号为
AK336035)有 99%同源性, 仅在 57 位存在一个碱基
的差异, 但氨基酸种类没有改变(均为赖氨酸), 蛋白
同源性达 100%。3 次杂交实验均得到相同克隆, 因
此推测与 TaSC 互作的蛋白由 AK336035 基因编码,
将该基因命名为 TaSCIP1 (TaSC interaction protein
1)。该序列全长 588 bp, ORF为 384 bp, 利用 TMHMM
网站 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析
该蛋白的跨膜域, 结果显示该蛋白有1个跨膜域, 其
中 N端在质膜内, C端在质膜外(图 6), 推测 TaSCIP
蛋白可能定位在细胞质膜上。由测序结果可知 ,
Prey1、Prey2、Prey5 和 Prey6 的序列相同, 均与大
豆的未知功能蛋白序列同源, 但本实验没有得到全
长序列。
第 3期 蔺芳芳等: 利用分裂泛素酵母双杂交技术钓取小麦 TaSC互作蛋白质 427




图 4 单个文库质粒与诱饵载体酵母双杂交结果及 PCR扩增检测
Fig. 4 Single cDNA library plasmid and bait vector yeast
two-hybrid and PCR identification
A: 阳性克隆在 SD/–His/–Leu/–Trp/–Ade + 10 mmol L1 3-AT培
养基上生长; B: 图 4-A中菌落的 -半乳糖苷酶活性检测; C: 转
化子的 PCR鉴定(M是 DNA marker DL2000)。
A: Positive yeast clone grown on SD/–His/–Leu/–Trp/–Ade medium
containing 10 mmol L1 3-AT; B: Detection of -galactosidase
activity detection of the positive yeast clones in Fig. 5-A; C: PCR
identification of different transformants (Lane M shows banding
pattern of DNA marker DL2000).

2.7 TaSCIP1及 TaSC基因的 BiFC载体的构建
对重组 BiFC 载体 pSPYNE-TaSC 和 pSPYCE-
TaSCIP1进行双酶切鉴定, 分别得到 381 bp和 423 bp
的片段, 与目标长度一致, 说明 TaSCIP1 基因片段
(图 7-A)及 TaSC基因片段(图 7-B)均与载体正确连接,
载体构建成功。
2.8 BiFC验证结果
将质粒组合pSPYCE/pSPYNE、pSPYCE/pSPYNE-
TaSC、pSPYNE/pSPYCE-TaSCIP1和 pSPYNE-TaSC/
pSPYCE-TaSCIP1 分别注射烟草表皮细胞进行激光
共聚焦显微镜观察, 结果未见空载质粒组合 pSPYCE/
pSPYNE (图 8-A)、阴性对照 pSPYCE/pSPYNE-TaSC
(图 8-B)和 pSPYNE/pSPYCE-TaSCIP1 (图 8-C)有荧光,
而目标质粒组合 pSPYNE-TaSC/pSPYCE-TaSCIP1 (图
8-D)共同转化的烟草表皮细胞的细胞质膜上有黄色
荧光出现, 表明 TaSC基因与 TaSCIP1基因的确发生
了互作。
3 讨论
细胞质膜作为特殊屏障严格而有序地控制着细
胞与外界环境之间的物质、能量及信息交换, 其中膜
蛋白质, 特别是一些膜转运蛋白在接受环境刺激、信
号传导及抗逆等方面都起着非常重要的作用[17]。例如,
编码质膜 Na+/H+逆向转运蛋白(Na+/H+ antiporter)的
SOS1基因是已被证实的耐盐相关基因, 该蛋白的功


图 5 Prey3和 Prey4的 cDNA序列
Fig. 5 cDNA sequences of positive clones from Prey3 and Prey4



图 6 TaSCIP1 蛋白的 TMHMM跨膜域预测
Fig. 6 Transmembrane domain prediction of TaSCIP1 using TMHMM
428 作 物 学 报 第 39卷



图 7 BiFC载体双酶切鉴定
Fig. 7 Digested identification of BiFC recombination vectors
A: BamH I和 Xba I酶切 pSPYCE-TaSCIP1; B: BamH I和 Kpn I酶切 pSPYNE-TaSC。
A: pSPYCE-TaSCIP1 digested by BamH I/Xba I; B: pSPYNE-TaSC digested by BamH I/Kpn I.



图 8 不同质粒组合转化烟草表皮细胞的 BiFC结果
Fig. 8 Results of BiFC of tobacco leaf epidermis cells transformed by different combination of vectors
A: pSPYCE/pSPYNE; B: pSPYCE/pSPYNE-TaSC; C: pSPYNE/pSPYCE-TaSCIP1; D: pSPYNE-TaSC/pSPYCE-TaSCIP1.

能是把 Na+排出细胞外, SOS1 过表达可以提高不同
转基因植株的耐盐性[18-20]。Li等[21]发现 HbCIPK2过
表达可以提高转基因拟南芥的耐盐性, 该蛋白也被
定位于细胞质膜。Fu 等[3]从玉米中分离了 8 个质膜
蛋白 ZmPMP3, 除编码 ZmPMP3-6 的基因外, 其他
基因均与各种非生物胁迫相关, 其中 ZmPMP3-1 基
因过表达可提高转基因拟南芥的耐盐性。Yang 等[22]
发现在野生大豆中有一个 SnRK家族的激酶GsAPK,
定位在质膜上, 通过 ABA信号转导通路参与胁迫应
答。可见, 膜蛋白在抗逆过程中有非常重要的作用。
我们前期研究结果表明, TaSC 蛋白被定位于细
胞质膜上, 在拟南芥中过表达 TaSC基因可以显著提
高转基因植株的耐盐性[15]。为进一步研究该基因的
功能, 我们构建了小麦 cDNA 表达文库, 利用分裂
第 3期 蔺芳芳等: 利用分裂泛素酵母双杂交技术钓取小麦 TaSC互作蛋白质 429


泛素酵母双杂交技术, 以 TaSC蛋白为诱饵, 筛选到
互作蛋白质 TaSCIP1的编码基因(GenBank登录号为
AK336035), 并经 BiFC实验确认该蛋白定位于细胞
质膜上, 与 TaSC蛋白发生互作。因为 TaSC是膜蛋
白 [15], 因此, 我们推测二者的相互作用可能与耐盐
信号传导有关, TaSCIP1极有可能是一个耐盐相关基
因, 其机制有待深入研究。
cDNA 表达文库构建的关键是获得结构完整和
具有功能的蛋白质。我们使用 SMART技术构建 cDNA
文库, 使得反转录产物中绝大多数都是全长 cDNA,
同时利用在真核生物中较少的限制性内切酶 Sfi I酶
切 dscDNA, 尽可能减少切断 dscDNA, 有利于构建
全长 cDNA 文库, 以保证表达文库的蛋白结构完整和
具备功能, 但实验体系尚需进一步完善。如 6000多
个克隆的文库容量相对来说较小, 其原因主要是六
倍体小麦基因组庞大 , 蛋白质组成复杂, 构建表达
cDNA 文库难度较大, 获得更大的小麦的 cDNA 文库
比较困难。值得庆幸的是, 我们从构建的文库中分离
获得互作蛋白, 并经3次重复验证, 说明TaSCIP1蛋白
与 TaSC互作的结论是可靠的。
由于TaSC蛋白位于细胞质膜上[15], 本实验采用
一种专门针对膜系统蛋白相互作用的方法, 该方法
利用泛素的特点将膜蛋白的互作与转录激活联系起
来, 使蛋白互作可以激活该系统中酵母菌株NMY51
的 3个报告基因(His、Laz和 Ade), 通过报告基因的
表达可以鉴定膜上蛋白质的互作。本实验中全长
cDNA 文库构建与分裂泛素系统与酵母双杂交系统
相结合, 成功钓取了TaSC的一个互作蛋白TaSCIP1,
证明这两种方法结合在分离膜蛋白互作蛋白方面是
可行的。
4 结论
利用分裂泛素酵母双杂交方法从小麦 cDNA 表
达文库中筛选到 1个与小麦TaSC蛋白相互作用的蛋
白质, 经测序得到一个编码小麦未知功能的蛋白质
(GenBank 登录号为 AK336035), 将克隆到的该编码
基因命名为 TaSCIP1, 以软件预测小麦 TaSCIP1 蛋
白, 定位于细胞质膜上。以 BiFC 技术验证了小麦
TaSC蛋白与 TaSCIP1蛋白的相互作用。
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