全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2015, 41(5): 673682 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2011AA100501, 2012AA10A308)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 景蕊莲, E-mail: jingruilian@caas.cn, Tel: 010-82105829
第一作者联系方式: E-mail: liqian198812@126.com
Received(收稿日期): 2015-01-02; Accepted(接受日期): 2015-03-19; Published online(网络出版日期): 2015-03-30.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20150330.1615.002.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2015.00673
小麦脂质转运蛋白基因 TaLTP克隆及功能分析
李 倩 1,2 王景一 2 毛新国 2 李 昂 2 高丽锋 2 刘惠民 1 景蕊莲 2,*
1山西大学生物工程学院, 山西太原 030006; 2农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程 / 中国农业科学院作物科学研究所, 北
京 100081
摘 要: 脂质转运蛋白(lipid transfer protein, LTP)是广泛存在于植物中的一类小分子蛋白, 因其能在植物细胞膜间运
输脂类物质而得名, 在植物角质层合成和适应多种环境胁迫中起重要作用。本研究利用同源克隆方法得到 TaLTP-s
的 cDNA全长序列 510 bp, 开放阅读框为 339 bp, 编码 112个氨基酸。利用 RIL群体将 TaLTP-s定位在染色体 1A上,
距离两侧标记 WMC449和 WMC93的遗传距离分别为 2.1 cM和 5.9 cM。通过原生质体亚细胞定位显示 TaLTP-s定位
于细胞膜和细胞质中。小麦开花期 TaLTP-s 在小花中表达量较高, 尤其是在花药中的表达量远高于在根和叶中。在
ABA、PEG、NaCl及 4℃低温胁迫诱导下, 小麦 TaLTP-s均上调表达, 可能与抗逆性调节相关。在高盐胁迫处理下, 转
基因拟南芥幼苗的细胞膜稳定性和存活率显著高于野生型。研究结果为利用小麦脂质转运蛋白基因改良作物抗逆性
奠定了基础。
关键词: 小麦; 脂质转运蛋白; 基因克隆; 非生物胁迫; 耐盐性
Cloning and Functional Analysis of Lipid Transfer Protein Gene TaLTP in
Wheat
LI Qian1,2, WANG Jing-Yi2, MAO Xin-Guo2, LI Ang2, GAO Li-Feng2, LIU Hui-Min1, and JING Rui-Lian2,*
1 College of Bioengineering, Shanxi University, Taiyuan 030006, China; 2 National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement /
Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081
Abstract: Lipid transfer protein (LTP) is a kind of small molecular protein, which name stands for its ability to transfer lipid be-
tween cell membranes in plant. LTP plays a key role in cuticle synthesis and adaptation to abiotic stress. We cloned a full-length
cDNA sequence of TaLTP gene encoding a lipid transfer protein from wheat (Triticum aestivum L.), which length is 510 bp with a
339 bp open reading frame. The cDNA sequence contains 112 amino acids with a N-terminal signal peptide within the first 25
amino acids. This gene contains eight cysteine residues conserved in amino acid sequences. TaLTP-s was detected to be located
between markers WMC449 and WMC93 on chromosome 1A in wheat, with genetic distances of 2.1 cM and 5.9 cM, respectively.
The result of subcellular localization exhibited that TaLTP-s is located in the cell membrane and cytoplasm. TaLTP-s was ex-
pressed in all tissues at flowering stage, including leaf, root, floret, anther and pistil, and mature seeds of wheat. The highest ex-
pression level was identified in the floret, especially in the anther. TaLTP-s was up-regulated by ABA, PEG, NaCl, and 4ºC treat-
ments which indicates that TaLTP-s is involved in different signal pathways responding to abiotic stress. Arabidopsis thaliana
overexpressing TaLTP-s showed higher cell membrane stability and survival rate than the controls under salinity stress. These
results provide a candidate gene for wheat improvement in response to salt and other abiotic stresses.
Keywords: Wheat; TaLTP-s; Gene cloning; Abiotic stress; Salt tolerance
植物脂质转运蛋白(lipid transfer protein, LTP)是
一类可溶性的小分子蛋白, 因其能在植物细胞膜之
间转运脂类物质而得名。LTP 蛋白的 N 端有一个包
含 21~29 个氨基酸的信号肽, 能够引导蛋白分泌到
细胞外参与细胞外亲脂性物质(如角质)的沉积途径[1]。
LTP蛋白含有 8个半胱氨酸残基(C-Xn-C-Xn-CC-Xn-
CXC-Xn-C-Xn-C), 可以形成 4 个二硫键[2]。体外实
验表明, 这 4个二硫键形成一个疏水腔, 因而能够结
674 作 物 学 报 第 41卷


合脂类和一些疏水性物质[3]。不同物种的 LTP 蛋白
一级结构差异较大 , 根据其分子量最初将其分为
type I (10 kD)和 type II (7 kD)两个亚家族[3]。后来在
玉米中发现了花药特异性转录基因 MZm3-3, 该基
因表达的蛋白与 nsLTPs同源, 被认为是 type III [4]。
LTP 蛋白主要存在于植物地上器官的表皮组织
中, 具备多种复杂的生物学功能, 主要包括脂类物
质转运、角质层蜡质合成 [5-6], 抵御非生物胁迫 [7-8]
和病原菌侵害[9], 另外在花药和花粉发育[10-11]、水分
胁迫信号转导[12]过程中也发挥重要作用。例如芝麻
SiLTP2 与 SiLTP4 基因受 NaCl、甘露醇等胁迫诱导
表达[13], 拟南芥中过表达脂质转运蛋白 AZI1基因株
系的耐盐性显著高于野生型和突变体 [8], 过表达辣
椒 CALTP1 的转基因拟南芥抗病、抗盐和抗旱性也
显著高于野生型[14]。目前在拟南芥[15]、水稻[16]、棉
花[17]中分别检测到 15、52和 11个 LTP基因, 在小麦
中鉴定出 23个 LTP基因[18]。Boutrot等[18]用 GUS作
为报告基因, 在转基因水稻根、叶、花的维管组织中
检测到 6个小麦 LTP基因启动子活性, 说明 LTP在维
管组织中发挥一定作用。Jang等[19]从小麦–黑麦易位
株系中分离到 TaLTP1和 TaLTP2基因, Northern blot
分析显示其转录水平受 NaCl和 PEG的诱导。但关于
这些基因的具体生物学功能还有待进一步研究。
本研究通过同源克隆得到小麦(Triticum aesti-
vum L.)脂质转运蛋白基因 TaLTP-s, 并进行了基因
序列比对和染色体定位, 目标基因在小麦细胞中的
作用部位和不同器官中的表达特性检测, 在 ABA、
PEG、NaCl、低温等胁迫处理下目标基因的表达模
式分析, 以及转 TaLTP-s拟南芥对高浓度盐胁迫的响
应分析, 旨在为深入研究 TaLTP-s 的功能, 揭示脂质
转运蛋白在小麦抵抗逆境胁迫中的作用提供依据。
1 材料与方法
1.1 植物材料及其培养
利用本实验室保存的小麦抗旱品种旱选10号
进行基因克隆、原生质体的亚细胞定位和基因表达
模式分析等。挑选大小均匀一致的种子置培养皿中,
加入去离子水, 在光照培养箱(20℃、光周期 12 h d–1)
中待幼苗长至一叶一心时 , 分别用 16.1% PEG-
6000、250 mmol L–1 NaCl、50 mmol L–1 ABA和 4℃
进行胁迫处理, 在处理 0、0.5、1、1.5、2、3、6、
12、24、48和 72 h后取幼苗叶片, –80℃保存, 用于
目标基因的胁迫表达模式分析。田间种植旱选 10号,
开花期取根、叶、小花、花药和雌蕊, –80℃保存, 成
熟后取种子 , 用于目标基因的组织特异性表达分
析。挑选籽粒饱满的小麦种子, 置培养皿中, 加去离
子水室温培养, 待幼苗长至一叶一心时, 取幼苗叶
片中段进行酶解处理, 制备原生质体进行目标基因
的亚细胞定位。
用于基因染色体定位的材料包括本实验室保
存的普通小麦的二倍体供体种10份、四倍体材料3
份 (表1), 以及由中国农业科学院作物科学研究所
高丽锋老师提供的192个源于普通小麦品种偃展1
号内乡188的重组自交系(recombinant inbred line,
RIL)。室温条件下水培上述材料 , 取幼苗叶片提取
DNA。

表 1 供试小麦品种、小麦近缘材料及其来源
Table 1 Wheat varieties and wheat relatives used in this study and their origins
材料/品种
Species/variety
份数
Number of accessions
材料编号
Accession code
基因组
Genome
来源
Origin
旱选 10号 Hanxuan 10 AABBDD 中国山西 Shanxi, China
偃展 1号 Yanzhan 1 AABBDD 中国河南 Henan, China
普通小麦 Triticum aestivum 3
内乡 188 Neixiang 188 AABBDD 中国河南 Henan, China
乌拉尔图小麦 Triticum urartu 3 UR200, UR204, UR205 AA 黎巴嫩 Lebanon
Y2017, Y2033 SS 叙利亚 Syria 拟斯卑尔托山羊草 Aegilops speltoides 4
Y2035, Y2178 SS 不详 Unknown
Ae38, Ae46 DD 伊朗 Iran 粗山羊草 Aegilops tauschii 3
Y57 DD 墨西哥 Mexico
DM50 AABB 加拿大 Canada 栽培二粒小麦 Triticum dicoccoides 2
DM49 AABB 不详 Unknown
四倍体小麦 Triticum polonicum 1 DS1 AABB 不详 Unknown

第 5期 李 倩等: 小麦脂质转运蛋白基因 TaLTP克隆及功能分析 675


1.2 目的基因克隆
以 NCBI 数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)
的 OsDIL (Oryza sativa drought-induced LTP,
Os10g0148000)为参考序列, 在小麦A基因组数据库
中搜索得到小麦 TaLTP 候选序列 , 利用 Primer
Premier 5.0 软件设计扩增 TaLTP 全长序列的引物
LTP-F 和 LTP-R, 以及扩增基因编码区的引物
LTP-c-F和 LTP-c-R (表 2)。
用 TRIzol 试剂盒 (TIANGEN, 北京 )提取总
RNA。以经过处理的小麦幼苗总 RNA 为模板, 用
M-MLV Reverse Transcriptase 反 转 录 试 剂 盒
(Invitrogen, 美国)合成第 1链 cDNA, 以此为模板。
利用高保真酶 TransStart Fast Pfu DNA polymerase
(TRANSGEN, 北京 )进行 PCR。扩增体系包含
5×buffer 3 μL, dNTP (2.5 μmol L–1) 1.2 μL, 模板
DNA (50 ng μL–1) 1 μL, 正、反向引物(10 μmol L–1)
各 0.5 μL, TransStart Fast Pfu 0.3 μL, 用 ddH2O补足
15 μL。反应条件为 95℃ 5 min; 95℃ 45 s, 56℃ 45 s,
72℃ 30 s, 36个循环; 72℃ 10 min; 10℃保存。用 2%
琼脂糖凝胶分离 PCR产物。将目的片段回收纯化后,
连接至 pEASY-Blunt载体(TRANSGEN, 北京), 转化
后挑取阳性克隆, 用 BigDye Terminator Kit (ABI)按
说明书测序。
1.3 目的基因引物设计和遗传作图
利用 RIL群体亲本偃展 1 号和内乡 188 中启动
子区 1696 bp处的碱基差异 T/C设计 dCAPS (derived
cleaved amplified polymorphic sequences)标记引物
Pro-SP-F、Pro-SP-R (表 2), 其扩增产物 220 bp, 含
有 Nde I 酶切位点(图 1)。酶切该扩增产物, 检测各
株系的基因型, 利用 MapMaker3.0 遗传作图软件进
行目标基因作图。

图 1 dCAPS标记引物设计示意图
Fig. 1 Scheme of dCAPS primer design
方框内为设计 Pro-SP-F引物的原始序列; 椭圆框内为突变碱基:
TC→CA; ▼表示 Nde I酶切位点。
The sequence in the box is the primer Pro-SP-F. The elliptic boxes
indicate mutated bases: TC→CA. ▼is the enzyme cutting site of
Nde I.
1.4 基因结构和序列分析
利用 DNAStar软件包中 Seqman和MegAlign进
行基因序列分析、拼接和比对。应用 DNAman进行
酶切位点的分析和蛋白序列比对分析。采用 SignalP
4.0预测信号肽。
1.5 载体构建和亚细胞定位
利用 Kpn I 和 Xba I 酶切位点将 TaLTP-s 全长
CDS序列(去掉终止密码子)与 Psuper-1300-GFP载体
融合表达, 构建成 35S::TaLTP-s::GFP 载体用于亚细
胞定位观察和拟南芥的转化。用原生质体转化法将
35S::GFP、35S::TaLTP-s::GFP 分别转化小麦叶肉细
胞原生质体 , 室温避光培育 12 h 后 , 在 Zeiss
LSM700激光共聚焦显微镜下观察细胞的荧光信号。
1.6 目标基因的实时定量 RT-PCR检测
以小麦 Actin (JQ269668.1)为内参基因, 设计实
时定量 PCR引物(表 2)。采用 SYBR Premix Ex Taq
(Perfect Real-time)试剂 盒 (TaKaRa, 日本 )进行
qRT-PCR分析。反应体系 20 μL, 含 2× SYBR Premix
Ex Taq 10.0 μL, 正、反向引物(5 μmol L–1)各 0.4 μL,
1/10 cDNA first-strand 1.0 μL, ROX Reference Dye
(50×) 0.4 μL, ddH2O 7.8 μL。在 ABI 7900 PCR仪上
按如下程序扩增: 95℃ 30 s; 95℃ 5 s, 退火 30 s, 40
个循环。采用 2–ΔΔCt法计算目标基因的相对表达量[20]。
1.7 转基因拟南芥及其耐盐性鉴定
用构建的载体质粒转化农杆菌 GV3101 菌株,
侵染拟南芥的花。经潮霉素抗性筛选后获得 T1代转
基因阳性植株, 单株收取种子并加代, 再经抗性筛
选得到 T3代纯合转基因株系, 选取 2 个株系用于耐
盐性分析。
将野生型(WT)、转 GFP的对照及转基因株系种
子用 10%次氯酸钠溶液消毒处理后 , 分别点播于
MS培养基上, 在 4℃下春化处理 2 d, 然后将培养皿
垂直放于人工气候室中培养。从垂直培养 8 d 的幼
苗中取长势一致的幼苗 20 株, 移至含有 250 mmol
L–1 NaCl的 MS固体培养基上, 培养 4 d后, 每隔 12
h 记录幼苗的绿色子叶数目, 作为幼苗存活率的指
标。利用煮沸法测定幼苗相对电导率, 评价细胞膜
稳定性(cell membrane stability, CMS)。幼苗垂直培养
10 d后, 从每个株系挑选长势一致的幼苗, 取 45株
移至 ddH2O和 NaCl (250 mmol L–1)的过饱和滤纸上,
室温处理 24 h后测定幼苗电导率, 15株为一个重复,
3次重复。CMS(%) = (1 – 煮前电导率/煮后电导率)
× 100。CMS值越大, 细胞膜稳定性越强, 说明受盐
胁迫的伤害越小。
676 作 物 学 报 第 41卷


表 2 用于 qRT-PCR的引物及其序列
Table 2 Primers used in qRT-PCR and their sequences
目的基因
Gene
引物
Primer
引物序列
Primer sequence (5–3)
退火温度
Annealing temperature (℃)
LTP-F CCCCCACTGACCTCCTCTTT TaLTP启动子和编码区
Promoter and coding region of LTP-R CATTCATTTCGGAATTGCCCTA
59
LTP-c-F GACCCTCTAGAACCATTAAGCAC 56 TaLTP TaLTP cDNA
LTP-c-R TGGGGTAAGCATGTCAGTCAC
Pro-SP-F ATGCACTTACAGTTTGACTACTCATA 56 TaLTP启动子区
Promoter region of TaLTP Pro-SP-R AAATGCGATAGGTGTGAGAATG
Actin F1 CTCCCTCACAACAACAACCGC 60 Actin
Actin R1 TACCAGGAACTTCCATACCAAC
LTP-RT-F CGTGCGGGACAACATCAG 60 TaLTP-s
LTP-RT-R GCAGTTGCCAGGGATGCT

2 结果与分析
2.1 目标基因克隆
以普通小麦旱选 10号基因组 DNA为模板, 利
用引物对 LTP-F/LTP-R 扩增 TaLTP 基因, 测序结果
表明其全长序列为 2.77 kb, 包含基因区和启动子区
(图 2-a)。
以旱选 10号 cDNA为模板, 利用引物对 LTP-c-

图 2 TaLTP基因结构和序列及 TaLTP-s编码氨基酸序列
Fig. 2 Structure and sequence of gene TaLTP and amino acids sequence encoded by TaLTP-s
a: TaLTP基因结构图, TSS表示转录起始位点, ATG和 TGA分别表示起始和终止密码子。b: 小麦 cDNA中分离的 TaLTP, M和 1分别
表示 Marker III和 TaLTP的 RT-PCR产物。c: TaLTP-s核酸序列及其推导的氨基酸序列。d: TaLTP-s信号肽预测, 红、绿、蓝线分别代
表剪切位置分值(C-score)、信号肽分值(S-score)和综合考虑分值(Y-score)。
a: scheme of TaLTP structure, in which TSS is the transcription start site, ATG and TAG are the initiation and termination codon respectively.
b: TaLTP isolated from wheat cDNA. Lanes “M” and “1” were loaded with Marker III and the RT-PCR product of TaLTP. c: nucleotide se-
quence and putative amino acids of TaLTP-s. d: signal peptide predicted in TaLTP-s. The red, green and blue lines show cleavage site score
(C-score), signal peptide score (S-score) and combined cleavage site score (Y-score), respectively.
第 5期 李 倩等: 小麦脂质转运蛋白基因 TaLTP克隆及功能分析 677


F/LTP-c-R扩增目标基因。测序结果表明, 该基因有
两种不同的序列, 全长均为510 bp (图2-b), 但开放
阅读框分别为357 bp和339 bp, 相似性为95.3%。较
长的序列命名为 TaLTP-l, 较短的序列被命名为
TaLTP-s。本文只对 TaLTP-s进行分析。该序列编码
112个氨基酸 (图 2-c), 在 NCBI 数据库中比对
TaLTP-s 编码的氨基酸序列, 发现其含有 AAI_LTSS
结构域, 属于 ns-LTP like家族。以旱选10号 DNA为
模板, 其 PCR扩增产物的测序结果表明, TaLTP-s基
因没有内含子, 对信号肽预测显示1~25位氨基酸之
间有典型的 TaLTP信号肽特征(图2-d)。
2.2 TaLTP-s基因染色体定位
利用引物 LTP-F和 LTP-R检测小麦二倍体供体
种和四倍体小麦的 TaLTP-s, 结果只在乌拉尔图小
麦(AA)和四倍体材料(AABB)中扩增到目标片段(图
3-a), 说明该基因位于小麦 A基因组。
扩增产物的测序结果表明, 偃展 1号和内乡 188
在 TaLTP-s 基因的启动子区存在 7 个位点的碱基差
异(表 3), 而编码区序列没有差异。利用 Nde I 酶切
检测 RIL 群体 192 个株系的基因型 (图 3-b), 将
TaLTP-s定位于染色体 1A上, 位于标记 WMC449和
WMC93 之间, 距离两侧标记的遗传距离分别为 2.1
cM和 5.9 cM (图 3-c)。

表 3 RIL群体双亲中的核苷酸多态性
Table 3 Nucleotide acid polymorphism between parents of the
RILs
位点
Site
偃展 1号
Yanzhan 1
内乡 188
Neixiang 188
75 bp T C
141 bp A -
252 bp G A
284 bp T C
1120 bp G A
1282 bp A G
1696 bp T C

图 3 小麦 TaLTP-s基因染色体定位
Fig. 3 Chromosome localization of TaLTP-s in wheat
a: 基因组特异性引物 LTP-F/LTP-R在小麦二倍体供体种和四倍体小麦中的扩增产物; b: RIL群体中 TaLTP-s的分离; c: 小麦 TaLTP-s
在染色体 1A上的定位。M1: Marker III; AA: 乌拉尔图小麦; BB: 拟斯卑尔托山羊草; DD: 粗山羊草; AABB: 四倍体小麦; M2: 100 bp
marker; 1~12: RIL群体的 12个株系; YZ: 偃展 1号; NX: 内乡 188。
a: PCR product of the genome-specific primer LTP-F/LTP-R in diploid progenitors of common wheat and tetraploid wheat species; b: separa-
tion of TaLTP-s in RILs; c: linkage map of TaLTP-s on wheat chromosome 1A. M1: marker III; AA: Triticum urartu; BB: Aegilops speltoides;
DD: Aegilops tauschii; AABB: Triticum polonicum; M2: 100 bp marker; 1–12: 12 lines of RILs; YZ: Yanzhan 1; NX: Neixiang 188.

2.3 TaLTP-s氨基酸序列同源性分析
将小麦 TaLTP-s 基因编码的蛋白序列提交到
NCBI 中进行 BLASTP 比对, 小麦与乌拉尔图小麦
(EMS67687.1)、 大 麦 (BAK03708.1)、 水 稻 (NP_
003573732.2)、玉米(NP_001158990.1)的 LTP氨基酸
序列相似性分别为 91%、78%、58%和 44%。虽然
在序列的同源性上差异比较大, 但这几种植物 LTP
所含的半胱氨酸(C)数量和位置完全相同, 均含有 8
个半胱氨酸(图 4-a)。Boutrot等[16]通过系统进化树分
析将水稻和拟南芥的 nsLTPs分为 9种类型(type), 不
同类型可以通过 8 个半胱氨酸之间的氨基酸数目来
区分。本研究得到的小麦 TaLTP-s序列中, 8个半胱
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氨酸之间所含有的氨基酸数目依次为 10、16、0、9、
1、23和 7个, 应归为 type VI。目前关于 type VI的
LTP 基因信息和功能报道均较少。构建不同物种脂
质转运蛋白序列的进化树, 小麦 TaLTP-s 与单子叶
植物的蛋白序列有很高的相似性, 而与双子叶植物
的 LTP蛋白序列差异较大(图 4-b)。

图 4 几种植物 LTP序列比(a)对与聚类分析(b)
Fig. 4 Alignment (a) and phylogenetic tree (b) of LTP sequences from several plant species
Ur: 乌拉尔图小麦; Hv: 大麦; Os: 水稻; Ta: 小麦; Zm: 玉米; LTP: 脂质转运蛋白。*代表半胱氨酸所在位置。
Ur: Triticum urartu; Hv: Hordeum vulgare; Os: Oryza sativa; Ta: Triticum aestivum; Zm: Zea mays; LTP: lipid transfer protein. * indicates the
cysteine residues of LTPs.

2.4 TaLTP-s亚细胞定位
将构建的融合表达载体 Psuper-1300-GFP 转化
小麦原生质体后, 在细胞质和细胞膜中检测到 GFP
荧光信号(图 5), 说明 TaLTP-s 在细胞质和细胞膜上
均有表达。
2.5 非胁迫诱导下 TaLTP-s的表达模式
在 ABA、NaCl、PEG 和 4℃胁迫条件下, 小麦
幼苗 TaLTP-s 的表达量均显著上升, 反映了小麦脂
质转运蛋白对这 4种逆境胁迫均有响应。ABA诱导
6 h后, 表达量达到最大值(图 6-a), 说明 TaLTP-s在
ABA信号通路中起作用。TaLTP-s对 4℃处理较为敏
感, 在处理 0.5 h的表达量达到最大值, 随后表达量
急剧下降, 在 12 h 时出现第 2 个表达高峰(图 6-b),
说明 TaLTP-s可能参与植物的耐冷性反应。在 NaCl
处理下, TaLTP-s 表达量在 3 h 时达到高峰, 说明
TaLTP-s对盐胁迫敏感; 随后的表达量显著下降, 但
仍高于对照组(图 6-c), 这可能是因为高浓度的 NaCl
溶液对细胞造成了一定的伤害, 并进一步影响到细
胞内基因转录和蛋白质的合成。PEG 处理后 0.5 h,
TaLTP-s表达量最高, 1 h时略有下降, 随后表达量急
剧下降(图 6-d), 说明 TaLTP-s受渗透胁迫诱导表达。
2.6 TaLTP-s组织特异性表达
对小麦开花期不同组织、器官中 TaLTP-s表达
模式的分析表明, 该基因在根、叶、小花和成熟种
子中均有表达 , 表达量依次为小花>种子>叶>根。
进一步分析开花期的花药和雌蕊表明, TaLTP-s 基
因在花药中的表达量最高, 为同时期叶片的 735 倍
(图 7)。
2.7 过表达 TaLTP-s转基因拟南芥的耐盐性
2.7.1 盐胁迫下转基因幼苗存活率 通过对转基
因株系中 TaLTP-s 表达量的分析(图 8-a), 选取表达
量较高的 L-3 和 L-7 株系分析基因功能。将在正常
MS固体培养基上生长 8 d的转基因和野生型拟南芥
幼苗移至含有 250 mmol L–1 NaCl的MS固体培养基
上, 培养 4 d后, 部分幼苗子叶开始变白(图 8-b)。转
基因株系 L-7植株子叶的存活率从 4.5 d到 5.5 d显
第 5期 李 倩等: 小麦脂质转运蛋白基因 TaLTP克隆及功能分析 679



图 5 TaLTP-s在小麦原生质体中的亚细胞定位
Fig. 5 Subcellular localization of TaLTP-s in wheat protoplast cells
Scale bar = 20 μm.

图 6 ABA (a)、4℃低温(b)、NaCl (c)和 PEG-6000 (d)胁迫下小麦幼苗中 TaLTP-s的表达模式
Fig. 6 Expression patterns of TaLTP-s in wheat seedling under ABA (a), 4℃ of low temperature (b), NaCl (c), and PEG-6000 (d)
stresses
以 0 h的表达量为标准; 数据为 3次独立试验的平均值±SE。*和**分别表示相对表达水平在 0.05和 0.01概率水平显著升高(t-检验)。
The 0 h expression level is assigned a value of 1. Values are the mean±SE of three biological replicates. * and ** indicate significant increase
in relative expression at the 0.05 and 0.01 probability level, respectively (t-test).

著高于对照组, 而转基因株系 L-3仅在 5.5 d时的子
叶存活率显著高于对照(图 8-c)。试验结果表明, 过
表达 TaLTP-s转基因拟南芥的耐盐性高于对照。
2.7.2 盐胁迫下幼苗细胞膜稳定性 正常条件下
培养的各个株系的拟南芥幼苗细胞膜稳定性没有显
著差异, 而盐胁迫处理 24 h后幼苗细胞膜稳定性都
有显著下降, 但过表达 TaLTP-s 转基因幼苗在盐胁
迫处理下细胞膜稳定性仍然显著高于对照株系(图
8-d), 说明过表达 TaLTP-s转基因幼苗的耐盐胁迫能
力高于对照株系。
3 讨论
脂质转运蛋白在植物体内普遍存在, DNA印迹
表明 , 棉花、玉米、水稻等都存在LTP基因的多个
拷贝, 并分布于不同染色体上[1]。研究发现LTP家族
成员在不同组织器官和不同发育时期的表达模式
不尽相同。比如水稻的OsLTP1基因在茎和花中的
表达量高于在根和叶中 , 而OsLTP3则只在茎和叶
中表达[21]。在拟南芥中发现15个LTP基因, 对其中6
个成员的表达谱分析表明 , 它们在花和叶片中均
680 作 物 学 报 第 41卷




图 7 小麦不同组织中 TaLTP-s的表达模式
Fig. 7 Expression patterns of TaLTP-s in different organs
in wheat
以叶的 TaLTP-s表达量为标准。数据为 3次独立试验的平均值
±SE。**表示相对表达水平在 0.01概率水平显著升高(t-检验)。
The leaf expression level of TaLTP-s is assigned a value of 1.
Values are the mean±SE of three biological replicates. ** indicates
significant increase of relative expression at the 0.01 probability
level (t-test).
有表达, 在根中不表达, 而且在拟南芥正发育的幼
嫩组织中 LTPs 的表达量高于在成熟组织及花瓣和
萼片的脱落区中[22]。本研究发现, 该基因在花中, 尤
其是花药中的表达量显著高于在根和叶中(图 7)。在
水稻中发现的脂质转运蛋白基因 OsDIL, 其在花药
中的表达量最高, 过表达该基因的水稻植株在营养
生长阶段和生殖生长阶段其抗旱性均比对照组强 ,
尤其是在生殖生长阶段能够降低干旱胁迫对水稻花
粉发育的影响, 从而提高单株产量[23]。本研究克隆
得到的小麦 TaLTP-s 与水稻 OsDIL 基因有相似的表
达模式, 但其功能是否相同还有待进一步的转基因
功能验证。利用 RIL群体将 TaLTP-s定位于 1A染色
体标记 WMC449和 WMC93之间, Su等[24]在标记区
间 Xpsp3027-WMC93 检测到不同磷浓度处理条件下
控制单株粒数、籽粒产量和生物学产量的多个 QTL;
Yang等[25]在相邻区间 Xpsp3027-Xgwm164检测到控

图 8 盐胁迫处理下 TaLTP-s转基因幼苗与野生型的存活率和细胞膜稳定性比较
Fig. 8 Comparison of seeding survival and cell membrane stability between TaLTP-s plants and wild type under NaCl stress
a: 拟南芥中 TaLTP-s的表达; b: 250 mmol L–1 NaCl处理 5.5 d的拟南芥; c: 子叶存活率, 数据为 3次独立实验的平均值±SE, *表示转基
因株系与野生型在 0.05概率水平有显著差异(t-检验); d: 不同浓度 NaCl处理的细胞膜稳定性(CMS)比较, 数据为 3次独立试验的平均
值±SE, *和**分别表示转基因株系与野生型在 0.05和 0.01概率水平有显著差异(t-检验)。WT: 拟南芥野生型; GFP: 空载体对照; L-3、
L-7: 2个 TaLTP-s转基因株系。
a: expression of TaLTP-s in Arabidopsis. b: Arabidopsis seedlings treated with 250 mmol L–1 NaCl for 5.5 days. c: survival rate of cotyledon.
Values are the mean±SE of three biological replicates. * indicates significant difference between the transgenic line and the wild line at 0.05
probability level (t-test). d: comparison of seeding cell membrane stability (CMS) under different concentrations of NaCl. Values are the
mean±SE of three biological replicates. * and ** indicate significant difference between the transgenic line and the wild type at the 0.05 and
0.01 probability levels, respectively (t-test). WT: Arabidopsis wild type; GFP: GFP control; L-3, L-7: two individual TaLTP-s transgenic
lines.
第 5期 李 倩等: 小麦脂质转运蛋白基因 TaLTP克隆及功能分析 681


制籽粒饱满度和茎秆可溶性糖含量的 QTL。由此推
测 TaLTP-s 基因标记附近聚集着控制穗粒数、单株
穗数及籽粒饱满度的 QTL。
LTP 作为一种防御蛋白, 在植物抗逆和适应不
良环境中发挥重要作用。如拟南芥中过表达 LTP3
基因的转基因株系对干旱和低温胁迫的耐性高于突
变体株系[26]。在 NaCl和甘露醇胁迫处理下, 水稻中
过表达 LTP 基因株系幼苗的存活率显著高于对照株
系[23]。这些研究结果表明, 虽然 LTP 作用的分子机
制尚不明确, 但其受多种环境胁迫诱导表达的结果
暗示其在植物抗逆过程中可能具有重要作用。
在盐胁迫和干旱条件下, 植物细胞壁和细胞膜
的组成会发生变化[27]。LTP 可能参与胁迫处理下细
胞损伤的修复, 通过增强细胞壁、细胞膜和角质层
结构减少体内水分损失[28]。干旱条件下, 随着烟草
体内 LTP基因表达量的上升植株叶片蜡质积累量也
明显增多, 表明 LTP 参与了蜡质的积累途径[29]。在
胁迫处理下转基因幼苗的耐性高于对照, 且细胞膜
的稳定性也优于对照组, 这可能是因为 LTP 基因的
过表达, 细胞膜上 LTP 活性增强, 促进脂质的运输
使植株叶片蜡质积累, 从而提高植株叶片在胁迫条
件下的保水能力。
还有报道指出, 拟南芥在低温和干旱胁迫处理
下, 转录因子 AtMYB96 能够结合到 AtLTP3 基因的
启动子区域, 激活目标基因从而提高植株对环境胁
迫的抗性[26]。本研究对 TaLTP-s 基因启动子的分析
发现, 其中含有能与 MYB 家族结合的顺式作用元
件(TAACTG) [30-31]。关于 TaLTP-s是否受 MYB家族
成员的转录激活, 并增加植物叶片的蜡质积累和提
高抗逆性, 相关研究正在进行中。
4 结论
从小麦抗旱品种旱选10号中克隆到脂质转运蛋
白基因 TaLTP的2种序列(TaLTP-l和 TaLTP-s), 利用
RIL 群体将 TaLTP-s 定位于染色体1A。两种 TaLTP
的蛋白序列均包含8个半胱氨酸残基骨架 , 属于
nsLTP-like 家族。原生质体的亚细胞定位检测到
TaLTP-s 在细胞膜和细胞质中均有表达。小麦
TaLTP-s 基因在开花期的小花中表达量最高, 其中
在花药的表达量为同期叶片的735倍。小麦 TaLTP-s
受 ABA、低温、高盐和 PEG-6000诱导上调表达。
过表达 TaLTP-s 转基因拟南芥耐盐性显著提高 ,
因此小麦 TaLTP-s 是一个与高盐等非生物胁迫耐
性相关的基因。
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