全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2016, 42(6): 795802 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目 (31171839, 31401385), 山西省青年基金项目 (2015021145), 山西省农业攻关项目 (20150311001-1,
20150311001-5), 山西省农业科学院攻关项目(15YGG01)和北京市农林科学院青年基金项目(QNJJ201428)资助。
This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31171839, 31401385), Shanxi Province Science Foundation
for Youths (2015021145), Shanxi Province Technologies R&D Program (20150311001-1, 20150311001-5), the Technologies R&D Program
of the Shanxi Academy of Agricultural Sciences (15YGG01), and the Youth Foundation of Beijing Academy of Agricultural and Forestry
Sciences (QNJJ201428).
* 通讯作者(Corresponding authors): 畅志坚, E-mail: wrczj@126.com; 郑军, E-mail: zhengjsxaas@126.com
第一作者联系方式: E-mail: qiaoly1988@126.com
Received(收稿日期): 2015-10-20; Accepted(接受日期): 2016-03-14; Published online(网络出版日期): 2016-03-21.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160321.1056.002.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2016.00795
小麦全基因组 NBS 类 R基因分析及 2AL 染色体 NBS-SSR 特异标记
开发
乔麟轶 1,2 常建忠 4 郭慧娟 2 高建刚 5 郑 军 3,* 畅志坚 1,2,*
1 山西大学生命科学学院, 山西太原 030006; 2 山西省农业科学院作物科学研究所 / 作物遗传与分子改良山西省重点实验室, 山西太
原 030031; 3山西省农业科学院小麦研究所, 山西临汾 041000; 4山西省农业科学院旱地农业研究中心, 山西太原 030031; 5北京市农林
科学院杂交小麦工程技术研究中心, 北京 100097
摘 要: NBS (nucleotide binding site)类基因是植物界中最重要的一类抗病基因。用信息学方法从普通小麦(Triticum
aestivum L.)全基因组中分离出 2406条含有 NBS结构的完整蛋白序列, 每条包含 48~2272个氨基酸残基。根据 NBS
结构域两端是否连接 CC或 LRR结构域, 将 TaNBS分为 N、CN、NL和 CNL 4 类。对 TaNBS所在 scaffold 序列的
SSR位点进行诊断, 从 1203条 scaffold序列上发现 2177个 SSR位点, 以二碱基重复位点最多, 占 73.5%。针对小麦
2AL染色体上的 51个 SSR位点开发标记, 缺体–四体和双端体验证结果表明, 有 39个标记(76.5%)为 2AL特异标记,
其中 24个特异标记在抗白粉病材料 Khapli (2AL上携带 Pm4a)和感病材料 Chancellor间存在多态性。利用近等基因
系 Khapli/8*Cc筛选出 3个可能与 Pm4a连锁的 NBS-SSR标记, 分别是 Sxaas_2AL22、Sxaas_2AL39和 Sxaas_2AL46。
本研究开发的与抗病序列紧密连锁的特异 SSR标记可用于 2AL染色体上抗病新基因的检测以及已有抗病基因的候选
序列筛选。
关键词: 小麦; 抗病; NBS类基因; SSR标记; 2AL染色体
Genome-Wide Analysis of TaNBS Resistance Genes and Development of
Chromosome 2AL-specific NBS-SSR Markers in Wheat
QIAO Lin-Yi1,2, CHANG Jian-Zhong4, GUO Hui-Juan2, GAO Jian-Gang5, ZHENG Jun3,*, and CHANG
Zhi-Jian1,2,*
1 College of Life Science, Shanxi University, Taiyuan 030006, China; 2 Institute of Crop Science, Shanxi Academy of Agricultural Sciences / Shanxi
Key Laboratory of Crop Genetics and Molecular Improvement, Taiyuan 030031, China; 3Institute of Wheat Research, Shanxi Academy of Agricul-
tural Sciences, Linfen 041000, China; 4 Institute of Dryland Farming, Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Taiyuan 030031, China; 5 Hybrid
Technology Engineering Research Center of Wheat, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Beijing 100097, China
Abstract: Nucleotide binding site (NBS)-encoding genes are the most important resistance genes (R genes) in plant kingdom. In
this study, 2406 full-length NBS protein sequences, of which single protein varies from 48 aa to 2272 aa, were identified from
wheat (Triticum aestivum L.) genome using bioinformatic method. These TaNBSs were divided into four categories, including N,
CN, NL, and CNL, according to whether the NBS domains connect CC or LRR domains at both ends. Diagnosis results showed
that 1203 of all the scaffolds with TaNBS contained 2177 simple sequence repeats (SSR) loci, 73.5% of which were dinucleotide
repeat sites. Based on the NBS-SSR loci on chromosome 2AL in wheat, we developed 51 molecular markers, and 39 of them
(76.5%) were confirmed as chromosome specific markers using Chinese Spring nulli-tetrasomic and ditelosomic lines. Further-
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more, 24 2AL-specific NBS-SSR markers showed polymorphism between resistant material Khapli carried Pm4a on chromosome
2AL and susceptible material Chancellor. Finally, three 2AL-specific NBS-SSR markers, Sxaas_2AL22, Sxaas_2AL39, and
Sxaas_2AL46, were probably linked to Pm4a gene based on genetic linkage test using Pm4a-NILs (Khapli/8*Cc). These chro-
mosome specific 2AL-NBS-SSR markers can be used to locate novel R genes or screen the candidate sequences for known R
genes on chromosome 2AL.
Keywords: Wheat; Disease resistance; NBS-encoding genes; SSR markers; Chromosome 2AL
小麦是世界的主要口粮作物之一, 是世界第二
大粮食作物。近 40年来, 由于白粉病、锈病等病害
的大面积流行, 小麦生产不断遭到严重威胁。以白
粉病为例, 由于小麦种植密度加大、水肥条件改善
和品种抗源单一等原因, 小麦白粉病从我国西南和
东南沿海局部地区迅速蔓延至全国所有麦区, 发病
面积从 1980 年的 100 万公顷扩展到 2015 年的 570
万公顷(http://cb.natesc.gov.cn/)。1990 年和 1991 年
全国白粉病大爆发分别造成当年 1.44亿千克和 0.77
亿千克小麦产量的损失[1]。抗病品种是有效控制小
麦主要病害的最经济和有效的方法 [2], 也是小麦育
种的重要目标。但是, 随着病原菌的变异和新类型
不断产生, 原有抗病品种逐渐丧失抗性, 使小麦生产
面临新的挑战。因此, 广泛挖掘抗病基因是一项持续
而紧迫的工作, 是选育小麦抗病品种的重要前提。
分子标记选择技术极大地促进了抗病基因的鉴
定, 尤其是简单重复序列(SSR)标记, 因其大量分布
于基因岛和重组热点区域, 且变异常与临近基因的
交换重组密切相关 [3], 从而被广泛应用于小麦抗病
基因的定位。目前, 正式命名并定位到小麦分子图
谱上的抗病基因包括54个抗白粉病基因、74个抗条
锈病基因、73个抗叶锈病基因和57个抗秆锈病基因,
其中有13个基因被成功克隆[4-14]。在已克隆基因中,
Pm3b [4]、Pm3c [5]、Pm3f [6]、Pm3g [5]、Yr10 [7]、Lr1 [8]、
Lr10 [9]、Lr21 [10]、Sr33 [11]、Sr35[12] 10个基因均为
NBS类抗病基因。NBS基因是植物界最重要、家族
成员最多的一类抗病基因, 其编码的 NBS结构域包
含 Kinase1、Kinase2、Kinase3、HD 残基等保守基
序[15], 可通过结合ATP或 GTP来直接或间接引导宿
主细胞产生识别病原体效应, 并参与抗病信号的传
导过程[16]。在单子叶植物中, 一些 NBS结构域的 N
端有时连接有一个与蛋白互作有关的 CC (coiled-coil)
结构, 而 C 端通常连接有一个与病原菌识别相关的
LRR (leucine-rich repeat)结构域[17]。
史静东等[18]曾利用巢式 PCR技术获得 4个小麦
NBS 类抗病基因片段, 并通过群体检测, 证实其中
一个片段与 Yr26共分离。随着小麦测序草图的公布,
在全基因组范围内对小麦NBS基因家族的研究成为
可能。Bouktila等[19]利用普通小麦品种中国春的 454
测序数据[20], 分离了包含 NBS 结构的小麦序列, 然
而这些序列在染色体上的具体位置尚不得知。本研
究利用基于染色体臂分离测序技术的小麦基因组数
据[21], 从全基因组范围内分离了小麦 NBS 序列, 诊
断了序列邻近的 SSR位点, 并在 2AL染色体上针对
NBS-SSR 位点开发分子标记, 筛选出染色体臂特异
标记, 同时利用小麦抗、感材料, 对新开发的标记进
行了多态性分析和抗病基因连锁性检测。本研究结
果丰富了小麦抗病基因的分子标记, 可用于抗病基
因的标记辅助检测以及候选序列筛选。
1 材料与方法
1.1 植物材料
小麦品种Khapli (2AL染色体上携带 Pm4a)由中
国农业科学院作物科学研究所贾继增研究员惠赠 ,
Pm4a 的近等基因系 Khapli/8*Cc 及其轮回亲本
Chancellor (Cc)由中国农业科学院植物保护研究所
周益林研究员惠赠。用于分子标记检测的中国春缺
体–四体材料和双端体材料由美国农业部种质研究
中心惠赠。
1.2 家族蛋白序列的分离
从 URGI数据库(http://wheat-urgi.versailles.inra.
fr/)下载小麦全基因组数据建立 BLAST 蛋白数据库
和核酸数据库。从 Pfam数据库(http://pfam.sanger.ac.
uk/)中下载 NBS 家族(Pfam 登录号为 PF00931)的隐
马尔可夫模型文件, 用 HMM 3.0软件检索本地蛋白
数据库得到目标氨基酸序列, 设置 E≤1e5。
1.3 结构域分析和蛋白序列特征分析
利用 SMART服务器(http://smart.embl-hei-delberg.
de/)对检索结果进行 NBS 蛋白保守结构域的检查,
参数为默认值。筛选得到的序列递交 NCBI的 CDD
数 据 库 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd),
进一步分析与 NBS关联的 CC、LRR等其他结构域
的特征。
用 DNAstar 软件中的 Editseq 工具获得 TaNBS
蛋白的长度信息。用 Clustal X软件进行蛋白序列多
重比对, 参数为默认值, 用 Jalview输出比对结果。
第 6期 乔麟轶等: 小麦全基因组 NBS类 R基因分析及 2AL染色体 NBS-SSR特异标记开发 797


1.4 染色体定位
利用小麦NBS蛋白序列编号在本地核酸数据库
中提取相应的 CDS序列和基因组(scaffold)序列。将
scaffold序列返回本地核酸数据库检索, 获得其在小
麦基因组中的位置信息, 从而将 TaNBS 排列到染色
体上。
1.5 NBS-SSR位点诊断和引物设计
利用 SSRhurnter 软件查找 TaNBS 所在 scaffold
序列的 SSR位点。设定每重复单元碱基数为 2~5, 重
复次数≥5。利用 Primer5软件对 SSR位点设计引物,
由生工生物工程(上海)有限公司合成(表 1)。
1.6 DNA提取和 SSR标记检测
采用 SDS 法提取基因组总 DNA。PCR 总体系
为 15 μL, 含 1.5 μL 10× buffer (TaKaRa)、0.2 mmol
L–1 dNTP、1 U Taq酶(TaKaRa)、0.25 μmol L–1引物
和 100 ng 模板 DNA。反应扩增程序为 94℃变性 5
min; 94℃变性 45 s, 58℃复性 45 s, 72℃延伸 1 min,
36个循环; 72℃延伸 10 min。扩增产物经 8%非变性
聚丙烯酰胺凝胶(Acr 与 Bis 质量比为 29∶1)电泳,
硝酸银染色后观察照相。

表 1 24 对多态性的小麦 2AL 染色体特异标记
Table 1 Twenty-four polymorphic markers specific to wheat chromosome 2AL
引物名称
Primer name
正向序列
Forward sequence (5′–3′)
反向序列
Reverse sequence (5′–3′)
理论产物
Theoretical product (bp)
Sxaas_2AL01 GGCACCATGGATCCAACAAAT CAACTCGTACTTGAGCAGCTT 281
Sxaas_2AL05 GACTCGATGATCACCTTGGT CCAGTCCGTGCCCACGAT 230
Sxaas_2AL06 CAGAGCCTGTCGAAACAGAT CCGTGGAAGCTGTGGTCAT 248
Sxaas_2AL08 CACCACCAAAGGTAAGTTCTGT CCGGTGAACATTGTTTGAACAT 401
Sxaas_2AL09 GTCTTCGTAGTCGACGTTGA GGAGGAATGGAGAAACTTACA 234
Sxaas_2AL11 CGCTGTCTCTTGAACAAGAT CATCTTCAGAGCCAAACACT 287
Sxaas_2AL16 GCACCCTGAGAATGCACAT GTCTGAACTCACAAGCTCCT 338
Sxaas_2AL17 GGTCCTTCCTGATGGTCGT CCGATACAACAAAGAGTCCAA 309
Sxaas_2AL18 CCCAGCATTGGACTCTTTGT CCCCAAGTACCTATCCAGTT 337
Sxaas_2AL22 GCATGTCCAGGCATGTGTAT GACAGTCCTTGCTTGCCATT 341
Sxaas_2AL23 CCGTCAGATCTGTTCCTTCT GGTGGTGGGTTTCTGTGAAT 352
Sxaas_2AL25 CACCCTTGCCTGGATTCCT CTGCTGCTTCTTTGGTCCAT 338
Sxaas_2AL26 CAGCTTTGTTTGCACCTGAT GGACGTTTGACATGTGTTGT 294
Sxaas_2AL27 CCCACCATCCGTTTCTTGTT CAGTGGAACAAGACTTGATGT 328
Sxaas_2AL28 GGCAAACCTGGTATGAAGGT CTCAGGCACGCGAACTACT 291
Sxaas_2AL32 GAGCAGCAGAAGAACAGGAT GGACAGACAGCCTGTGATTT 416
Sxaas_2AL37 GCATGCGTTCATGCGTCTTGT GAACGGAGGGAGTACTACTT 374
Sxaas_2AL39 CTGAGATCTAACCACACCTTT GATGACATCGACAACAAGGAT 251
Sxaas_2AL41 CCGACGTCGAGAGAGACAAT GGTCGATGGCATCCTCCAT 282
Sxaas_2AL43 CGGAGGTGCTCGTATGGAT GGTCCTTTGCTCCACCACT 216
Sxaas_2AL44 CTGCTTCCGTGGAGTATCCT GCCCATGGCAGACATGATCT 238
Sxaas_2AL45 GTTGGTGATTCCATCTTTGCT CATGCAATGTACTCCCTCTGT 305
Sxaas_2AL47 CAACCTGATGAAGAGAGCACT GCCAGCTATAGCCTTGCTAT 308
Sxaas_2AL48 CCAGCATAGGCTTAACCTAGT GTCTAGAAACCACGTAGAGGT 317

2 结果与分析
2.1 小麦 NBS 家族基因的染色体分布和结构分
类
利用NBS隐马模型文件在小麦本地蛋白数据库
检索, 并检测检索结果, 获得 2406条含有 NBS结构


的完整蛋白序列, 分布于小麦基因组 21条染色体上,
以 B 基因组比率最高(37.4%), 其次是 A 基因组
(34.3%), 而 D基因组最低(28.3%); 从单个染色体看,
在 4A 染色体上分布最多, 达 248 条, 而在 4D 染色
体上分布最少, 仅 24条(图 1)。
798 作 物 学 报 第 42卷



图 1 小麦 NBS 序列的染色体分布
Fig. 1 Distribution of NBS sequences on chromosomes in wheat

分离出的 TaNBS 序列长度差异较大, 最短的序
列 Ta1asLoc007418只有 48个氨基酸残基, 最长的为
Ta7blLoc002272, 有 2272 个氨基酸残基。根据是否
包含 CC 和 LRR 结构域, 将 2406 个 TaNBS 序列分
为 4类, 分别是 CC-NBS-LRR、NBS-LRR、CC-NBS
和 NBS, 其中只具有 NBS 结构的 TaNBS 最多, 有
1209条, 占总数的 50.2% (图 2)。

图 2 小麦 TaNBS 序列的结构分类
Fig. 2 Structural classification of TaNBS protein sequences

2.2 小麦 NBS-SSR位点诊断
从本地核酸数据库中提取 TaNBS 的 CDS 序列
和基因组(scaffold)序列, 查找所在 scaffold 序列的
SSR 位点, 在其中的 1203 条 scaffold 序列上共检测
到 2177个 SSR位点, A、B、D基因组分别占 33%、
40%和 27% (图 3-a)。其中二碱基重复位点最多, 占
73.5%; 五碱基重复位点最少, 仅 0.3% (图 3-b)。
2.3 2AL染色体上 TaNBS序列特征分析
将位于 2AL上的 56个 TaNBS蛋白序列多重比
对的结果显示, 一些 TaNBS 序列与已克隆抗白粉病
基因的NBS结构域有高度相似的基序(图 4), 如用于
结合 ATP/GTP 的磷酸结合环 P-loop (GGV/LGKTT),
以及 Kinase2 (VLDDVW)、Kinase3 (GSxxLA/VTTR)
和末端 HD残基。推测这些 TaNBS蛋白也可能具有

图 3 小麦全基因组 NBS-SSR 位点诊断
Fig. 3 Genome-wide diagnosis of NBS-related SSR loci
in wheat

类似的抗病作用。
2.4 2AL染色体 NBS-SSR标记开发及检测
在小麦 2AL 染色体上 56 个 TaNBS 所在的基因
组序列片段中, 共有 25个 scaffold存在 NBS-SSR位
点, 通过比对 2AL 基因组数据获得的位置信息, 将
这 25个 scaffold在 2AL染色体臂上线性排列(表 2)。
在这些基因组片段中共检测到 52个 SSR位点, 除了
位于 Sca1697100 起始端口的重复位点(TG)5 以外,
对其余 51个 SSR位点的侧翼序列分别设计引物, 依
次命名为 Sxaas_2AL01~Sxaas_2AL51。
对 51个 2AL-NBS-SSR标记进行特异性筛选, 有
39个标记在缺体–四体 N2BT2A、N2BT2D、N2DT2A、
N2DT2B和中国春中均扩增出目标带, 而在 N2AT2B、
N2AT2D 和双端体 Dt2AS 中没有目标带, 表明这些
NBS-SSR标记为 2A染色体长臂特异标记。
利用抗病品种 Khapli 及其 Pm4a-NIL 群体、
感病轮回亲本 Chancellor, 对39个2AL-NBS-SSR
特异标记检测发现 , 24个标记 (表1)在 Khapli 和
Chancellor 中的扩增产物存在差异, 表明这些特异
第 6期 乔麟轶等: 小麦全基因组 NBS类 R基因分析及 2AL染色体 NBS-SSR特异标记开发 799



图 4 小麦 2AL 上部分 TaNBS 结构域多重序列比对
Fig. 4 Multiple alignment of some TaNBS sequences on chromosome 2AL

表 2 小麦 2AL 染色体上 52 个 NBS-SSR 位点
Table 2 Fifty-two NBS-SSR loci on chromosome 2AL of wheat
基因
Gene
基因组序列 a
Scaffold a
基因组位置
Location
简单重复序列位点
SSR locus
设计引物
Primer
Ta2alLoc009654.1 6343923 2A: 5779578–5781802 (GA)5/(CG)5 Sxaas_2AL01, 02
Ta2alLoc000512.1 1697100 2A: 10834948–10835121 (TG)5 —
Ta2alLoc025893.3
Ta2alLoc025895.1
6426820 2A: 29548844–29549052 (TA)10 Sxaas_2AL03
Ta2alLoc021676.1 6404434 2A: 42094351–42102467 (AG)5/(GCC)5 Sxaas_2AL04, 05
Ta2alLoc019062.3
Ta2alLoc029872.3
Ta2alLoc029875.1
6437327 2A: 101906864–101908029 (CAC)5 Sxaas_2AL06
Ta2alLoc023455.4 6414337 2A: 112893910–112894121 (GA)23/(TA)5/(TA)5/(CT)14/(CT)7 Sxaas_2AL07, 08, 09
Ta2alLoc008041.2 6335704 2A: 156632258–156633095 (GT)5/(TG)5/(CA)5/(AT)5 Sxaas_2AL10, 11
Ta2alLoc016727.1 6379425 2A: 173426980–173427745 (AGG)6/(GT)5/(TG)7/(AT)6/(GA)11 Sxaas_2AL12, 13, 14, 15, 16
Ta2alLoc015149.1 6371585 2A: 176293020–176293512 (CGT)5/(TTC)5/(GA)15 Sxaas_2AL17, 18, 19
Ta2alLoc026934.2 6432253 2A: 204235551–204252228 (TG)5 Sxaas_2AL20
Ta2alLoc030512.1
Ta2alLoc030513.2
6438431 2A: 204904116–204910050 (AT)8/(AT)5 Sxaas_2AL21
Ta2alLoc030241.6 6437944 2A: 222226094–222240713 (GCA)5/(TC)5 Sxaas_2AL22, 23
Ta2alLoc027083.3 6433075 2A: 229604727–229605897 (GGC)6/(AAAG)6/(TA)5 Sxaas_2AL24, 25, 26
Ta2alLoc012596.1 6358826 2A: 230227044–230227319 (AC)5 Sxaas_2AL27
Ta2alLoc018417.6 6387975 2A: 230466687–230467222 (TGCA)5 Sxaas_2AL28, 29
Ta2alLoc031092.1
Ta2alLoc031098.1
6439430 2A: 236668841–236699200 (TC)8/(CA)6/(CA)9/(AGG)6/(GCTC)5/
(CTT)6/(AC)5
Sxaas_2AL30, 31, 32, 33, 34
Ta2alLoc016919.1 6380483 2A: 241196735–241208359 (CT)5/(TC)5 Sxaas_2AL35
Ta2alLoc030114.3 6437747 2A: 248990159–248990922 (TCT)5/(TG)5/(TA)5 Sxaas_2AL36, 37, 38
Ta2alLoc004920.1 6318795 2A: 249524107–249526099 (AT)8 Sxaas_2AL39
Ta2alLoc020734.2 6399506 2A: 249952381–249972490 (TC)12/(GC)6/(GA)6 Sxaas_2AL40, 41, 42
Ta2alLoc019101.1 6391289 2A: 250266464–250294890 (TG)5/(AG)6/(CAA)8 Sxaas_2AL43, 44, 45
Ta2alLoc016870.1 6380185 2A: 254088542–254105297 (TG)9/(TC)9 Sxaas_2AL46, 47
Ta2alLoc010641.6 6348655 2A: 254102737–254103403 (CT)7 Sxaas_2AL48
Ta2alLoc022307.2 6407659 2A: 254590476–254590882 (CA)5/(AC)6 Sxaas_2AL49, 50
Ta2alLoc002192.2 4144983 2A: 254877344–254883335 (GT)34/(AT)5 Sxaas_2AL51
a粗体表示含有多个 NBS基因。a Bold scaffold indicate more than one NBS gene.
800 作 物 学 报 第 42卷


标记在抗、感材料间具有较好的多态性 , 其中
Sxaas_2AL22、 Sxaas_2AL39 和 Sxaas_2AL46 在
Pm4a-NILs 中的扩增条带与 Khapli 中的一致, 表明
这 3个标记很可能与 Pm4a连锁(图 5)。

图 5 Sxaas_2AL22、Sxaas_2AL39 和 Sxaas_2AL46 的特异性及
与 Pm4a的连锁性检测
Fig. 5 Detection of chromosome specificity and the genetic
linkage with Pm4a in Sxaas_2AL22, Sxaas_2AL39, and
Sxaas_2AL46
Pm4a-NIL-1和-2为近等基因系中随机取的 2个单株;
箭头指示多态性条带。
Pm4a-NIL-1 and -2 are two individuals randomly taken from
Pm4a-NILs. Arrows show polymorphic bands.

3 讨论
3.1 小麦 NBS家族概况
NBS 类基因在苔藓植物、石松植物、裸子植物
和被子植物中均有相关研究报道[17], 是植物中数量
最多的抗病基因家族。而小麦作为世界上最重要、
种植最广的农作物, 常年遭受白粉菌、条锈菌、叶锈
菌、秆锈菌及赤霉菌等病原菌的侵染, 深入研究小麦
NBS类基因对于减少小麦产量损失显得尤为重要。
本研究从小麦基因组中分离出 2 4 0 6个完整
TaNBS 序列, 数目远高于粳稻的 653 个[22]、籼稻的
553 个[22]、大豆的 319 个[23]、高粱的 211 个[24]以及
玉米的 109 个[25]。我们还分别从乌拉尔图小麦和粗
山羊草的基因组中分离出 681条和 946条 NBS序列
(结果未列出), 由此初步推测, 普通小麦 TaNBS家族
是由其 3个亚基因组供体物种的 NBS家族通过两次
多倍体化事件整合而来。此外, 在 TaNBS 中还存在
多个 NBS 基因位于一个 scaffold 上的现象, 仅 2AL
染色体上就有 8个这样的基因簇(部分见表 2), 推断
TaNBS 家族可能还经历了串联重复事件, 最终造成
小麦基因组中 NBS庞大的成员数目。然而同一同源
群中各染色体上的 NBS 数目并不相近, 如 4A 染色
体上有 248个 TaNBS基因, 而 4B和 4D上分别只具
有 40 个和 24 个, 这可能由于六倍体小麦基因组复
制而造成大量基因的功能冗余 , 因此冗余的部分
TaNBS 基因将会变成假基因或者逐渐丢失, 最终形
成各基因组间基因数目的不同现象。
TaNBS蛋白包含 NBS的 4个特征基序, 根据两
端是否连接 CC或 LRR结构域, 可将其分为 N、CN、
NL 和 CNL 四类, 已克隆的 10 个小麦 NBS 类抗病
基因均为 CNL结构[4-12]。一些 TaNBS还包含其他类
型的结构域, 如 Ta1blLoc007763、Ta2bsLoc001037
和 Ta3alLoc007069 等包含 STK (serine/threonine
kinase)结构; Ta2bsLoc003709和 Ta2bsLoc014737等
包含 ABC (ATP-binding cassette)转运蛋白结构 ;
Ta2alLoc020734、Ta2dlLoc021209 和 Ta6bsLoc009346
等包含 Jacalin结构; Ta2alLoc012596、Ta2blLoc002392、
Ta5dlLoc013799 和 Ta5dlLoc017355 等包含锌指结
构。其中 STK 结构域和 ABC 转运结构域分别是
Pm21和 Lr34的功能域[13-14], Jacalin结构域和锌指结
构域也被证实与小麦抗病性有关[26-27]。这些结构域
通常与 NBS 结构域互相作用, 共同抵抗病原菌的入
侵。类似研究已有报道, 如拟南芥中 RRS1 蛋白的
NBS域 C端连接一个 WRKY结构域, 该 WRKY结
构域在拟南芥对青枯菌的响应通路中起抑制作用 ,
与 NBS结构域一起形成独特的抗病机制[28]。因此下
一步有必要对这些包含其他类型结构域的 TaNBS深
入研究。
3.2 NBS-SSR 特异标记在基因定位及分子育种
中的应用价值
广泛发掘、鉴定抗病基因是小麦抗病育种的基
础, 在抗病基因定位过程中应用最广的分子标记是
SSR标记。然而普通小麦包含 A、B、D 3个基因组
和高比例的重复序列(80%) [21], 常规 SSR 标记在小
麦染色体间存在多位点现象, 很可能造成定位结果
的偏差。本研究以小麦 2A 染色体长臂为例 , 对
TaNBS基因所在 scaffold上的 51个 SSR位点设计引
物 , 通过缺体四体和双端体材料筛选 , 有 39个
(76.5%) SSR标记具有染色体特异性, 且具有良好的
多态性。目前我们正在用作图群体将这些 NBS-SSR
特异标记定位到小麦遗传图谱, 而小麦 2AL上存在抗
白粉病基因 Pm4a [29]、Pm4b [30]、Pm4c [31]、Pm4d [32]、
Pm50 [33], 抗条锈病基因 Yr1 [34]、Yr32 [35], 抗叶锈病
基因 Lr38 [36]和抗秆锈病基因 Sr21 [37]等多个抗病基
因位点, 其中 Sr21 所在区段更是与短柄草和水稻染
第 6期 乔麟轶等: 小麦全基因组 NBS类 R基因分析及 2AL染色体 NBS-SSR特异标记开发 801


色体上的 NBS 基因簇同源[37], 因此 2AL-NBS-SSR
特异标记的开发对上述基因的精细定位以至克隆有
重要的参考价值。另外本研究从小麦全基因组中共
诊断出 2177 个 NBS-SSR 位点, 通过特异性筛选和
群体遗传定位, 预计可开发出 1000余对位置明确、
染色体特异的 NBS-SSR标记, 这将显著减少小麦抗
病基因定位过程中存在的误差。
目前, 在小麦中被正式命名的各类抗病基因将
近 300 个左右, 其中只有少数几个被用于生产, 大
部分抗病基因在未用于育种之前就有可能因病原菌
变异而面临失去抗性的危险。真正利用分子标记辅
助选择(marker-assisted selection, MAS)育出的小麦
抗病品种鲜有报道, 一个很重要原因就是分子标记
与目标基因距离较远, 造成MAS过程中分子标记与
目标基因重组, 导致标记跟踪信息丢失。虽然基于
小麦基因组测序数据已开发出高密度、高精度的
SNP 芯片, 但费用较高, 暂时不适合用于育种过程
中的大群体筛选。本研究从提高常规分子标记的精
准度入手, 开发的每个 SSR标记均与小麦 NBS序列
位于同一条 scaffold 序列上, 当某个 TaNBS 被确定
与抗病性相关时, 其最近的 NBS-SSR标记与之紧密
连锁, 几乎不发生重组, 可以作为共分离标记使用,
将提高育种过程中 MAS的效率。
4 结论
从普通小麦基因组中分离出分布于各染色体的
2406条含有 NBS结构的完整蛋白序列, 按结构分为
N、CN、NL和 CNL共 4类, 每条序列包含 48~2272
个氨基酸残基。在 TaNBS所在基因组序列中的 1203
条 scaffold序列上诊断出 2177个 SSR位点, 其中二
碱基重复位点占 73.5%。针对小麦 2AL 染色体上的
51个 NBS-SSR位点开发标记, 筛选出 39个 2AL染
色体特异标记, 包括 24个在抗白粉病材料 Khapli和
感病材料 Chancellor 间存在多态性 , 其中 Sxaas_
2AL22、Sxaas_2AL39和 Sxaas_2AL46可能与 Pm4a
连锁。

致谢: 北京安贞医院 /北京市心肺血管疾病研究所
李小燕博士在信息学分析中给予了宝贵指导, 谨致
谢忱。
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