全 文 ：第 卷
年
第 期
月
武 汉 位 一 研 究
影响绿豆下胚轴原生质体遗传转化的因素
李 学 宝 白永延 卫志明 许智宏
华中师范大学生物系 武汉 中国科学院上海植物生理研究所 上海 。。。
提 共 采用共培养法和 法将外源基因导入绿豆下胚轴原生质体中 , 得到转化愈伤
组织 。 根癌农杆菌经 乙酞丁香酮等诱导物质以及低 、 低 飞一 预培养后 , 细菌 一
的转移受到促进 , 基 因 表达活性明显提高 。 在 介导的绿豆 原生质体 转 化中 ,
高 “ 有利于外源 转移到植物细胞 , 活性 较高 。 此外 , 质粒 浓度
和启动 子类型 均对外源基 因的转移和表达有一 定影响 。
关扭询 绿豆 , 原生质体培养 , 转化 , 瞬间表达
如何提高外源基因转移到植物细胞的频率是植物基因工程中普遍关注 的问题 。 近年
来 , 人们以 多种植物为材料 , 研究 了影响植物细胞转化的因素 , 以期阐明提高转化效率
的途径和方法 〔, 一 ‘ 〕。
绿豆的再生培养十分困难 , 因而其遗传转化的研究一直进展不大 。 本文以绿豆下胚
轴原生质体为材料 , 探讨 了 农杆菌介导和 介导 的 外源 人 转移到 绿豆细 胞 的条
件 , 并筛选出转化愈伤组织 。
材料与方法
绿豆下胚 抽原生 质体分 离与培养
选取饱满 的绿豆 ” 种子 , 用 表面 消毒 ,
无菌水冲洗数次 , 置 。 培养基上 弓℃ 萌发 天 , 取下胚轴并横切成约 厚 度
的薄片 , 放入 一 溶液 溶液 ‘ , 含 甘露醇 一 小时 。 待细胞 质 壁
分 离后 , 再移入含 一 , 一 ,
的 一 含 甘露醇 酶液中 , 于往复式摇床上酶解 一 小时 ,
℃ 。 用 目尼龙筛网过滤含原生质 体的酶液 , 离心 分钟 , 收集原生质 体 。
原生质体经 一 含 蔗搪 溶液漂浮 , 一 溶液洗涤 一 次后 , 悬
浮于 液体培养基 含 , 一 , , , 葡萄搪
中 , 调 整密度到 一 丫 , 液体浅层培养 。
。 根痊 农杆菌和质杜
根癌农杆菌为 ‘。 和 一 。前者质粒上带有 和
基因 , 仅在真核细胞中表达 。后者质粒上带有 , 基因和 号基因 与细胞分裂素合
本文于 】 年 月 日收到 , 同年 月 日收到修改稿
武 汉 植 物 学 研 究 第 卷
成有关的异戊烯基结构酶基因 。 直接导入试验所 用质粒为 和 ,
均带有 基因 。 具有 和 嵌合启动 子。 上述菌株和质粒 由白永延先
生实验室提供 。
根 癌 农杆 菌的培养及 区基 因的诱导活 化
挑取单个菌落 , 接种在约 液体培养基中 , 振荡培养 , ℃ 一
天 。 待细菌密度 约达 , 一 , 时 , 离心收集细菌 。 将细菌重新悬浮于 一 修改
的 诱导培养基【”中 , 振荡培养 , 一 、场
一
后 , 用于原生质体的感染和转
化 。诱导培养基采用不同的 值 一 , 正常的磷酸浓度 或低磷
酸浓度 , 添加 乙酞丁香酮 一 召 , 胭脂碱 。一 产 “ 。
转化 方法
原生质体一 农杆菌共培养法 绿豆原生质体培养 小时后 , 加入经诱导培养的根癌农
杆菌 , 共培养 一 小时 。 用 一 溶液 离心洗涤原生质体冉生细胞 一 次 , 除去
游 离细菌 。 洗涤后 的原生质体再生细胞继续墙养在 。 液体培养基 添加头抱 氨唾肘钠
拼 中 , 约 天后 , 形成大量细胞团 。 此时 , 添加不 含激素的 细胞培 养基
含 蔗糖 , 以降低渗透压和激素浓度 。 小愈伤组织长至 大小时 , 转移到含
氧霉素 召 的 琼脂培养基 不 含激素 上筛选转化体 。
介导的 直接转化 参照 等〔”和 等 ’ 的方法 。 取 新
分离的原生质 体 悬浮液 , 加入 产 小牛 胸腺 , 一 产 质 粒 和 。
魂。 溶于 。, , 甘露 醇和 一
· 的融合培养基 , 一 , 终浓度为 。 原生 质体保
温 ℃ 分钟后 , 分 次逐步加入 融合培养基 , 每次间隔 分钟 。 离心
收集原生质体 , 用 一 溶液洗涤 一 次 。 将原生质体重新悬 浮 于 液体培养基
中 , 暗培养 ℃ 小时后 , 检测 活性 。
活 性浏 定
参照 “ 〔吕 的方法 。 离心收集原生质体再生细胞 , 加入 抽提缓冲液 。 抽
提缓冲液 的组成为 。 , 夕一琉基 乙醇 ,
“ , , 一 。 细胞经机械或超声波破碎后 , 离
心 除去碎片 。 取 解 上清液 , 加入 拜 一 甲基伞 形酮酞
一 声一 一葡萄糖昔酸 , 溶于抽提缓冲液中 , ℃条件下保温 一 分钟 , 再加入 。
二 终止反应 。 在 激发光下检测 发射 荧光 。 配制 一
一 甲基伞形酮 溶液 , 制作标准曲线 。 蛋 白质 含量用考马斯亮蓝法测定 。
。 月目月旨碱分析
按许耀等 〔”介绍 的方法 。 愈伤组 织在 含 “ 精氨 酸 “ 一 酮戊 二酸的
。 培养基上预培养 小时后 , 加入等体积的 乙醇 , 研磨 成浆 。 室温 下放 置浸提
小时 , 离心除去沉淀 。 取上清液点样于 “ “ 层析纸上 , 电泳 , 稳压 小时
左右 。 电泳完毕后 , 层析纸用 菲醒 染 色液染色 , 紫外灯下观察并照相 。
实睑绝果
。 影响根癌 农杆菌介导的绿豆 原生质体转化 的 囚素
第 期 李学宝等 形响绿豆下胚轴原生质体遗传转化的因素
根癌农杆菌 , 经诱导培养后 , 感染绿豆下胚轴原生质体 。 原生质体
一 细菌共培养 一 小时 , 检侧 基因在绿豆原生质体中的瞬间表达 。 试 验结果 表
表明 , 适 当降低 诱导培养基的 值 , 对 活性表达有促进作用 。 通 过 方 差 检
验 二 。, 证明不 同 值 的细胞 活性存在显著性差异 。
时 , 活性最高 。 若同时降低 孟一 含量 , 效果更明显 , 表明低 、 低 叭
有利于 一 转移 。 乙酞丁香酮 等 多酚 类物 质能 够诱 导农 杆菌 基 因 活
化〔‘ ’一“ , 在诱导培养基中添加 一 产 的 能较大幅度地提高 活性 。 对
表 的资料进行方差分析表明 , 不 同浓度 的 处理之 间的 活性 存在显 著性 差异
衰 诱导培养谷 位 , 尾一 和 , 浓度对 活性的影晌
,
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一
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三次重复试验的平均值二
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浓度对 活性的形晌
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终浓度 乡‘, 小牛胸腺 卜 二 ,
质粒 林 。
二 三次重复试脸的平均值 。
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卜 。
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衰 粒质 加入 及启 动子类型对
缘豆细脸 活性的 晌 ’
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质粒加入盆 卜 二 活性 蛋白
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三次重复试脸的平均值
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第 期 李学宝等 形响绿豆下胚轴原生质体遗传转化的因素
根癌农杆菌 , 经诱导培养后 , 感染绿豆下胚轴原生质体 。 原生质体
一 细菌共培养 一 小时 , 检侧 基因在绿豆原生质体中的瞬间表达 。 试 验结果 表
表明 , 适 当降低 诱导培养基的 值 , 对 活性表达有促进作用 。 通 过 方 差 检
验 二 。, 证明不 同 值 的细胞 活性存在显著性差异 。
时 , 活性最高 。 若同时降低 孟一 含量 , 效果更明显 , 表明低 、 低 叭
有利于 一 转移 。 乙酞丁香酮 等 多酚 类物 质能 够诱 导农 杆菌 基 因 活
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表 的资料进行方差分析表明 , 不 同浓度 的 处理之 间的 活性 存在显 著性 差异
衰 诱导培养谷 位 , 尾一 和 , 浓度对 活性的影晌
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第 期 李学宝等 影响绿豆下胚轴原生质体遗传转化的因素
转化 愈伤 组 织 的 筛选和胭 脂碱 分析
经农杆菌 , 感染后 的原生质体培养在 ‘ 液体培养基中 , 细胞持续分
裂 , 形成小细胞团 。 此时 , 若将其移入无 激素的 ‘ 液体培养基中 , 不能继续生长 , 最
后全部死亡 , 未能筛选到转化体 。 在原培养基中添加一定量的无激素培养基逐步降低激
素浓度 , 大多数细胞团能够继续发育成小愈伤组织 。 将愈伤组织转移到 选择 培养
基 含 产 氯霉素 上 , 多数慢慢褐化死亡 , 仅极少数继续生长 图 。 用纸
电泳检测 到胭脂碱合成酶活性 图 , 表明其是转化组织 。 无论在无激素或不同激素
组合的培养基上 , 这种激素 自主型愈伤组织均未能分化出芽 。 这与有关基因 促进芽分
化的报道〔‘ ’不一致 , 说明植物种类不同 , 其再生条件有较大差异 。
讨论
研究表明 , 根癌农杆菌与某些植物共培养时 , 宿主细胞能够产生多酚类物质 , 诱导
细菌 区基因表达 , 促使 一 向宿主细胞转移 〔“ 一 ’‘ 。 据此 , 一些研 究者利 用可
能 的诱导物质预处理农杆菌 , 获得较为满意 的结果 ”‘ ”‘ 。 本文结果也证明 , 用 等
预培养细菌时 , 外源 基因在 值物细胞 内的瞬间表 达活性可随 之提高 , 低 和低
吐 一 也有相同的作用 〔‘’, 从而 间接证明了 及低 至一 能够诱导活化 基 因 ,
促进 一 向植物细胞 内转移 。
介导的转化是应用较为广泛 的基因转移方法之 一 。 浓度 、 、 扩 十 浓度
均对外源 向细胞 内转移有一定 的影 响〔 ” ’‘ ”实验表 明 , 较 高的 值相 ‘ ’ 浓度
促进质粒 进入绿豆原生 质 体 , 有
一
利于细胞转化 。 有夫启动子对基因表达 的作用 ,
已有一些研究 〔“ 一 ’。 据 “ 等 〔“ 报道 , 启动子与 启动子 嵌合能 提高基因
表达活性 一 倍 。 但是 , 我们在实脸中仅看到 , 当外源 浓度较低时 , 嵌合启动子
质粒 的 表达活性较 有所提高 。 而 当外源 到 浓度较 高时 , 二
者差异不明显 , 可能与试验中所用植物种类有关 。
有人 曾认为 , 利用与细胞分裂素合成有关的基因 是解决某些植物再生困难的可能
途径之一 〔“ ”‘ ’。 然而 , 我们 的试验结果表明 , 基因 并不能诱导 绿豆原生质 体来源 的
转化愈伤组织出芽 。 有关绿豆原生质体培养 的再生条件 , 尚待进一步探讨 。
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武 汉 植 物 学 研 究 第 卷
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