全 文 ：第沁 卷 第 4期
诊91 年止月
复 旦 学 报 (自然科学版 )
Jo u ra n lo f Fu da nU ni ve rs i ty ( N
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19 9 1
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刀豆 (ca na , a ZI玄a e n s汀o r m is )叶肉
原生质体培养与植株再生
严 成其 边 自雄
(宁波农业科学研究所 )
张冬生 杨金水 葛扣麟
(复 旦 大 学 ,
色卜协 提 要
用刀豆原生质体为材料 , 从培养分化开始 , 经过无菌苗的培养 、 酶解 、 原生质
体分离 、 原生质体培养及愈伤组织培养五个阶段 , 长成完整植株 , 整个周期为
21 7 d
. 本文对整个培养过程 中的条件作了详细探索和讨论 .
关健词 : 刀 豆 , 原生质体培养 , 胚 , 植株再生 .
砂
,
0 引 言
豆科植物是种子植物的第三大科 , 其用途不亚 于禾本科 , 因此 , 对豆科植物的研究具
有重要的理论与实践意义 . 1 9了4 年 G a二 b or g 首次对豆科植物原生质体进行培养试验 l[ ’ ,
1 9 8 0 年高国楠等人的非籽粒用豆科植物首着原生质体绿苗分化成功 〔 2 , , 尔后相继有自三
叶草 、 猪屎豆属印度麻 、 牛角花和百脉根 〔 8一 。〕等植物原生质体培养获得胚状体或植株再
生 . 但在籽粒用豆科植物中 , 至今只有赤豆 lo[ 〕和大豆 〔’ ` 〕的原生质体绿苗分化成功 .
刀豆是重要的经济和蔬菜作物 [` 幻 , 刀豆原生质体培养诱导植株再生 , 一直为 国内外
学者所关注 ,但一直未获成功 . 本文以 刀豆原生质体为材料 , 通过无菌苗的培养 、酶解 、原
生质体分离 、原生质体培养 、愈伤组织培养五个阶段 , 成功地分化成完整植株 .
尹
1 材料与方法
1
.
1 无菌苗培养
黑粒刀豆 ( aC 、 。 不乙t’a 。、 汀。: , 耘 ) 原产宁波四明山 . 种子用纱布包扎 , 经洗涤精搓
洗 30 功 in 后用 自来水冲洗 3 h , 再用 70 拓 乙醇浸抱 2仍 in , 0 . 1那的 H g 1C 2 消毒 20 m 祖 ,
收稿 日期 : 19 加 年 12 月 10 日 .
DOI : 10. 15943 /j . cnki . f dxb -jns . 1991. 04. 004
8 32 复 旦 学 报 (自然科学版 )第 30 卷
最后用无菌水漂洗 4 或 5次 . 种子在有 M S固体培养基的试管内发芽 , 每管 2 粒 , 培养
时光照强度为 1 5 0 0 l x , 每天光照 12 h , 温度为 2 6 o C .
1
.
2 原生质体分离
将培养 18 d 的刀豆无菌苗复叶剪成 1 或 Z m m 的碎片 , 每克加入 10 m l 酶掖酶解 .
酶 解 液 为 内 含 1 1拓 m a n n t o l 的 C PW ( 2 7 · 2 m g / L K H : P O ` , 0 . 1 6 m g / L K l (碘 化
钾 ) , 2 4 0 m g / L M g S O ` · 7 H : 0 , 4 8 0 m g / L aO o l: · ZH : 0 . 1 0 1 m g /L K N O s , 0 . 0 2 5 m g /L J
uC S O
` · 5丑夕 ) , p H S . 8 ;其中离析酶和果胶酶的浓度均为 0 . 5拓 , 纤维素 醉的浓 度如表 1
所示 . 材料在 26 ℃酶解 2 h 后 , 经 1。。 “ m 孔径的镍丝网过滤 , 5 0 O r /` in 离心 3功 in .
用内含 20 男蔗糖的 C P W 漂浮洗涤原生质体 , 再用 含 13 拓甘 露 醇 的 C P W 离 心 洗 涤
3 次 , 最后用 D aZ , M S , B S B 三种基本培养液进行原生质体培养 . 三种培养掖均含 0 . 2
m g / L 6 B A ( 6
一节氨基嗓岭 ) , o . s m g / L N A A (a 一茶 乙酸 ) , 。 . s m g/ L 2 . 4一 D ( 2 . 4一二 氯
苯氧乙酸 ) , o . s m g / L K T (激动素 ) , 。 . s m g / L Z T (玉米素 ) , 8 0 林g / L L H (水解乳蛋
白 ) ; p H 5 . 8 . 原生质体悬浮液中细胞密度为 1 x 10 .个 /m .l
1
.
3 原生质体培养
原生质体培养的方法有三种 : ①悬浮培养法 , 吸 1~ 2 m l 的原生质体置于培养瓶内
( V 二 60 x 30 x Zc m m . ) ,②双层培养法 , 在用 l ~ 2 m l 琼脂原生质体培养基铺成薄板的表
面滴加 1~ Z m l 相应成分的原生质体悬浮液 ,③混合培养法 , 用 1一 Z m l 未凝固的琼脂培
养基与 l ~ Z m l相应的原生质体悬浮液混合 , 使原生质体均匀散布于琼脂培养基内 后 在
26
O
C凝固 . 在光照强度为 2 0 lx 的条件下培养 24 五 ,每 2 周加 1 m l 新鲜培养基 .
1
.
4 愈伤组织的扩增与分化培养
当原生质体持续分裂形成直径为 3 m m 左右的小愈伤组织时 , 就转入 p H S . 8 的 M S
(内含 3 m g / L 2 . 进一D , 0 . s m g / L 6 B A , 8 0 0 协g / L L H )或 D Za (含 2 . s m g / L 2 . 4一D , l m g / L
6 B A, 80 0林 g L/ L H )琼脂培养基中培养 . 愈伤组织 20 d 继代一次 ,经多次扩增长至 s m m -
大小后就转入分化培养基中 . 交叉使用 M S 和 D Z。 分化培养基 , 每隔 1 5 d 交换一次 , 两
者均含 8 m g / L 6 B A , o . 3 m g / L N A A , o . 3 m g,/ L I A A (叫噪乙酸 ) 和 80 。 妙g / L L H ; .
p H S
·
8
. 生根培养基为内含 。 . 3 1 9 /L I A A 和 1 00 林g/ L L H 的 M S , P H S . .8
添 猫
每J 弓
耘
2 结果与讨论
2
.
1 刀豆叶肉细胞原生质体分离
刀豆叶肉细胞原生质体的分离一般并不困难 , 当离析酶和果胶酶浓度为 。 5%时 , 其 -
产量随所用纤维素酶浓度变化而异 (表 1 ) . 当纤维素酶浓度增至 1 . 4另~ 1 . 6肠时 , 原生
质体产量达最高峰 , 但当纤维素酶浓度增至 1 . 8% 以上时细胞则开始破裂 . 可见 适于刀 ;
豆原生质体分离的纤维素酶浓度变化幅度较狭 . 酶解液 p H 值以 5 . 6~ 5 . 8 最好 , p H 值 .
大于 5 . 8 或小于 5 . 6 都不利于获得优 良的刀 豆叶肉细胞原生质体 .
将不同时期不同部位的刀豆幼苗组织 , 如子叶 、真叶 、 复叶和茎 , 分别进行酶解比较 .
结果表明复叶为最好 .
、
第 4期 严成其等 刀豆(C al“ 邵ijor, 15)叶肉原生 质体培养 与植株再 生 38娜` 一—-蔺 下森 素酶浓 度对原生 质体产量 的影响` 置 暴体产 量(个ml/ ,“犷 。粼 。了 102方: 1。忙 102了 10 :
2 原生质 体培养. ~ ~_ …~ ~一 一 _ ~ _ ~社一敞渭 侃卜原 生灰体 住措乔弟 2取弟吕 大矶井始 膨大 称的绷肥 分姑水瓜 〔圈l)第 510 天时出现 第一次分 裂(图2) 第1天 后出现 量第二 次分裂(图 3)第 30天
: 后形 成小细胞 团(图4) 第4c一 50天时 出现肉眼 可见的小 愈伤组 织继代 培养80一 90d一 般可长至 直径3“ 左右
七
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.
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纽 图 3弟二次 细抱分裂 田4 小圳胭团
` 在刀豆叶 肉细胞原 生质体的 培养过 程中光对 再生细 胞的第一 次分裂是 有害的 但在g 完成 了第一次 分裂之后 必须置于 弱光下 继续培养 并逐步 降低培养 裤的渗透 压定期 补充
新鲜 堵养基 若培养基 或培养条 件不适 培养一周 后的原 生质体则 开始收缩 并解体 细胞护 因内 含物发生 锐减而成 为空壳 原生质 体正常 养10d 后统计其 植板率 板率计 算如下
匕
扮
鸽 4 复 旦 学 报 (自然科学版 ) 第 30 卷 添 丫
植板率 = 分裂细胞数分裂细胞数 十未分裂细胞数 x 1 0 0拓
匕
每个培养瓶观察统计 6 0 个细胞 , 每一试验重复 3 次 .
用液体悬浮培养法进行不 同甘露醇浓度的培养试验 . 结果表明 , 当葡萄 糖 浓 度 为
o
·
15 m o l/ L
, 蔗搪浓度为 0 . l m 01 / L 时 , 甘露醇的浓度以 。 . 25 ~ 。 . 45 m ol / L 最有利于刀
豆原生质体的生长与分裂 . 当甘露醇的浓度小于 。 · 25 m ol / L 或大 于 o · 45 m ol / L 时 , 再
生细胞停止生长 , 且极少分裂 ,培养 30 d 后观察原生质体 , 有的内含物减少 , 有的解体 ,当
甘露醇浓度调至 o · 35 m ol /L 时 , 其植板率最高 , 细胞生长为最佳状态 , 这比赤豆 〔 , 01 和大
豆 l[ 月原生质体培养时的浓度要低 .
对三种不同的培养方法进行比较 ,双层培养的植板率略高于混合培养和悬 浮培养的 ,
差别不甚明显 ,但培养基对原生质体的培养效果差异十分明显 (表 2 ) . 从表 2 可看出 , 其
中以 D 2 3 的植板率最高 , 为 5 . 6拓~ 7 . 0% ; B S B 次之 , 为 3 . 7% ~ 4 . 4% ; M S 最差 , 仅
为 。% ~ 1 . 7% . D aZ 和改 良的 B S B 含有少量的无机氮和一定量的有机氮 , 是刀豆叶肉
细胞原生质体生长的理想培养基 .
表 2 培养墓和培养方法对刀豆原生质体植板率的影响
今神
植 板 率 (绍 )
基本培养基
双层培养 悬浮培养 混合培养
M S
D Za
B S B
0
.
9 8
7
.
0
4
.
4 1
1
.
7 7
5
.
66
3
.
7
6
.
2 6
4
.
29
激素是刀豆原生质体培养中的另一重要条件 , 我们在以 D aZ 作基本培养基的悬浮培
养中进行多种激素的配 比试验 (表 3) . 结果表明 , 6 B A 的浓度以 0 . 2 m g / L为最好 ; 2 . 4一D
的浓度以 0 . s m g / L 为最好 , 由单一的细胞分裂素 6B A O . Z m g/ L和单一的生长素 2 . 4一 D
。 . s m g / L 组合成的激素 , 原生质体植板率达 1 . 96 另 , 效果较好 . 在同样的条件下 附加
N A A 和 I A A 等生长素反而培养效果不好 . 但是 0 . 4 m g / L 6B A , o . s m g / L 2 . 4一 D , 。 . 2
m g / L N A A 和 0 · 25 m g / L I A A 的组合获得了 0 . 9% 的植板率 , 这表明激素的组成及浓
度都可改变培养效果 、 在我们的试验中 , 以 0 . 2 m g / L 6 B A , o · s m g / L K T , 。 · s m g / L
Z T
,
0
.
s m g / L 2
.
4一 D , o
.
s m g / L N A A
,
o
.
s m g / L I A A 多种激素组合的 D aZ 培养基的
培养效果最佳 , 植板率可高达 3 . 7 % , 在单一的 G A 3 ( 赤霉素 ) 培养中没有观察到细胞
分裂的现象 ,见表 3
2
.
3 愈伤组织的分化与植株再 生
在植物原生质体培养过程中 , 影响器官分化的因素诸多 , 其中植物的基因型 l[ 约极为
重要 , 其他的客观条件 , 如培养的条件和方法等等也很重要 , 尤其是激素的成分及浓度 .
这些因素对愈伤组织的形成及器宫的分化均有很大的影响 , 例如在培养刀豆叶肉细胞原
生质体的培养基中添加了较高浓度的 2 . 4一 D (0 . s m g / L 左右 ) , 不但有利于愈伤组织的扩
帐
、
第 4期 严成其 , 等 : 刀豆 ( C a o a o al l ia 即招 if 。 , 二 i。 )叶肉原生质体培养与植株再生 38 5
打 否 表 3 不同激素配比对刀豆原生质体生长 1 )和植板率的影响
七 细胞分裂素 ( m
g /L )
6 B A K T Z T
生长素 ( m g/ L )
2
.吐一 D N A A I A A G A 3
原生质体
生长状态
植板率
(形 )
心
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0
.
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.
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.
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0 0 0 0 0 0 0
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5 + 0
0
.
1 0 0 0
.
5 0
.
2 0
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2 5 0 + 0
0
.
2 0 0 0
.
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.
2 0
.
2 5 0 + 0
0
.
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2 0
.
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0
.
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.
5 0
.
2 0
.
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.
9
0
.
5 0 0 0
.
5 0
.
2 0
.
25 0 + 0
0
.
6 0 0 0
.
5 0
.
2 0
.
26 0 + 0
0
.
2 0
.
5 0
.
5 0
.
1 0
.
5 0
.
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0
.
2 0
.
5 0
.
5 0
.
3 0
.
5 0
.
5 0 + 0
0
.
2 0
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5 0
.
5 0
.
5 0
.
5 0
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5 0 + + + 3
.
77
0
.
2 0
.
5 0
.
5 0 7 0
.
5 L)
.
5 0 + + 1
.
6
0
,
2 0
.
5 0
.
5 0
.
9 0
.
5 0
.
6 0 + 0
1) 以细胞内含物多少和细胞边缘的清晰度分为三级 : + , 千 十 , “ 千 .
增培养 , 而且还有利于愈伤组织的器官分化与胚状体的产生 .
我们把刀豆原生质体扩增的愈伤组织转入到有不同激素配比的分 化培养 基 中时 ,设
计了上百个分化处理 , 每一处理进行了 3 次重复 , 结果见表 4 . 其中 , 有的组 合经培养
后仅分化出根 ,但未能分化出芽 (组合 1 ) ;有的形成坚硬的愈伤组织 , 色泽黄绿 ,颗粒状结
表 4 不同激素 l) 组合培养时的器官分化情况
D Za M S
砂 细胞分裂素 生长素 细胞分裂素 生长素
2
.
4 一D N A A 工A人 6 B A Z T 2 . 4一D N A A I A A
分 化 情 况
6 B A Z T
0
.
3 0
0自Rù
,山,1
1
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0
.
3
2 0
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10
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0
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.
3 不定根
0
.
5 坚硬的愈伤组织 ,瘤状结构
1 松散的愈伤组织
0
.
3 胚状体
0
.
3 绿芽 ,胚状体 , 再生植株
0
.
3 绿芽 , 胚状体
0
.
3 愈伤组织生长旺盛 ,质地紧密
。 . 6 愈伤组织质地紧密
O 愈伤组织颜色嫩绿
0
.
3 少量不定根
八以O
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0
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坛尹 0 . 3
l) 浓度单位均为 m g /L . 2 ) 组合号 ,以下类推 .
知

第 4期 严成其 ,等 : 刀豆 ( C训二 al l她 。 ” s汀盯。 艺的叶肉原生质体培养与植株再生 3 8宁
御 每
妇
中国农业科学 , 198 7 ,幻 (5 ) : 94一 95 .
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