全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(5): 924−933 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由中国农业科学院科技创新工程和国家科技支撑计划项目(2013BAD01B05-2-4)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 王述民, E-mail: wangshumin@caas.cn, Tel: 010-62175628
第一作者联系方式: E-mail: sscmlss_cool@126.com
Received(收稿日期): 2013-12-10; Accepted(接受日期): 2014-03-04; Published online(网络出版日期): 2014-03-25.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20140325.0911.001.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.00924
普通菜豆基因组 SSR标记开发及在豇豆和小豆中的通用性分析
陈明丽 1 王兰芬 1 武 晶 1 张晓艳 2 杨广东 3 王述民 1,*
1 中国农业科学院作物科学研究所, 北京 100081; 2 青岛市农业科学研究院蔬菜所, 山东青岛 266100; 3 黑龙江省农业科学院克山分院,
黑龙江克山 161606
摘 要: 分子标记具种属间通用性可提高其利用效率, 并降低标记开发成本。本研究基于 Roche 454超高通量测序技术
获得普通菜豆基因组测序结果, 共开发了 560 个普通菜豆基因组 SSR 标记。利用 2 份普通菜豆品种对标记进行初步筛
选, 有 421个标记能够有效扩增。用新开发的标记分析 16份豇豆和 16份小豆的通用性。结果显示, 185个普通菜豆基
因组 SSR标记在豇豆中能有效扩增, 通用性比率为 43.9%; 161个 SSR标记在小豆中能有效扩增, 通用性比率为 38.2%;
在豇豆和小豆中都能获得有效扩增条带的标记共 138 个; 并且普通菜豆基因序列 SSR 标记在豇豆和小豆中的通用性比
率高于基因间序列 SSR标记。通用性标记的多态性分析表明, 豇豆和小豆的多态性比率分别为 34.0%和 24.8%; 且豇豆
和小豆中基因间标记的多态性都比基因内标记的多态性高。上述通用性标记为豇豆属作物的多样性评价、连锁图谱的
构建及基因定位等方面的研究提供了便利。
关键词: 普通菜豆; 豇豆属; SSR标记; 通用性
Development of Genomic SSR Markers in Common Bean and Their Transfera-
bility in Cowpea and Adzuki Bean
CHEN Ming-Li1, WANG Lan-Fen1, WU Jing1, ZHANG Xiao-Yan2, YANG Guang-Dong3, and WANG
Shu-Min1,*
1 Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 2 Institute of Vegetables, Qingdao Academy of Agri-
cultural Sciences, Qingdao 266100, China; 3 Keshan Branch, Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Keshan 161606, China
Abstract: Transferability analysis of molecular markers has significantly improved their development efficiency and reduced their
development cost. A total of 560 novel SSR markers were successfully developed based on common bean genomic sequences, and
421 (75.2%) of those markers generated effective amplification bands from two accessions of the cultivated common bean. Two
Vigna species, cowpea and adzuki bean were used to test the transferability and polymorphism of new genomic markers. The re-
sults indicated that the transferability rate of common bean genomic-SSR in cowpea and adzuki bean was 43.9% and 38.2%, and
the ratio of polymorphism SSR markers in the crops was 34.0% and 24.8%, respectively. A total of 138 common bean ge-
nomic-SSR primers were detected to be highly transferable between two species of Vigna. In addition, the diversity of transfer-
ability gene-SSR markers was higher for cowpea and adzuki bean than that of intergenic regions-SSR. These transferable markers
are useful for further genetic diversity analysis, genetic linkage map construction, quantitative trait loci annotation, genetic evolu-
tion and marker-assisted selection in Vigna species because of their multi-allelic nature, reproducibility, co-dominant inheritance,
high abundance in genome.
Keywords: Common bean; Genus Vigna; SSR markers; Transferability
普通菜豆、豇豆及小豆均是我国的主要栽培食用豆种。
普通菜豆属于豆科(Leguminosae), 蝶形花亚科(Papilioni-
deae), 菜豆族(Phaseoleae)菜豆属(Phaseolus)[1]。豇豆[2]和
小豆 [3]属豆科(Leguminosae), 蝶形花亚科(Papilionideae),
菜豆族(Phaseoleae), 豇豆属(Vigna L.)。豇豆属含有 2个亚
属, 豇豆属于 Vigna亚属, 小豆属于 Ceratoropis亚属。
豇豆和小豆在中国栽培历史悠久 , 全国各地都有种
植。中国被认为是豇豆的起源中心或次级起源中心之一,
第 5期 陈明丽等: 普通菜豆基因组 SSR标记开发及在豇豆和小豆中的通用性分析 925


目前除西藏自治区外, 其他各地都有豇豆生产[4]; 小豆原
产中国, 在中国华北、东北、黄河及长江中下游地区广泛
种植[5]。豇豆和小豆在我国农产品出口, 饮食改善以及作
物种植结构优化等方面具有重要作用[6]。但是, 与其他豆
科模式作物如普通菜豆和苜蓿相比, 豇豆[7]和小豆[8]公开
发表的分子标记数目极少。
分子标记在许多作物的遗传研究中起重要作用。SSR
标记因其在基因组中分布广泛且具有共显性遗传、可重复
性、多态性丰富等特点而被认为是最好的分子标记之一,
广泛应用于种质资源的多样性分析、遗传连锁图谱构建、
基因定位及标记辅助育种等研究[9]。SSR标记在近缘植物
乃至远缘植物基因组间有一定的通用性[10]。目前, 许多物
种间 SSR 标记通用性研究已取得较大进展。张扬勇等[11]
根据拟南芥叶绿体全基因组序列开发 89 个叶绿体基因组
SSR 标记, 并分析了标记在甘蓝中的通用性; Wang 等[12]
研究发现禾本科作物小麦、玉米和高粱中的 SSR 标记在
海滨雀稗属作物中的通用性比率分别为 67.5%、49.0%和
66.8%, 多态性达 51.5%。Hu等[13]发现黄瓜 EST-SSR标记
在甜瓜、西瓜、南瓜和葫芦中的具有很高通用性, 通用性
比率为 92.9%、57.1%、53.6%和 60.7%。王丽侠等[14]分析
187个小豆 SSR标记在绿豆中的通用性表明, 约 75%的小
豆 SSR标记可在绿豆中有效扩增。钟敏等[15]分析 1205个
新开发绿豆基因组 SSR 标记的通用性表明其在豇豆、小
豆和饭豆中的通用性比率分别为 50.0%、73.3%和 81.6%;
多态性比率分别为 4.1%、1.7%和 1.5%。但与其他物种相
比, SSR 标记通用性在豆科作物中研究较少, 需进一步探
讨不同豆科作物间标记的通用性 , 以提高标记的利用效
率, 促进遗传研究水平较低的物种的分子遗传学研究。本
研究通过分析基于普通菜豆基因组序列开发的 SSR 标记
在豇豆属作物豇豆和小豆中的通用性, 以期增加豇豆、小
豆的分子标记, 进而加速豇豆属的基因组学研究。
1 材料与方法
1.1 试验材料
用于检测普通菜豆 SSR 标记有效性的普通菜豆地方
品种红芸豆 (统一编号 : F0002322)和京豆 (统一编号 :
F0000777); 用于 SSR 标记通用性分析的16份小豆材料和
16份豇豆材料均由中国农业科学院作物科学研究所提供。
16份小豆材料来源于中国11个省市, 16份豇豆材料来源于
中国8个省市(表1)。
1.2 DNA提取与检测
采用天根生化科技(北京)有限公司植物基因组DNA
提取试剂盒(离心柱型)提取植物基因组DNA。用1%琼脂
糖凝胶电泳检测DNA质量, 紫外分光光度计检测浓度和
纯度。
1.3 引物开发
依据普通菜豆基因组序列信息, 利用SSR Locator软
件查找SSR位点并设计引物 [16]。查找SSR位点参数设置:
二核甘酸重复10次 , 三核苷酸重复5次。设定引物长度
18~22 bp; 引物序列的GC含量40%~60%, 且下游引物GC
含量差异小; 引物退火温度在55~60℃之间; 扩增片段长
度在100~300 bp之间。引物均由Invitrogen公司合成。
1.4 PCR扩增反应
PCR总体积15 μL, 含50 ng基因组DNA, 10×PCR缓冲
液1.5 μL (含1.5 mmol L–1 MgCl2), 0.25 mmol L–1 dNTPs,
上下游引物各0.25 μmol L–1和1 U Taq DNA聚合酶。反应
程序为 95 5 min; 95 45 s, 50~60 45 s, 72 45 s, 35℃ ℃ ℃ ℃
个循环; 最后72℃延伸5 min。反应在T100 Thermal Cycler
(Bio-Rad Research, USA)扩增仪上进行。SSR扩增产物经
6%的聚丙烯酰胺非变性凝胶在60 W恒定功率下电泳
70 min, 用NaOH快速银染法染色后读取条带[17]。
1.5 标记多态性分析
利用 Popgen32[18]软件分析标记多态性信息含量(PIC)、
等位基因数(Na)、观察杂合度(Ho)和期望杂合度(He)。
2 结果与分析
2.1 普通菜豆基因组 SSR标记开发及筛选
利用SSR Locator软件, 共开发560个菜豆基因组SSR
标记。选2份普通菜豆红芸豆和京豆对SSR标记进行初步
筛选, 确定有421个SSR标记在菜豆中能够稳定扩增出清
晰条带, 有效扩增率为75.2%; 421个有效扩增标记中, 有
93个标记在2份材料中表现多态性, 多态性比率为22.1%。
421个普通菜豆 SSR标记的基因组序列与菜豆全基因
组序列 (http://www.phytozome.net/)比对分析显示 , 213个
标记属于基因内 SSR 标记, 208个标记属于基因间序列
SSR标记(表2)。213个基因内 SSR标记分布于普通菜豆11
条染色体上, 平均每个染色体上19个标记。Pv03染色体上
标记数量最多, 有30个 SSR 标记, 其次是 Pv02和 Pv01染
色体, 标记数分别为26个和25个。染色体 Pv04和 Pv05上
标记数量最少, 都只有11个(表3)。
2.2 普通菜豆基因组 SSR标记的通用性
分析421个普通菜豆 SSR 标记在16份豇豆和16份小
豆中的通用性显示, 185个菜豆 SSR标记在豇豆中能够有
效扩增, 标记在豇豆中的通用性比率为43.9%。其中112
个标记属于普通菜豆基因内 SSR 标记 , 比率为52.6%;
有73个标记属于普通菜豆基因间序列 SSR 标记, 比率为
35.1% (表2)。161个标记在小豆中能获得有效扩增条带,
标记在小豆中的通用性比率为38.2%。161个通用性标记
中, 有95个标记属于普通菜豆基因内 SSR 标记, 比率为
44.6%, 有66个标记属于普通菜豆基因间序列 SSR 标记,
比率为31.7% (表2)。普通菜豆 SSR标记在豇豆属物种豇
豆和小豆中通用性存在差异 , 在豇豆中的通用性比率高
于在小豆中的通用性比率。SSR标记绝大多数在2个物种
中能同时得到有效扩增, 2个物种间均能获得有效扩增条
926 作 物 学 报 第 40卷


表 1 小豆和豇豆品种资源名称及来源
Table 1 Names and origins of adzuki bean and cowpea
材料
Material
统一编号
Accession No.
品种
Variety
起源地
Origin
小豆 Adzuki bean B0000424 白小豆 Baixiaodou 山西 Shanxi
B0000664 红小豆 Hongxiaodou 内蒙古 Inner Mongolia
B0000715 花小豆 Huaxiaodou 辽宁 Liaoning
B0001482 红小豆 Hongxiaodou 云南 Yunnan
B0001485 矮脚红米豆 Aijiaohongmidou 云南 Yunnan
B0001670 京小 38 Jingxiao 38 北京 Beijing
B0001782 花小豆 Huaxiaodou 天津 Tianjin
B0002133 花脸小豆 Hualianxiaodou 黑龙江 Heilongjiang
B0003249 Jan-58 黑龙江 Heilongjiang
B0003410 红小豆 Hongxiaodou 湖北 Hubei
B0003546 黑小豆 Heixiaodou 湖北 Hubei
B0003782 赤豆 Chidou 江苏 Jiangsu
B0004711 顺义小豆 Shunyixiaodou 北京 Beijing
B0004795 保 947-27 Bao 947-27 河北 Hebei
B0005142 冀红 9253-947 Jihong 9253-947 河北 Hebei
B0001292 红小豆 Hongxiaodou 河南 Henan
豇豆 Cowpea I0001335 豇豆 Jiangdou 北京 Beijing
I0001342 豇豆 Jiangdou 北京 Beijing
I0001346 豇豆 Jiangdou 江苏 Jiangsu
I0001368 豇豆 Jiangdou 江苏 Jiangsu
I0001398 白豇豆 Baijiangdou 河南 Henan
I0001730 白饭豆 Baifandou 广西 Guangxi
I0001740 朱沙豆 Zhushadou 广西 Guangxi
I0001800 豇豆 Jiangdou 宁夏 Ningxia
I0002636 白爬豆 Baipadou 河北 Hebei
I0002644 黑豇豆 Heijiangdou 河北 Hebei
I0002656 大紫豇豆 Dazijiangdou 内蒙古 Inner Mongolia
I0002660 花紫豇豆 Huazijiangdou 内蒙古 Inner Mongolia
I0002726 打豇豆 Dajiangdou 湖北 Hubei
I0002741 黄打豇 Huangdajiang 湖北 Hubei
I0002764 迟豇豆 Chijiangdou 湖北 Hubei
I0002777 铜锣豇豆 Tongluojiangdou 湖北 Hubei

表 2 普通菜豆基因内 SSR标记和基因间序列 SSR标记在豇豆和小豆中的通用性和多态性分布
Table 2 Transferability and polymorphism of gene-SSR markers and intergenic region-SSR for cowpea and adzuki bean
通用性标记数目
No. of transferable marker
多态性性标记数目
No. of polymorphic marker 类别
Type
普通菜豆标记数目
No. of common
bean marker 豇豆 Cowpea 小豆 Adzuki bean 豇豆 Cowpea 小豆 Adzuki bean
基因内 SSR标记 Gene-SSR markers 213 112 (52.6%) 95 (44.6%) 36 (32.1%) 23 (24.2%)
基因间序列 SSR标记 Intergenic region-SSR 208 73 (35.1%) 66 (31.7%) 27 (37.0%) 17 (25.8%)
合计 Total 421 185 (43.9%) 161 (38.2%) 63 (34.0%) 40 (24.8%)

第 5期 陈明丽等: 普通菜豆基因组 SSR标记开发及在豇豆和小豆中的通用性分析 927


表 3 213个普通菜豆基因序列 SSR标记在染色体上的分布
Table 3 Distribution of 213 gene-SSR markers on chromosome in common bean
染色体编号
Chromosome code
基因内 SSR标记数目
No. of gene-SSR marker
染色体编号
Chromosome code
基因内 SSR标记数目
No. of gene-SSR marker
Pv01 25 Pv07 20
Pv02 26 Pv08 17
Pv03 30 Pv09 23
Pv04 11 Pv10 20
Pv05 11 Pv11 12
Pv06 18 合计 Total 213

带的标记共有138个 , 其中基因内的SSR标记达到85个 ,
基因间序列SSR标记有53个。47个标记只能在豇豆中扩增,
23个标记特异在小豆中扩增。
2.3 SSR标记的多态性
在SSR标记通用性分析的基础之上, 进一步研究了普
通菜豆基因组SSR标记在16份豇豆和16份小豆中的多态
性(图1和图2)。豇豆中可有效扩增的185个标记中, 有63
个标记表现多态, 多态性比率为34.0%, 其中有36个标记
属于普通菜豆基因内SSR标记, 比率为32.1%, 27个标记
属于普通菜豆基因间序列SSR标记, 比率为37.0% (表2)。
PIC值变化在0.110~0.671, 平均PIC值为0.305, 标记的等
位基因数量在2 ~ 6之间 , 平均为2 . 5 4 ; 期望杂合度在
0.121~0.706之间, 平均期望杂合度为0.322; 有11个标记
位点表现不同程度的杂合性。标记BMg409、BMg497、
BMg538、BMg568和BMg569表现较高的杂合度, 观察杂合
度均大于0.5, 标记BMg317、BMg445、BMg449、BMg492、
BMg567和BMg661观察杂合度小于0.5 (见附表)。
小豆中有效扩增的 161个标记中, 40个标记表现出多
态, 多态性比率为 24.8%, 其中 23个属于普通菜豆基因内
SSR标记, 比率为 24.2%, 17个属于普通菜豆基因间序列
SSR标记, 比率为 25.8% (表 2)。PIC变化在 0.059~0.668,
平均 PIC 值为 0.359, 标记的等位基因数在 2~5 之间, 平
均值为 2.8。期望杂合度在 0.063~0.734之间, 平均期望杂
合度为 0.389; 多数多态性标记位点观察杂合度为 0, 仅有
标记 BMg384和 BMg445位点观察杂合度大于 0, 分别为
0.063和 0.133 (见附表)。22个普通菜豆 SSR标记在豇豆
和小豆中存在多态性, 其中 13个属于基因内 SSR标记, 9
个属于基因间序列 SSR标记。

图 1 普通菜豆 SSR标记在 16份豇豆中的扩增图谱
Fig. 1 Amplification bands of common bean SSR markers in cowpea

图 2 普通菜豆 SSR标记在 16份小豆中的扩增图谱
Fig. 2 Amplification bands of common bean SSR markers in adzuki bean

3 讨论
分子标记开发的关键是如何高效获得基因组序列或
表达的序列标签(EST)序列, 而新一代测序技术可以快速
获得海量的序列数据, 极大程度提高了挖掘、验证和评估
分子标记的效率[19]。小麦[20]、水稻[21]、甘薯[22]、黄瓜[23]、

西葫芦[24]等作物依据基因组序列开发了大量分子标记。
豆科作物在这方面的研究也取得一定的进展, Tangphat-
sornruang等 [25]利用Roche 454超高通量组测序技术获得
470 024条绿豆基因组序列, 并检测到1493个SSR位点用于
标记开发。Kaur等[26]对小扁豆特异组织进行转录组测序, 获
928 作 物 学 报 第 40卷


得1.38 ×106个EST, 并开发了2393个小扁豆EST-SSR标记用
于后续研究。Garg等[27]和Dutta等[28]分别利用组装的鹰嘴豆
和木豆转录组序列开发了大量功能标记。本研究正是利用
Roche 454测序数据, 从中开发SSR标记, 丰富了普通菜豆的
遗传标记。
SSR序列在相近的物种间具有一定的保守性 , 因而
SSR标记在近缘物种间能够通用。标记通用性研究可以为
相近物种提供更多的遗传信息, 方便了物种内、种间遗传
学与基因组学等方面的研究[29]。SSR标记通用性比率高低
与所属物种之间亲缘关系密切相关。Gupta等[30]随机选取
41个豆科模式生物蒺藜状苜蓿SSR标记, 分析显示, 其在
豆科植物中的通用性 (53%~71%)明显高于非豆科植物
(33%~44%)。同科不同属间SSR标记通用性比率明显比同
属不同种间通用性低。本研究中普通菜豆与豇豆和小豆是
同科不同属作物, 通用性比率为43.9% (豇豆)和38.2% (小
豆), 明显低于同属作物绿豆与豇豆和小豆的通用性比率,
后者分别为50.0% (豇豆)和73.3% (小豆)[15]。
SSR序列不仅存在于基因序列中, 而且存在于基因间
序列中, 由于在物种间基因序列的保守性高于基因间序列
的保守性, 因此, 基因内SSR标记在物种间通用性一般高
于基因间序列SSR标记。文明富等 [31]研究木薯 419对
EST-SSR引物和182对基因组SSR引物在麻疯树和橡胶树通
用性发现, 木薯EST-SSR在麻疯树和橡胶树中的通用性比
率分别为55.85%和38.90%, 明显高于木薯基因组SSR在麻
疯树和橡胶树通用性比率37.36%和26.37%; Varshney等[32]
分析大麦的EST-SSR和G-SSR标记在近缘物种小麦中的通
用性, 发现EST-SSR标记的通用性比率高于G-SSR标记。在
本研究中普通菜豆基因内SSR标记在豇豆和小豆中的通用
性比率分别为52.6%和35.1%; 高于普通菜豆基因间序列
SSR标记在豇豆(44.6%)和小豆(31.7%)中的通用性比率。
多态性分子标记在生物多样性、遗传多样性、物种鉴
定等研究中具有广泛的应用价值。标记多态性比率, 多态
性标记平均PIC值和平均He值都可以用来度量群体的遗传
多样性。标记多态性比率 , 平均PIC值及平均He值越高 ,
其群体遗传多样性就越丰富 ; 反之 , 其遗传多样性就越
低 [33-34]。本研究结果显示普通菜豆基因组SSR标记在16
份豇豆和16份小豆中的多态性比率分别为34.0%和24.8%,
多态性标记平均PIC值分别为0.305和0.359, 平均期望杂
合度为0.322和0.389, 说明所选用的群体多样性偏低。可
能是因为所选取的豇豆和小豆材料数量偏少 , 且都是中
国栽培种, 起源单一, 材料间的亲缘关系较近。此外, 分
子标记多态性高低也与序列所在的位置有一定的关系 ,
基因内的序列因其保守性较高, 多态性会相对较低, 而基
因间序列因其保守性较差, 多态性会相对较高。本文中在
豇豆和小豆中基因间标记的多态性都比基因内标记的多
态性高。
近缘物种间 SSR 标记通用性高低在一定程度上反应
物种间的遗传关系[35]。综合分析 SSR 标记的通用性和多
态性, 可以看出豇豆略高于小豆, 普通菜豆与豇豆的亲缘
关系较小豆近。而 Sumanasinghe 等[36]研究表明, 菜豆属
的普通菜豆与 Ceratotropis 亚属小豆的亲缘关系比普通菜
豆与 Vigna亚属豇豆的亲缘关系近。本研究中 SSR标记基
于通用性结果分析的亲缘关系与此正好相反 , 主要是因
为本研究用于分析的分子标记仅是基因组标记的小部分,
并不能准确地反应物种间基因组信息。只有依据全基因组
的序列开发数目更多、类型更加丰富的标记, 才能准确地
分析物种的亲缘与进化关系。
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