全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(2): 253−263 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本 研究由国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2013AA102604), 国家国际合作项目(2013DFA31600), 广西自然科学基金重点项目
(2011GXNSFF018002), 广西科学研究与技术开发计划项目 (桂科产 1123008-1, 桂科攻 1222009-1B, 桂科合 13999002, 桂科合
1347004-2), 广西出八桂学者、特聘专家专项经费和广西农业科学院团队项目(桂农科 2011YT01)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 杨丽涛, E-mail: liyr@gxu.edu.cn, Tel: 0771-3236407; 李杨瑞, E-mail: liyr@gxaas.net, Tel:
0771-3247689
第一作者联系方式: E-mail: niujungi3218@163.com
Received(收稿日期): 2013-03-01; Accepted(接受日期): 2013-09-16; Published online(网络出版日期): 2013-10-22.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20131022.1652.009.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.00253
甘蔗中性/碱性转化酶基因 SoNIN1的克隆和表达分析
牛俊奇 1,2 王爱勤 1,2 黄静丽 1,2 杨丽涛 1,2,3* 李杨瑞 2,3,4,*
1 广西大学农学院, 广西南宁 530005; 2 亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室, 广西南宁 530005; 3 中国农业科学院甘蔗
研究中心 / 广西农业科学院甘蔗研究所 / 农业部广西甘蔗生物技术与遗传改良重点实验室 / 广西甘蔗遗传改良重点实验室, 广西
南宁 530007; 4 广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室, 广西南宁 530007
摘 要: 中性/碱性转化酶(Alkaline/Neutral Invertase)能不可逆地催化蔗糖分解为葡萄糖和果糖, 在植物生长发育中
起重要作用。本研究采用 RT-PCR和 RACE技术从甘蔗品种 GT28心叶中克隆到甘蔗中性/碱性转化酶基因全长 cDNA
序列, 基因命名为 SoNIN1。该基因全长 2289 bp (GenBank登录号为 JX109944), 开放阅读框为 1812 bp, 编码 603个
氨基酸, 相对分子量为 67.79 kD, 等电点为 6.41。具有中性/碱性转化酶保守结构域, N-端不含跨膜结构和信号肽。其
编码氨基酸序列与玉米、水稻和黑麦草的亲缘关系较近, 属于同一进化分支。利用染色体步移技术克隆到 SoNIN1基
因 5′侧翼启动子序列, 长度为 1174 bp (GenBank登录号为 KC854419)。启动子序列含有多个 CAAT-box和 TATA-box
等基本作用元件, 参与分生组织特异性激活, 参与干旱诱导的 MYB结合位点, 脱落酸、茉莉酸甲酯和赤霉素响应等
作用元件。利用实时荧光定量 PCR技术, 在生理成熟期甘蔗茎、叶、花序和芽中均能检测到 SoNIN1的表达, 其表达
量在叶中最高, 芽中次之, 而在+1节间最低。苗期根和叶中 SoNIN1基因都受 PEG和 NaCl诱导表达。
关键词: 甘蔗; 中性/碱性转化酶; 启动子; 克隆; 基因表达
Cloning and Expression Analysis of Sugarcane Alkaline/Neutral Invertase
Gene SoNIN1
NIU Jun-Qi1,2, WANG Ai-Qin1,2, HUANG Jing-Li1,2, YANG Li-Tao1,2,3,*, and LI Yang-Rui2,3,4,*
1 Agricultural College, Guangxi University, Nanning 530005, China; 2 State Key Laboratory of Subtropical Bioresources Conservation and Utilization,
Nanning 530005, China; 3 Sugarcane Research Center, Chinese Academy of Agricultural Sciences / Sugarcane Research Institute, Guangxi Academy
of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Sugarcane Biotechnology and Genetic Improvement (Guangxi), Ministry of Agriculture / Guangxi Key
Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement, Nanning 530007, China; 4 Guangxi Crop Genetic Improvement and Biotechnology Key Laboratory,
Nanning 530007, China
Abstract: Neutral/alkaline invertase irreversibly catalyzes sucrose into glucose and fructose, and plays an important regulating
role in plant growth and development. In the present study, the whole length of neutral/alkaline invertase gene cDNA was cloned
and sequenced from leaf of sugarcane variety GT28 using RT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction) and RACE
(rapid amplification of cDNA ends), and named as SoNIN1. The gene consists of 2289 bp with an ORF (open reading frame) of
1812 bp encoding a polypeptide of 603 amino acids with calculated protein molecular weight of 67.79 kD, and an isoelectric point
of pH 6.41. SoNIN1 gene encodes a protein that is close to that of Zea mays, Oryza sativa, and Lolium perenne, belonging to the
same evolutionary branch. The putative protein contains the conserved domain of alkaline/neutral invertase, and no mem-
brane-spanning domain and signal peptide at N-end. The gene promoter sequence was cloned by using genome walking, which
contains the basic components of CAAT-boxes and TATA-boxes, as well as specific acting elements such as cis-regulatory
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element involved in meristem activation, methyl jasmonate response and circadian rhythm, plus drought-induced MYB binding
sites, abscisic acid response element, gibberellin response element, etc. Real-time PCR results showed that expression of SoNIN1
could be detected in the roots, stalks, leaves, flowers and buds, among which the highest was found in leaves, the medium in buds,
and the lowest in internode +1 (enrolled by the top visible dewlap leaf). The expression of SoNIN1 gene in roots and leaves of
sugarcane seedling was induced by PEG and NaCl.
Keywords: Sugarcane; Alkaline/neutral invertase; Promoter; Cloning; Gene expression
转化酶是蔗糖代谢的关键酶, 能不可逆地催化
蔗糖水解成葡萄糖和果糖, 在作物经济产量形成与
果实品质改良中发挥重要作用[1-2]。植物转化酶依据
亚细胞定位、酶活性最适 pH值不同可分为酸性转化
酶和中性/碱性转化酶两个亚基因家族[3]。转化酶活
性的缺乏是蔗糖积累的先决条件, 酶活性高于临界
阈值时将不再积累高浓度的蔗糖, 主要起分解蔗糖
作用[4]。在甘蔗成熟期, 叶片的酸性转化酶活性随甘
蔗的成熟而降低 ; 而中性 /碱性转化酶活性随甘蔗
的成熟而升高, 酶活性提高有利于蔗糖的积累 [5]。
酸性转化酶是调节甘蔗蔗茎发育过程中不同节间蔗
糖含量的关键酶 , 是节间蔗糖积累负调节因子 ,
成熟茎中酸性转化酶酶活性降低有利于蔗糖的积
累 [6-7]。转化酶在植物正常生长中的作用远远大于蔗
糖合成酶[8]。
目前, 已从黑麦草[9]、小麦[10]、橡胶[11]、杨树[12]、
水稻[13]等植物中克隆到中性/碱性转化酶基因。该酶
是一种胞质酶, 主要存在于细胞质中, 也存在于线
粒体和质体中[14-15]。在线粒体中, 该酶与线粒体膜
上蔗糖转运蛋白酶活性密切相关, 在调节细胞渗透
压和中间产物代谢方面起着重要作用[16]。敲除拟南
芥叶绿体 A/N-InvE基因后, 叶片中 A/N-InvE基因表
达量降低, 淀粉积累量减少, 推测 A/N-InvE 基因可
能参与叶绿体和线粒体之间的碳循环调节[17]。中性/
碱性转化酶基因突变体表型为短根、开花延迟、部
分不育, 说明其对植物根系细胞发育和生殖发育起
着重要作用 [18-21]。拟南芥 Atcyt-inv1 突变体证实 ,
Atcyt-inv1 抑制侧根发育是通过控制细胞内己糖浓
度实现的[22]
本研究采用 RT-PCR 和 RACE-PCR 技术, 从甘
蔗心叶中克隆到一个全长的中性/碱性转化酶基因。
同时采用染色体步移技术, 克隆该基因的上游启动
子序列。用实时荧光定量 PCR 分析 SoNIN1 在花期
甘蔗不同组织部位的表达情况, 以及在盐胁迫和干
旱胁迫下该基因在甘蔗根和叶中的表达情况, 以期
为研究 SoNIN1 在不同胁迫处理下基因的表达调控
规律提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
甘蔗品种桂糖28 [23](GT28)由广西农业科学研
究院甘蔗研究所提供。生理成熟期的甘蔗取材于广
西大学农学院甘蔗资源圃新植蔗, 取材时间为2013
年1月22日。采样时以蔗茎完全露出地面的节间为+1
节, 依次向上类推到+31节。以顶端第一片完全展开
叶为+1叶, 处于顶端中心位置还没有展开的叶为心
叶。
把蔗茎砍成单芽, 在广西大学农学院甘蔗智能
温室大棚进行沙土育苗的桶栽实验。当甘蔗长到 2~3
片真叶时, 移植于 5 L的塑料桶, 每桶 3株苗。采用
Hoagland营养液水培, 每隔 1 d换一次营养液。当甘
蔗长到 6~7片真叶时, 把甘蔗分成 3组, 每组 6桶。
一组为同期对照 , 另外两组分别为模拟干旱 (15%
PEG-6000)和盐(100 mmol L–1 NaCl)胁迫处理, 并分
别于处理后 0、3、6、12和 24 h取样。分别取甘蔗
幼根和+1 叶, 用锡箔纸包好后迅速用液氮冷冻, 于
–80℃保存。
1.2 试验试剂
RNA提取 TRIzol试剂盒购于 TIANGEN; RNA
反转录试剂盒购于 Fermentas; 5′RACE 试剂盒购于
Invitrogen公司; Ex Taq酶、dNTPs、pMD18-T载体、
PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser、
Genome Walking Kit、SYBR Premix Ex Taq II购自
TaKaRa (大连), 其余试剂均为国产分析纯。本实验
所用特异引物由上海生工生物工程技术服务有限公
司合成。采用 ABI Stepone Plus型荧光定量 PCR仪
进行实时荧光定量 PCR。
1.3 RNA提取和 cDNA合成
参照 TRIzol 试剂盒说明书, 以甘蔗心叶为材
料提取总 RNA。利用琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA
完整性, 利用 Thermo Scientific NaNoDrop 2000c检
测总 RNA浓度及纯度。按照 ReverAid First Strand
cDNA Synthesis Kit 试剂盒说明书反转录成 cDNA
第 1链。
第 2期 牛俊奇等: 甘蔗中性/碱性转化酶基因 SoNIN1的克隆和表达分析 255


1.4 甘蔗 SoNIN1基因的克隆
1.4.1 甘蔗 SoNIN1 基因中间片段的克隆 以已
报道的玉米中性/碱性转化酶基因(GenBank 登录号
为 EU955523)核苷酸序列, 运用 NCBI 网站上 Blast
程序在 GenBank数据库中进行同源核苷酸序列搜索,
选取与甘蔗亲缘关系较近植物的核苷酸序列在
Vector NTI Advance 11.0进行同源性比对分析, 在核
苷酸序列保守性较高的地方设计 1 对特异引物
NIZJF1和 NIZJR1 (表 1)。扩增体系为 25 µL, 含 Ex
Taq酶 0.25 µL、2×GC buffer II 12.5 µL、2.5 mmol L–1
dNTPs 1.5 µL、10 mmol L–1上下游引物各 1 µL, 模
板 cDNA 1 µL、ddH2O 7.75 µL。PCR反应程序为 94℃
预变性 5 min; 94℃变性 50 s, 56.5℃退火 30 s, 72℃延
伸 2 min, 35个循环; 最后 72℃延伸 10 min。PCR产
物经胶回收纯化后克隆到 T 载体, 转入感受态细胞
DH5α 中, 经 PCR 菌液检测后, 把含有目的片段的
菌液送深圳华大基因研究院测序。
1.4.2 甘蔗 SoNIN1 基因 5′-RACE 克隆 根据
1.4.1测序获得的 SoNIN1 基因中间片段核苷酸序列,
设计下游特异引物 NISYF1、NISYF2和 NISYF3 (表
1)。由 5′-Full RACE Kit (TaKaRa)试剂盒提供上游引
物 Outer Primer: 5′-CATGGCTACATGCTGACAGCCT
A-3′和 Inner Primer: 5′-CGCGGATCCACAGCCTACTG
ATGATCAGTCGATG-3′。

表 1 SoNIN1基因克隆与表达分析中使用的引物
Table 1 Primers used in cloning and expression analysis of SoNIN1
引物
Prime
引物序列
Primer sequence (5′–3′)
用途
Function
NIZJF1 GATCAGGTGTTTATTCGGGACT 中间片段 Intermediate fragment
NIZJR1 GTCGTAGTACTCCGGCCATTTGTC
NISYF1 CCTCATCACCATCAAGCGGAAT 5′RACE
NISYF2 GGCAGTCCATTGTCTTCTCCC 5′RACE
NISYF3 GAAGTCCCGAATAAACACCTGATC 5′RACE
NIXYF1 GCACTCTTCTATTCAGCCCTCTTG 3′RACE
NIXYF2 CCCTAAAAACACGCCTTGGTCG 3′RACE
NIXYR1 GGCCACGCGTCGACTAGTAC 3′RACE
GZS GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTTT 3′RACE
NIF11 ATGGGGATCGCGGAGGTGGCT 编码区验证
NIR11 TCACACAATGTATGTTTTCTTC Coding region
NINSP1 ACAGAATGGATGCCGGGGAGTG 启动子序列
NINSP2 AGCCACCTCCGCGATCCCCATTG Promoter region
NINSP3 ATCCCCATTGGCGCCTTGTTCC
NI-F ATCCACTTGAAATTCAGGCACT 荧光定量 PCR
NI-R ATCCGTCTTCTGGAGTCAACATC Real-time PCR
GAPDH-F CTTGCCAAGGTCATCCATG 荧光定量 PCR
GAPDH-R CAGTGATGGCATGAACAGTTG Real-time PCR

按照 5′-Full RACE Kit (TaKaRa)说明书合成
cDNA 模板, 做巣式 PCR 扩增。以外引物 NISYF1
和 Outer Primer 进行第1轮 PCR 扩增。PCR 反应体
系94 5 min; 94 50 s, 56 30 s, 72℃ ℃ ℃ ℃ 2 min, 35个
循环; 72℃延伸10 min。取第1轮 PCR产物2 µL, 以
内引物 1 (NISYF3和 Inner Primer)和内引物 2
(NISYF2和 Inner Primer)分别进行第2轮 PCR 扩增,
PCR 反应体系为94℃预变性5 min; 94℃变性50 s,
58.5℃退火30 s, 72℃延伸1.5 min, 35个循环; 72 ℃
10 min。PCR产物经胶回收纯化后克隆到 T载体, 转
入感受态细胞 DH5α 中, 经菌液 PCR 检测正确后送
华大测序。
1.4.3 甘蔗 SoNIN1 基因 3′-RACE 克隆 根据
1.4.1测序获得的 SoNIN1 基因中间片段核苷酸序列,
设计用于 3′端扩增的 2 条特异上游引物 NIXYF1 和
NIXYF2、1条下游引物 NIXYR1和 1条反转录特异
引物 GZS (表 1)。以提取的甘蔗心叶总 RNA为模板,
按照 ReverAid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂
盒说明书, 以 GZS 核苷酸序列作为反转录引物, 反
转录合成 cDNA第一链。用 NIXYF1和 NIXYR1引
256 作 物 学 报 第 40卷


物进行第 1 轮 PCR 扩增, 将 PCR 产物稀释 50 倍后
作为引物 NIXYF2 和 NIXYR1 的模板, 进行第 2 轮
PCR扩增。PCR反应程序 94 5 min; 94 50 s, 57 ℃ ℃ ℃
30 s, 72 1.30 min, 35℃ 个循环; 72 10 m℃ in。产物经
胶回收纯化后克隆到 T载体并测序。
1.5 甘蔗 SoNIN1全长 cDNA拼接验证
将 1.4.1、1.4.2和 1.4.3中所克隆的 3个序列, 利
用软件 ContigExpress 拼接, 获得 SoNIN1 基因的全
长 cDNA 序列, 而后在该基因的编码区设计一对引
物 NIF11 和 NIR11 (表 1), 对 3 部分拼接结果进行
PCR扩增验证。PCR扩增程序为 94℃ 5 min; 94℃
50 s, 59℃ 30 s, 72℃ 2 min, 35个循环; 72℃ 10 min。
1.6 甘蔗 SoNIN1基因启动子序列克隆
在 SoNIN1 5′上游核苷酸序列区设计 3条下游引
物 NINSP1、NINSP2和 NINSP3 (表 1), 与 Genome
Walking Kit试剂盒提供的上游引物AP2作巢式 PCR
扩增。采用改良的 SDS法提取甘蔗基因组 DNA[24]。
PCR 扩增体系 50 μL 含 DNA 2 μL、2.5 mmol L–1
dNTPs混合物, 8 μL、10×LA PCR buffer II (Mg2+ plus)
5 μL、5 U μL–1 TaKaRa LA Taq 0.5 μL、100 pmol μL–1
AP2 Primer 1 μL、10 pmol μL–1 NINSP1 Primer 1 μL、
ddH2O 32.5 μL。按试剂盒说明书进行 PCR, 优化后
第 1步移 PCR扩增 NINSP2和 AP2引物退火温度为
63 , ℃ 第 2步移 PCR扩增 NINSP1和 AP2引物温度
为 63.5 , ℃ 第 3步移 PCR扩增 NINSP3和 AP2引物
退火温度为 65℃。
1.7 SoNIN1基因的生物信息学分析
利用 http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/
protparam网站在线分析基因的氨基酸组成、理论分
子量和等电点; 利用 http://smart.embl-heidelberg.de/
网站进行基因编码蛋白质的结构功能域分析; 利用
MEGA4 软件进行基因氨基酸序列同源比较及进化
树分析; 在 http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP 网
站进行蛋白质信号肽分析; 在 http://genome.cbs.dtu.
dk/services/TargetP 预测基因的亚细胞定位 ; 用
TMHMM Server v.2.0预测编码蛋白的跨膜结构域。用
PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/
plantcare/html)和 PLACE (http://www.dna.affrc.go.jp/
PLACE/signalup.html)对 SoNIN1 启动子顺式作用元
件进行在线预测。
1.8 SoNIN1基因的实时荧光定量表达分析
根据 SoNIN1 基因全长序列设计用于实时荧光
定量 PCR 的引物 NI-F 和 NI-R (表 1)。甘蔗内参基
因选择, 以基因表达稳定性好的甘油醛-3-磷酸脱氢
酶基因(GAPDH)为内参基因[25-26], 根据 GenBank 数
据库中甘蔗 GAPDH (EF189713), 设计内参引物
GAPDH-Fn 和 GAPDH-Rn (表 1)。利用荧光染料法
进行实时荧光定量表达分析, 反应参数 95 30 s, ℃
一个循环; 95 5 s, 60 20 s, ℃ ℃ 共 45个循环。采用
2–ΔΔCT法[27], 分析基因的相对表达量。
2 结果与分析
2.1 甘蔗 SoNIN1基因全长序列的拼接和验证
经华大测序中间片段 PCR 产物长度 1131 bp
(图 1-A); 5′片段测序结果内引物 1的 PCR产物长度
为 769 bp (图 1-B), 内引物 2的 PCR产物长度 826 bp
(图 1-B), 两者经 ContigExpress 拼接后长度为 894
bp; 3′片段扩增产物 561 bp (图 1-C)。三部分核苷酸
序列经 ContigExpress 拼接后, 其 cDNA 序列长度
2289 bp。该核苷酸序列与玉米(EU955523)、水稻
(AK121301)和黑麦草 (AJ003114)的中性 /碱性转化
酶基因核苷酸序列同源性较高, 分别是 95%、86%
和 86%, 说明本研究克隆到的是甘蔗中性 /碱性转
化酶基因。

图 1 甘蔗 SoNIN1基因序列扩增结果
Fig. 1 PCR product of SoNIN1 gene from sugarcane
M: DL2000; A: 中间片段扩增结果; B: 5′端片段扩增结果(1: 内引物 1; 2: 内引物 2); C: 3′端片段扩增结果; D: ORF序列扩增结果。
M: DL2000; A: intermediate fragment; B: 5′ RACE result (1: Inner primer 1; 2: Inner primer 2); C: 3′ RACE result; D: PCR product of ORF.
第 2期 牛俊奇等: 甘蔗中性/碱性转化酶基因 SoNIN1的克隆和表达分析 257


参照 Murayama 和 Handa [14]对水稻中性/碱性转
化酶基因的命名, 把该基因命名为 SoNIN1。在 NCBI
上比对分析发现已经克隆到该基因的全长 cDNA 序
列, 包括一个 1812 bp (在 287~2098 bp间)的完整开放
阅读框(open reading frame, ORF), 编码 603个氨基酸
(图 2), 其中 5′非编码区长度为 286 bp, 3′非编码区长
度为 191 bp, 该基因编码蛋白与玉米(EU955523)、水
稻(AK121301)、毒麦(AJ003114)、黑麦草(AM489692)、
甜菜(AJ422050)、拟南芥(NM122156)中编码中性/碱
性转化酶基因编码的蛋白质同源性分别为 96%、
90%、87%、86%、69%和 68%, 但与 Bosch 等[28]报
道的甘蔗 SNI 蛋白质同源性仅为 46%, 说明 SoNIN1
是甘蔗中性/碱性转化酶基因家族的新成员。
为了验证拼接结果 , 根据拼接所获得的全长
cDNA 序列, 在编码区两端设计一对引物 NIF11和
NIR11。PCR 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测,
获得1.8 kb左右的单一条带(图1-D)。该片段经华大
公司测序, 获得1812 bp 核苷酸片段, 该片段与拼

图 2 甘蔗 SoNIN1全长核苷酸序列及推测编码的氨基酸序列
Fig. 2 Nucleotide sequence and putative amino acid sequence of the full-length of SoNIN1
方框代表起始密码子; *代表终止密码子; 下画线代表 poly (A)。
The panes show the positions of ORF. Frame: initiation codon; * termination codon; underline: poly (A).
258 作 物 学 报 第 40卷


接的编码区 cDNA 同源性为 99.7%, 证明拼接结果
正确。该基因已在 DDBJ/EMBL/GenBank 基因数据
库注册, 注册号为 JX109944。
2.2 甘蔗 SoNIN1 基因启动子的克隆与顺式作用
元件分析
第1轮、第2轮和第3轮染色体步移 PCR扩增产
物 , 经1%琼脂糖凝胶电泳检测 , 结果如图3所示。
回收第3轮的 PCR产物胶。连接 pMD18 T-vector后,
经菌液 PCR 检测正确, 序列测序结果为1182 bp。
用 Blastn 进行同源性比对分析, 与玉米中性/碱性
转化酶基因 (EU955523)核苷酸序列同源性为94%,
说明克隆到的序列是甘蔗中性 /碱性转化酶基因的
启动子序列, 在 GenBank 登录号为 KC854419。用
SoNIN1 cDNA 的5′非编码区序列与启动子序列进
行同源性比对分析 , 发现二者在其同源的282个核
苷酸中仅有5个碱基的差异 , 说明我们克隆的序列
为 SoNIN1的上游未知启动子序列, 图4黑色阴影部
分为二者之间的同源序列区 , 其中位于启动子
ATG 之前的序列为1174 bp。该启动子序列在48~
316 bp间存在一个268 bp的非转录区, 二者的交界
处符合 GT-AG 法 , 该区域可能起诱导和增强
SoNIN1基因转录的作用。
用 PlantCARE 在线预测的 SoNIN1启动子区顺
式调控作用元件, 将其翻译起始密码子 ATG 中的 A
定义为+1位, SoNIN1启动子序列含有6个 CAAT-box
和8个 TATA-box。同时还有脱落酸(motif IIb)和赤霉
素(P-box)响应元件、茉莉酸甲酯(CGTCA-motif)顺式
调控元件, 参与干旱诱导的MYB结合位点, 分生组
织特异性激活顺式调控元件, 以及光应答元件等(表
2), 表明甘蔗 SoNIN1基因的表达可能受光、脱落酸、
赤霉素、茉莉酸和干旱等调控。

图 3 甘蔗 SoNIN1基因启动子序列扩增产物
Fig. 3 PCR product of the promoter sequence of SoNIN1 gene
M: DL2000 marker; A: 第 1轮步移产物; B: 第 2轮步移产物;
C: 第 3轮步移产物。
M: DL2000 marker; A: the first amplification of genomic walking;
B: the second amplification of genomic walking;
C: the third amplification of genomic walking.

表 2 SoNIN1基因启动子顺式作用元件预测
Table 2 Predicting cis-acting elements of SoNIN1 promoter
位点
Site
位置(链)
Location (chain)
信号序列
Signal sequence
位点功能
Site function
Box 4 –154 ATTAAT 光响应部分保守的 DNA模块元件
Part of a conserved DNA module involved in light responsiveness
CAAT-box –111, –125, –745,
–811, –913, –1100
CAAT 启动子和增强子区的顺式调控元件
Common cis-acting element in promoter and enhancer regions
CCGTCC-box –819 CCGTCC 分生组织特异性激活顺式调控元件
cis-acting regulatory element related to meristem specific activation
CGTCA-motif –43 CGTCA 参与茉莉酸甲酯响应的顺式调控作用元件
cis-acting regulatory element involved in the MeJA-responsiveness
Circadian –908 CAANNNNAT 昼夜节律顺式调控元件
cis-acting regulatory element involved in circadian control
MBS –62 CAACTG 参与干旱诱导的 MYB结合位点
MYB binding site involved in drought-inducibility
motif IIb –422 CCGCCGCGCT 脱落酸响应元件 Gibberellin-responsive element
P-box –213 CCTTTTG 赤霉素响应元件 Gibberellin-responsive element
Sp1 –362, –426 CC(G/A)CCC 光应答元件 Light responsive element
TATA-box –655, –675, –808,
–826, –868,
TATA 转录起始–30核心启动子元件
Core promoter element around –30 of transcription start
TCT-motif –132 TCTTAC 光应答元件 Part of a light responsive element
TGG-motif –1138 GGTTGCCA 光应答元件 Part of a light responsive element
第 2期 牛俊奇等: 甘蔗中性/碱性转化酶基因 SoNIN1的克隆和表达分析 259



图 4 甘蔗 SoNIN1基因启动子区域序列及预测转录因子结合位点
Fig. 4 Nucleotide sequence (part) and in silico prediction of TBFs of the SoNIN1 promoter region
阴影部分为 SoNIN1cDNA的 5′非编区。
The shading parts are cDNA non-coding region of SoNIN1.

2.3 甘蔗 SoNIN1基因生物信息学和聚类分析
用 SMART分析 SoNIN1蛋白在 116~587位氨基
酸具有植物中性/碱性转化酶基因保守结构域 Pfam:
Invertase_neut, 属于 Bac_rhamnosid亚基因家族。推
测的 SoNIN1 蛋白质的分子量为 67.79 kD、等电点
为 6.41。SignalP信号肽预测显示该基因不含信号肽
序列。用 TMHMM Server v.2.0预测该基因不含跨膜
结构。TargetP 1.1 Server预测该基因可能定位于线粒
体中。
利用 MEGA4.0 软件对甘蔗中性/碱性转化酶基
因编码的蛋白与其他物种编码的蛋白进行进化树分
析, 结果植物中性/碱性转化酶可分为 I 和 II 类。
SoNIN1 蛋白首先与单子叶禾本科植物黑麦草聚类,
其次与玉米(ACG27641.1)和水稻(BAH00419.1)聚类,
最后与拟南芥、甜菜和木薯等聚类, 在进化分支上
属于 I类。
2.4 甘蔗 SoNIN1基因在甘蔗植株不同部位的表达
以甘蔗 GAPDH 为内参基因 , 实时荧光定量
PCR 检测 SoNIN1 在甘蔗植株生理成熟期不同部位
的相对表达量。图 6表明, SoNIN1在茎、叶、花序、
花序轴和芽中都能检测到表达 , 基因表达量为叶>
芽>花序>茎, 而在叶中为+3叶>心叶> +6叶> +1叶;
在甘蔗不同节间的基因表达 , 表现为从+1 节间到
+16 节间基因的表达量逐渐上升, +16 节间最大, 之
后降低, 而在+16、+21、+31节间基因的表达量相差
不大, 都略高于+1 节。在花序中基因的表达量高于
260 作 物 学 报 第 40卷


花序轴, 大约为其 2.54倍。
2.5 NaCl和 PEG胁迫处理对甘蔗 SoNIN1基因
表达的影响
在 NaC胁迫处理下, SoNIN1在根、叶中的表达
呈现出“低–高–低”趋势(图 7), 短期内表现出先抑制
后促进的趋势, 处理 3 h 该基因在根和叶中的表达
均受到抑制, 之后逐渐升高, 处理 12 h 表达量达到
最高; 但随着胁迫时间的延长, 处理 24 h 该基因在
根、叶中的表达迅速降到最低水平(图 7)。盐胁迫下,
该基因在根部表达较叶部高(图 7)。

图 5 SoNIN1蛋白质与其他 22个不同来源的中性/碱性转化酶的进化关系分析
Fig. 5 Phylogenetic tree of SoNIN1 protein and 22 NINs from other species


图 6 SoNIN1在甘蔗不同器官中的表达
Fig. 6 Expression of SoNIN1 gene in different sugarcane
organs assayed
1~7: +1、+6、+11、+16、+21、+26、+31节间; 8~11: 心叶、+1、
+3、+6叶; 12: 花序轴; 13: 花序; 14: 芽。
1–7: internodes +1, +6, +11, +16, +21, +26, +31, respectively;
8–11: top leaf roll, leaf +1, leaf +3, leaf +6, respectively; 12: rachis;
13: inflorescence; 14: bud.

图 7 NaCl胁迫对甘蔗 SoNIN1在叶和根中表达的影响
Fig. 7 Effects of NaCl stress on the expression of SoNIN1 in
leaf and root of sugarcane

在 15%PEG模拟干旱胁迫处理下, SoNIN1在甘
蔗叶中基因的表达量在胁迫处理 6 h降到最低, 12 h
达到最大, 24 h降到较低水平, 但仍高于 0 h。而根
中 SoNIN1基因表达量则持续地上升, 24 h维持在较
第 2期 牛俊奇等: 甘蔗中性/碱性转化酶基因 SoNIN1的克隆和表达分析 261



图 8 15% PEG胁迫对甘蔗 SoNIN1在叶和根中表达的影响
Fig. 8 Effects of 15% PEG stress on the expression of SoNIN1
in leaf and root of sugarcane

高的水平, 是 0 h 的 2.92 倍。说明 PEG 胁迫诱导
SoNIN1基因在根、叶的表达。
3 讨论
本研究采用 RT-PCR 和 RACE 技术克隆到甘蔗
一个中性 /碱性转化酶基因 , 它具有中性/碱性转化
酶保守结构域 Pfam: Invertase_neut。序列分析表明
该基因具有完整的 ORF, 所编码的蛋白与其他禾本
科物种具有很高的同源性, 而与 Bosch 等[28]报道的
甘蔗中性/碱性转化酶基因同源性很低, 氨基酸聚类
分析表明二者都属于 I类, 但在 I类中又属于不同的
亚类群, 说明它们是甘蔗中性/碱性转化酶家族的不
同成员。
甘蔗是重要的糖料作物, 节间蔗糖含量与中性/
碱性转化酶活性成负相关, 而不同节间的中性/碱性
转化酶活性不同 [29]。用荧光定量 PCR 法检测到
SoNIN1在花期蔗茎中基因表达量低于叶、花序和芽
中的表达, 茎中 SoNIN1在转录水平上基因的表达量
低, 可能有利于蔗茎中的蔗糖积累。对转甘蔗反义
SNI 基因植株的研究表明, 中性/碱性转化酶酶活性
受到抑制, 导致细胞内己糖含量减小而蔗糖含量增
加[30]。通过转反义基因技术抑制中性/碱性转化酶基
因的表达, 使中性/碱性转化酶蛋白合成减少, 酶活
性降低, 蔗茎中己糖含量减少, 而蔗糖含量增加[31]。
启动子是基因表达所必需的重要DNA信号序列,
是细胞内控制基因转录与表达的时空特异性的重要
因子, 可以调控基因转录表达的方向和效率, 是转
录调控的中心 [32]。本研究采用基于热不对称交错
PCR原理的染色体步移技术克隆到甘蔗SoNIN1基因
启动子序列, 从转录水平上定向调控中性/碱性转化
酶基因表达方向和效率, 进而探讨蔗糖代谢途径的
调控。在15% PEG胁迫处理12 h后, 甘蔗根和叶中
SoNIN1表达都被诱导提高, 这与启动子序列上参与
干旱诱导的MYB结合位点, 以及在受到脱落酸、赤
霉素和茉莉酸甲酯等外源激素诱导时, 与启动子上
相应的作用元件之间有无直接联系及其作用模式 ,
还需要进一步的验证。下一步我们将构建启动子序
列瞬时表达载体, 在拟南芥中验证SoNIN1基因的启
动子序列的功能。
NaCl和PEG胁迫提高甘蔗SoNIN1在根叶中的差
异表达, 但对贮藏蔗糖的器官—茎的蔗糖代谢的影
响和关系, 有待进一步研究。本研究中, 甘蔗中性/
碱性转化酶基因的克隆及其表达分析, 不仅为中性/
碱性转化酶基因家族增添了新的成员, 同时为进一
步研究该基因在甘蔗蔗糖积累中作用及其功能鉴定
打下了良好的基础。
4 结论
从甘蔗中克隆到一个中性/碱性转化酶基因, 基
因全长 2289 bp, 编码 603个氨基酸。具有中性/碱性
转化酶基因保守结构域 Pfam: Invertase_neut, N-端
不含跨膜结构和信号肽序列。SoNIN1 5′端侧翼启动
子序列长 1174 bp, 除了具有基因启动子的特定结构
TATA-box和 CAAT-b box, 还含有赤霉素、脱落酸、
茉莉酸甲酯响应元件以及与干旱诱导的 MYB 结合
位点等特异的作用元件。SoNIN1 为组成型表达, 生
理成熟期表达量在甘蔗叶中最大, 芽中次之, 而在
+1 节间中最低。PEG 胁迫和 NaCl 能诱导该基因在
根和叶中的表达。
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