全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(8): 13921402 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由天津市自然科学基金重点项目(12JCZDJC23000), 霍英东教育基金会高等院校青年教师基金(131026)和天津市动植物抗性重
点实验室开放基金项目资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 王华忠, E-mail: skywhz@mail.tjnu.edu.cn
Received(收稿日期): 2013-11-20; Accepted(接受日期): 2014-04-16; Published online(网络出版日期): 2014-06-03.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20140603.1552.010.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.01392
小麦自噬相关基因 ATG10的克隆及白粉菌侵染诱导的 ATG10的表达
张 微 1 孙 鸿 1 邢莉萍 2 卫晓静 1 王华忠 1,*
1 天津师范大学生命科学学院 / 天津市动植物抗性重点实验室, 天津 300387; 2 南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室,
江苏南京 210095
摘 要: 细胞自噬是一种保守的真核生物细胞内物质分解和循环利用机制, 在植物生长、发育和逆境响应等过程中
均扮演了重要角色。自噬相关蛋白 ATG10是参与自噬小体形成的关键因子之一。利用同源克隆方法, 从经白粉病菌
诱导 48 h的小麦材料 92R137/扬麦 1587中克隆了 ATG10基因家族 3个成员(TaATG10a、TaATG10b和 TaATG10c)。序
列特征分析、物种间的比较和进化分析, 以及酵母功能互补实验结果证实, 这 3 个基因均为酵母 ATG10 的功能性同
源基因。TaATG10a和 TaATG10b的基因组序列具有相似的 6外显子-5内含子基因结构。RT-PCR分析还发现这 2个
基因都具有 2 种可变剪接产物。TaATG10a 和 TaATG10b 的 GFP 融合蛋白被定位于洋葱表皮细胞的细胞质中。白粉
菌侵染能够诱导 TaATG10a和 TaATG10b表达, 因此推测, 小麦针对白粉菌侵染的免疫反应涉及对 TaATG10及其参与
的自噬过程的调控, 其调控模式因小麦抗、感白粉病反应、不同类型抗病基因介导的免疫反应和不同遗传背景下的
感病反应而差异明显, 说明 TaATG10及其参与的自噬过程与小麦—白粉菌互作反应关系的复杂性。从外源激素处理
诱导的表达情况还发现, 抗、感白粉病的表型差异可能涉及抗、感材料 TaATG10基因对同种激素(SA、乙烯或 ABA)
信号的不同响应模式。
关键词: 小麦; 自噬相关基因; 白粉病
Cloning of Autophagy-related Genes, ATG10s, in Wheat and Their Expression
Characteristics Induced by Blumeria graminis f. sp. tritici
ZHANG Wei1, SUN Hong1, XING Li-Ping2, WEI Xiao-Jing1, and WANG Hua-Zhong1,*
1 School of Life Sciences, Tianjin Normal University / Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance, Tianjin 300387, China; 2 National Key
Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: Autophagy, a conserved eukaryotic cellular process functioning in material decomposition and nutrient recycling, is
deeply involved in plant growth, development, and response to stress. ATG10 is one of the key factors required in autophagosome
formation. In this study, we identified three members (TaATG10a, TaATG10b, and TaATG10c) of the ATG10 family in common
wheat 92R137/Yangmai 1587 induced by Blumeria graminis f. sp. tritici (Bgt) for 48 h, using homologous cloning technique. The
three TaAGT10s shared high similarity with their counterparts from other model plants. Expression of TaATG10a or TaATG10b
rescued the autophagy process in ATG10-defective yeast mutant, suggesting that both genes are functional homologues of yeast
ATG10. TaATG10a and TaATG10b had similar gene models containing six exons and five introns, and both had two alternatively
spliced mRNA isoforms according to RT-PCR assay. TaATG10a- and TaATG10b-GFP fusion structures were localized in cytosol
of onion epidermal cells. The expressions of TaATG10a and TaATG10b were induced by the infection of Bgt, implying that
TaATG10s and their involved autophagy process are implicated in the wheat immune response to Bgt. This implication is com-
plex because the regulated expression profiles of TaATG10a and TaATG10b are different between resistant and susceptible reac-
tions, between different types of resistance gene-mediated immune reactions, and between susceptible reactions on different ge-
netic backgrounds. Besides, exogenous phytohormones also modulated the expression of TaATG10a and TaATG10b. Different
Bgt immune reactions might result partially from the different response patterns of TaATG10s to salicylic acid, ethylene, or ab-
scisic acid signaling pathways between in resistant genotypes and in susceptible genotypes.
第 8期 张 微等: 小麦自噬相关基因 ATG10的克隆及白粉菌侵染诱导的 ATG10的表达 1393


Keywords: Triticum aestivum L.; Autophagy-related genes; Powdery mildew
泛素-蛋白酶体途径和细胞自噬(autophagy)途径
是真核细胞中 2 种主要的蛋白质降解机制。前者选
择性地快速降解泛素标记的短寿命蛋白; 后者通常
非特异性地降解长寿命的蛋白质、蛋白质聚集物乃
至细胞器, 负责饥饿状态下的细胞内物质分解和循
环利用。细胞自噬主要有巨自噬、微自噬和分子伴
侣介导自噬 3 种形式。在巨自噬过程中, 批量细胞
质成分或细胞器被包裹进入双层膜结构的自噬小体
(autophagosome), 随着自噬小体外膜与液泡膜(动物
细胞为溶酶体)的融合, 内膜及包裹的物质(自噬小
泡, autophagic body)进入液泡腔被分解; 微自噬是
细胞质物质直接被液泡膜吞陷从而降解的过程; 分
子伴侣介导的细胞自噬只存在于哺乳动物细胞中 ,
其对降解底物有一定的选择性, 识别过程也需要分
子伴侣 Hsc70的协助[1-3]。在 3种自噬形式中, 巨自
噬(下文称细胞自噬)是细胞内最普遍的一种自噬形
式。对自噬过程分子机制的了解最初来对自酵母突
变体的研究[4-5]。目前, 从酵母中已经鉴定了 32个重
要自噬相关基因(autophagy-related gene, ATG)[1-2]。
这些 ATG基因的编码产物参与了自噬信号的感知、
前自噬小体膜的起始和延伸、自噬小体的成熟以及
与液泡的融合等过程[6]。模式生物基因组序列的比
较分析发现, 高等植物和动物中广泛存在酵母 ATG
的同源基因[1-2]。近年来, 高等生物自噬机制的深入
研究证明了细胞自噬过程在真核生物中的保守性[7]。
目前, 细胞自噬分子机制尚未完全解开, 其中 2
个类泛素连接系统较为清楚[8]。ATG8 和 ATG12 是
连接系统中的 2 个标签蛋白。ATG8 前体的 C 端经
具有半胱氨酸蛋白酶活性的 ATG4 酶切后暴露出保
守的甘氨酸残基; ATG12 翻译完成后即为具有 C 末
端保守甘氨酸残基的成熟形式。连接过程的第一步
是 ATG8和 ATG12的末端甘氨酸连接于具有类泛素
活化酶(E1)活性的 ATG7 半胱氨酸上(硫酯键), 此过
程依赖 ATP提供能量。然后 ATG8和 ATG12分别被
转移到具有类泛素接合酶 (E2)活性的 ATG3 或
ATG10上。最后 ATG8与脂类物质磷脂酰乙醇胺(PE)
相连形成 ATG8-PE; ATG12 则与 ATG5 连接。
ATG12-ATG5 连接物进一步与 ATG16 相互作用, 并
经 ATG16寡聚化形成包含 4个 ATG12-ATG5·ATG16
的复合物 [9]。此复合物可能作为类泛素连接酶(E3)
指导 ATG8-PE连接物形成的最后一步反应[10-11]。
ATG10指导 ATG12-ATG5连结物形成的最后一
步反应, 因此是自噬过程的关键因子之一。到目前
为止, 植物上有关 ATG10 基因的鉴定及其在自噬过
程中的功能研究主要集中在模式物种拟南芥[12-14]和
水稻上 [15]。拟南芥 atg10 突变体不能正常形成
ATG12-ATG5 连接物[12], 拟南芥和水稻上的 ATG10
突变均严重影响自噬小体的积累[12,15], 表明 ATG10
在植物细胞自噬中的关键作用及在真核生物中的功
能保守性。与其他重要 ATG 基因突变体类似, 拟南
芥和水稻的 atg10 突变体表现出典型的自噬缺陷表
型, 如发育迟缓、结实量下降、加速衰老和对 N 源
/C 源缺乏、高盐和氧化胁迫等逆境环境的敏感性增
强[12-15]。细胞自噬在植物先天性免疫反应中也扮演
了重要角色[16-17]。就 ATG10 基因而言, 该基因参与
的自噬过程正调控拟南芥对腐生真菌 Alternaria
brassicicola 的抗性[13-14], 相反负调控对半活体寄生
细菌病原 Pseudomonas syringae[14]和活体寄生白粉
病真菌病原 Golovinomyces cichoracearum的抗性[18]。
细胞自噬调控植物免疫反应的过程还与病原侵染诱
导的细胞死亡及激素信号途径密切相关[2]。
细胞自噬参与了植物多种生理和逆境响应过程,
与农作物重要农艺性状密切相关, 因此急需在重要
农作物上开展细胞自噬分子机制及生理功能研究。
本研究鉴定了 3 个小麦 ATG10 基因, 分析了其编码
蛋白的结构域、与其他物种蛋白序列的进化关系 ,
以及基因序列特征 , 并初步证实了所克隆的
TaATG10 基因表达特性和功能, 为探索小麦 ATG10
及其参与的自噬过程与小麦响应白粉菌侵染的免疫
反应之间的关系奠定基础。
1 材料与方法
1.1 植物材料与白粉菌菌株
携带广谱抗白粉病基因 Pm21 的小麦材料
92R137/扬麦 1587用于 ATG10基因的克隆。92R137/
扬麦 1587及其感白粉病近等基因系扬麦 158、携带
小种专一性抗白粉病基因 Pm3f 的小麦材料 Mich.
Amber/Chancellor8 及 其 感 白 粉 病 近 等 基 因 系
Chancellor 用于小麦 ATG10 基因的表达分析。将小
麦种子播于含有混合黑土、蛭石和珍珠岩的盆钵中,
置光照培养箱中生长。生长条件为 22℃(白天)/18℃
(黑夜)和 16 h光照/8 h黑暗。
北方地区流行的白粉菌 E09 菌株保存繁殖于感
病材料苏麦 3号上。2个抗病小麦材料对 E09菌株表
1394 作 物 学 报 第 40卷

现免疫; 扬麦 158和 Chancellor对该菌株表现感病。
1.2 小麦 ATG10基因的克隆与序列分析
以拟南芥和水稻的ATG10蛋白质序列作为输入
序列, 使用 tBLASTN 搜索 GenBank 的 dbEST 数据
库获得编码 ATG10 的小麦 EST。使用 Vector NTI
Advance 11.5对获得的 EST进行拼接。如有必要, 以
拼接所得 contig作为输入序列通过 BLASTN查找两
端新的 EST进行电子延伸, 以获得覆盖全长 ORF的
contig。根据 contig 序列设计引物对 TaATG10a-F
(5-CAGCATCTCCGTTTCCAAAT-3) / TaATG10a-R
(5-CCCATTTCACTCACCCAAAT-3)和 TaATG 10b-F
(5-GGATACTTGACTGCCTCGTTGGT-3) / TaATG10b-
R (5-AAGCAAAATAAGAGGTGGACACT-3)用于
小麦 ATG10基因全长 ORF的 RT-PCR扩增。
当 92R137/扬麦 1587 长至二叶期时, 采用人工
抖落法高密度接种白粉菌分生孢子作为胁迫处理诱
导自噬相关基因的表达。接种白粉菌 48 h后取叶片
用于 RNA 提取和基因克隆。使用 TRIzol 法提取小
麦叶片的总 RNA。使用 Quantscript RT试剂盒(天根)
并参照手册合成 cDNA的第 1链。以 cDNA第 1链
作为模板, 使用高保真的 pfu DNA聚合酶扩增小麦
ATG10基因, 扩增程序为 94℃预变性 4 min; 94℃变
性 30 s, 55℃退火 30s, 72℃延伸 90 s, 循环 34次; 72℃
延伸 10 min。将扩增片段 3端加 A 后克隆到载体
pGEM-T Easy (Promega)上。重组克隆送北京六合华
大基因公司测序。克隆到的小麦 ATG10基因序列提
交到 GenBank。
使用 SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)
预测蛋白质保守的结构域。使用 ClustalX 2.1 进行
cDNA 和蛋白质序列的多序列比对。使用 Neighbor-
joining 法在 MEGA 4.0 中构建进化树, 并对进化树
进行重复抽样 1000 次的 bootstrap 检验。以克隆到
的小麦 ATG10基因 cDNA序列作为输入序列, 在小
麦基因组草图 contig 数据库(cerealsdb, http://www.
cerealsdb.uk.net)中进行 BLAST比对查询和拼接, 获
得 ATG10基因的基因组序列。通过比对 cDNA和基
因组序列(Splign, NCBI)获得基因组序列的外显子-
内含子组织结构(基因模型)信息。
1.3 基因的染色体定位
提取小麦全套缺体-四体材料 DNA 作为模板,
设计基因特异性引物分别扩增 TaATG10a、
TaATG1010b和 TaATG1010c基因。扩增 TaATG10a
基因的引物对为 10aF (5-GAGCATGATACCTTGG
TTCAGAGC-3) / 10aR (5-AACAACTGAAGTGAG
TGAGGAGGAA-3), 扩增 TaATG10b 基因的引物
对为 10bF (5-GATACCTCGGTTCAGAGCTCTAG
GG-3) / 10bR (5-CCCACCAGCCTGAAGACCTTG
AA-3), 扩增 TaATG10c 基因的引物对为 10cF
(5-GATTCTTGCCCGCCTTGTTG-3) / 10cR (5-CA
TCATCAGGGACAGGGTCG-3)。扩增产物经 8%的
PAGE 和银染, 根据扩增片段有无鉴定基因的染色
体定位。
1.4 亚细胞定位
设计 5端添加了 Kpn I 位点的上游引物和添加了
BamH I 位点的下游引物 GFP10aF (5-GGGGTACCAT
GGGGGGCTCCTCCGTG-3) / GFP10aR (5-CGGGATCC
TGAACTGCAATAAAGCTT-3)和 GFP10bF (5-GGGG
TACCATGGGGAGCTCCTCCGCG-3) / GFP10bR (5-CG
GGATCCTGAACTGCAATAAAGCTT-3), 使用pfu DNA
聚合酶分别扩增获得TaATG10a和TaATG10b基因全长
ORF的 Kpn I–BamH I片段。将扩增片段酶切后连接
到表达载体 pHBT-sGFP-NOS的 GFP基因上游。该
载体上, TaATG10-GFP融合基因由串联的 35S启动
子和玉米 C4ppdkZm1基因启动子驱动。参考 Scott 等[19]
的方法, 使用基因枪将构建载体质粒导入洋葱表皮
细胞。转化后 24 h, 使用荧光显微镜 (DM5000B,
Leica)观察 GFP荧光。
1.5 酵母表达载体的构建以及酵母 ATG10 基因
突变菌株的互补分析
设计合成两端添加 Not I 识别位点的 PCR引物
对 10aNOTI-F (5-ATAAGAATGCGGCCGCATGGG
GGGCTCCTCCGTGTG-3) / 10aNOTI-R (5-ATAAG
AATGCGGCCGCCTATGAACTGCAATAAAGC-3)
和 10bNO TI-F (5-ATAAGAATGCGGC CGCATGGG
GAGCTCCTCCGCGTG) / 10bNOTI-R (5-ATAAGA
ATGCGGCCGCCTATGAACTGCAATAAAGCT-3),
使用 pfu DNA聚合酶从 T载体上分别扩增 2个已克
隆的小麦 ATG10基因的全长 ORF。扩增片段经 Not I
酶切后插入酵母表达载体 pFL61上的 PGK启动子下
游 Not I位点处。通过测序鉴定目标基因的正确插入
方向 (起始密码子紧邻启动子 )。野生型酵母菌株
BY4741 和突变体菌株 ATG10Δ (BY4741, atg10Δ::
kanMX, MATa; his3Δ1; leu2Δ0; met15Δ0; ura3Δ0)
购于 Open Biosystems (Thermo Scientific)。用醋酸锂
法[20]将重组表达载体转化到酵母 ATG10Δ菌株中。
利用 SC-Ura固体培养基筛选转化成功的阳性细胞。
酵母功能互补实验参照 Fujiki等[21]描述的方法,
挑取 SC-Ura 固体培养基上生长的酵母单菌落接种
到 SC液体培养基中, 于 30℃下过夜振荡培养; 离心
第 8期 张 微等: 小麦自噬相关基因 ATG10的克隆及白粉菌侵染诱导的 ATG10的表达 1395


收集对数生长期(OD600为 1.0 左右)的酵母细胞, 用
生理盐水洗涤 2 次; 加入含有终浓度 1 mmol L–1
PMSF的 YNB培养基(只含有 0.67%酵母氮源, 无氨
基酸、硫酸铵和葡萄糖)后继续振荡培养 5 h。在微
分干涉显微镜(DM5000B, Leica)下观察酵母细胞液
泡内自噬小泡的积累。
1.6 白粉菌接种和激素处理后的表达分析
小麦二叶期, 采用人工抖落法高密度接种新鲜
白粉菌孢子, 或喷施 4 种外源激素进行诱导处理。
激素浓度为水杨酸 (SA) 2 mmol L–1、茉莉酸甲酯
(Me-JA) 1 mmol L–1、乙烯利(有效成分为乙烯) 200
μmol L–1和脱落酸(ABA) 100 μmol L–1, 喷施前均加
入 0.05% Tween-20, 以喷施 0.05% Tween-20 做对
照。分别于白粉菌接种后 0、6、10、16、24、36 h
或激素处理后 0、3、6、12、24 h取叶片提取 RNA,
反转录合成 cDNA。
根据 TaATG10 序列设计特异引物, 其中引物对
q10a-F (5-AGAGGGGTTCGTAGCTCTTG-3) / q10a-R
(5 -TCTGCACCATCATCAGGGAC-3 )用于扩增
TaATG10a 片段(96 bp), 引物对 q10b-F (5-CCAAG
TGGAGGGGGATTGAT-3) / q10b-R (5-TCCTTCG
AGGGCTACAAACC-3)用于扩增 TaATG10b 片段
(107 bp), 引物对 q10-F (5-CCAAGTGGAGGGGGATT
GAT-3) / q10-R (5-TCCTTCGAGGGCTACAAACC-3)
同时扩增 TaATG10a 和 TaATG10b 的保守片段
(172 bp)。采用 SYBR green法和 RealMaster Mix试剂
盒(天根)在 IQ5 (Biorad)上进行定量 PCR扩增、信号
检测和溶解曲线分析。每个样品设 3次重复。以小麦
Tubulin (U76558)为内参基因, 其扩增引物序列为
Tubulin F: 5-GTGGAACTGGCTCTGGC-3; Tubulin R:
5-CGCTCAATGTCAAGGGA-3, 预期扩增片段为
234 bp。采用 2–ΔΔCt法[22]计算相对表达量。
1.7 原核表达和蛋白质纯化
构建酵母表达载体时, 将扩增得到的 TaATG10b
基因的 Not I-Not I片段克隆到原核表达载体 pET30a
的 Not I 位点处, 测序鉴定正确插入方向(起始密码
子紧邻 T7启动子)的重组表达载体 pET-ATG10b。采
用热激法将表达载体导入大肠杆菌 BL21 (DE3)。经
1 mmol L–1 IPTG诱导表达后, 使用 Ni-Agarose His
标签蛋白纯化试剂盒(康为世纪, 北京)在非变性条
件下纯化获得 His(6)-TaATG10b重组蛋白。
2 结果与分析
2.1 小麦 TaATG10基因的克隆及其染色体定位
利用拟南芥和水稻 ATG10 的同源序列设计引物,
从小麦中克隆了 3个ATG10基因(TaATG10a、TaATG10b
和 TaATG10c), 其中 TaATG10a (GenBank 登录号为
KF294817)和 TaATG10b (GenBank登录号为KF294818)
为从白粉菌侵染诱导的抗病小麦材料 92R137/扬麦
1587 cDNA 中经 RT-PCR 扩增得到的 cDNA 克隆,
TaATG10c由 EST 拼接而来。TaATG10a 的 ORF 全长
648 bp, 编码 215个氨基酸; TaATG10b和 TaATG10c的
ORF全长均为 651 bp, 编码 216个氨基酸。
利用中国春缺体-四体材料, 经特异引物 PCR
扩增进行 TaATG10染色体定位, 结果 3个 ATG10基
因均被定位于第 2 部分同源群染色体上。其中
TaATG10a被定位于 2A染色体上; TaATG10b被定位于
2D染色体上, TaATG10c被定位于 2B染色体上(图 1)。
通过与中国春草图序列 [23]、A 组染色体祖先物种

图 1 小麦 ATG10基因的染色体定位
Fig. 1 Chromosomal localization of wheat ATG10
M: DL2000 marker; 1: H2O; 2: 中国春; 3: N1AT1B; 4: N1BT1A; 5: N1DT1A; 6: N2AT2B; 7: N2BT2A; 8: N2DT2A; 9: N3AT3B;
10: N3BT3A; 11: N3DT3A; 12: N4AT4B; 13: N4BT4A; 14: N4DT4A; 15: N5AT5B; 16: N5BT5A; 17: N5DT5A; 18: N6AT6B; 19: N6BT6A;
20: N6DT6A; 21: N7AT7D; 22: N7BT7D; 23: N7DT7B。箭头示扩增片段缺失。
M: DL2000 marker; 1: H2O; 2: Chinese Spring; 3: N1AT1B; 4: N1BT1A; 5: N1DT1A; 6: N2AT2B; 7: N2BT2A; 8: N2DT2A; 9: N3AT3B;
10: N3BT3A; 11: N3DT3A; 12: N4AT4B; 13: N4BT4A; 14: N4DT4A; 15: N5AT5B; 16: N5BT5A; 17: N5DT5A; 18: N6AT6B; 19: N6BT6A;
20: N6DT6A; 21: N7AT7D; 22: N7BT7D; 23: N7DT7B. Arrowheads show the missing fragments.

1396 作 物 学 报 第 40卷

Triticum uratu 和 D 组染色体祖先物种 Aegilops
tauschii 基因组序列[24-25]进行 BLAST 比对, 发现位
于 2D 染色体上的一个 TaATG10 同源位点的
scaffold1072 序列 (Ae. tauschii 基因组序列 )与
TaATG10a和 TaATG10b在匹配区段内的相似性分别
为 77%和 80%。
2.2 TaATG10序列分析
TaATG10a和 TaATG10c缺失了 TaATG10b第 82
位的 Asp; 而 TaATG10a 和 TaATG10b 也缺失了
TaATG10c第 34位的 Asp (图 2-A)。3个基因核酸序
列和氨基酸序列的相似性分别为 94.3%~95.8%和
94.0%~95.0%。3 个小麦 ATG10 都含有 1 个保守的
Autophagy_act_C结构域(autophagocytosis associated
protein, active-site domain, Pfam: PF03987), 其位置
是 TaATG10a 的 102~170 残基 , TaATG10b 和
TaATG10c的 103~171残基(图 2-A)。在 ATG12-ATG5
连接物的形成步骤中, 经 ATG7 活化后的 ATG12 通
过硫酯键连接到ATG10上, 该硫酯键是在ATG12的
末端甘氨酸与 ATG10 的一个保守的半胱氨酸之间形
成[2,8]。3个小麦 ATG10都含有 ATG12结合位点的保
守半胱氨酸残基 , 分别是 TaATG10a 的 Cys169 及
TaATG10b和 TaATG10c的 Cys170 (图 2-A)。这个半胱
氨酸在所有的真核生物 ATG10中都非常保守[26]。
3个 TaATG10与其他植物 ATG10的相似性分别
为 60% (拟南芥)、73%~75% (玉米)和 76%~78% (水
稻)。小麦 ATG10与酵母和小鼠的 ATG10相似性分
别只有 30%~31%和 40%~41%。双子叶植物和单子
叶植物的 ATG10位于 2个进化支上; 部分植物具有
2个或多个 ATG10拷贝, 在进化树上种内 ATG10聚
类在距离最近的末端分支上(图 2-B)。推测 ATG10
基因的扩增事件可能发生在各物种形成之后。
2.3 TaATG10转录剪接模式
RT-PCR分析结果显示, 除编码正常功能蛋白的
mRNA外, TaATG10a和 TaATG10b还可转录形成中
间连续缺失 53 bp的短 mRNA, 且该短 mRNA分子
与正常的长 mRNA 分子序列仅相差上述 53 bp, 表
明它们可能是同一基因不同剪接模型(splice variant,
SV)的产物。将 cDNA序列与基因组序列比较, 建立
了 TaATG10a 和 TaATG10b 基因的外显子–内含子结
构模型(图 3)。TaATG10a和 TaATG10b具有相似的 6
外显子-5 内含子结构。SV1 剪接方式产生编码正常
功能蛋白的 mRNA。在 SV2 剪接方式中, 内含子 3
扩展到外显子 4 的前 53 bp。SV2 剪接方式产生的
mRNA 编码由于翻译提前终止导致的 C端截短的
TaATG10 isoform, 且 C端缺失的部分包括了重要的
ATG12结合位点半胱氨酸(图 3)。
2.4 TaATG10的亚细胞定位
TaATG10a-GFP 和 TaATG10b-GFP 的荧光信号
在洋葱表皮细胞中均弥散分布于整个细胞质, 与对
照 GFP差异不大(图 4)。
2.5 小麦 ATG10基因互补酵母 ATG10突变体分析
为了验证小麦 ATG10 在物种间功能上的保守性,
构建了小麦 TaATG10a和 TaATG10b的酵母表达载体
(pFL-TaATG10a 和 pFL-TaATG10b)并导入到相应基
因突变的酵母(ATG10Δ)细胞中。在营养缺陷和蛋白
酶抑制剂 PMSF 处理条件下, 自噬小泡在野生型酵
母BY4741的液泡中大量积累, 而在ATG10Δ突变型
的酵母液泡中很少观察到。表达 TaATG10a 或
TaATG10b的 ATG10Δ酵母部分恢复了自噬功能, 液
泡中的自噬小泡数量显著增加(图 5)。这一结果说明
本研究克隆的 2个 TaATG10基因是酵母 ATG10的功
能性同源基因。
2.6 TaATG10的诱导表达特征
2.6.1 白粉菌诱导表达 在 Pm21 (广谱抗性)近
等基因系中, TaATG10a和 TaATG10b都表现白粉菌
诱导的上调表达, 但抗、感反应的表达模式不同。
抗病反应中 2个基因在接种白粉菌后 0~10 h和 16~
24 h 呈 2 次显著诱导表达, 而感病反应中 2 个基因
只在接种后 16~24 h有诱导表达特征; 接种后 0~16 h,
2 个基因在感病反应中呈现显著的表达抑制, 而在
抗病反应中呈相反趋势(图 6-A)。
在 Pm3f (小种专化抗性 )近等基因系中 ,
TaATG10a和 TaATG10b的表达特征与在 Pm21近等
基因系中有明显差别。接种 6 h后, 2个基因在抗病
系中的表达均受抑制, 而在感病系(Chancellor)中却
表现 2次诱导上调表达(接种后 0~6 h和 10~16 h); 同
时检测 2 个基因表达水平(TaATG10a+TaATG10b)也
获得类似结果(图 6-B)。
白粉菌的诱导表达现象说明 ATG10 蛋白及其
参与的自噬过程与小麦抗白粉病反应密切相关。但
是对 ATG10 基因表达的调节在抗、感反应之间, 在
不同类型的抗病反应和不同遗传背景的感病反应之
间均存在差异。
2.6.2 外源激素诱导表达 利用 Pm21 近等基因
系分析 TaATG10a、TaATG10b 响应外源激素诱导的
相对表达量, 发现不同激素处理后抗感材料呈现不
第 8期 张 微等: 小麦自噬相关基因 ATG10的克隆及白粉菌侵染诱导的 ATG10的表达 1397


同的表达模式(图7)。外源乙烯处理后, 抗、感材料中
2个基因首先表现短时间(处理后 0~3 h)受抑制, 而后
在感病材料上呈上调表达, 至 12 h达到峰值, 而在抗
病材料则呈持续下调表达。SA 处理后, 2 个基因的
表达模式与乙烯处理类似, 在感病材料上表现激活
作用, 而在抗病材料中表现抑制作用。Me-JA处理后,
抗、感材料中 2个基因均为下调表达, 但在抗病材料
中下调时间更早、持续时间更长, 说明 Me-JA 对

图 2 小麦 ATG10和其他物种同源蛋白的比较
Fig. 2 Sequence comparison of wheat ATG10s with homologues from other species
A: 小麦 ATG10和模式物种同源蛋白的多序列比对。直线示保守的 Autophagy_act_C结构域; *号示保守的 ATG12结合位点半胱氨酸。
B: 真核生物 ATG10同源蛋白的进化树(Neighbor-joining)。分支处的数字表示评估结果的置信水平(%)。
A: multiple alignment of wheat ATG10s and homologues from model organisms. The predicted Autophagy_act_C domain is under thick lines.
The asterisk mark (*) shows the conserved cysteine residue at the ATG12-binding site. B: phylogenic tree of eukaryotic ATG10 proteins
(Neighbor-joining). The reliabilities of internal branches are shown in percentages.
Ta: Triticum aestivum; Bd: Brachypodium distachyon; Os: Oryza sativa; Si: Setaria italic; Zm: Zea mays; Sb: Sorghum bicolor;
Sl: Solanum lycopersicum; At: Arabidopsis thaliana; Cs: Cucumis sativus; Rc: Ricinus communis; Pt: Populus trichocarpa;
Vv: Vitis vinifera; Gm: Glycine max; Mm: Mus musculus; Sc: Saccharomyces cerevisiae.
1398 作 物 学 报 第 40卷


图 3 TaATG10a和 TaATG10b的基因模型和选择性剪接模式
Fig. 3 Diagram of TaATG10a and TaATG10b genomic
structures and alternative splicing models
方框代表外显子, 直线代表内含子, 黑色方框代表编码序列, 白
色方框代表非翻译区。
Boxes are exons and lines between boxes are introns. Black boxes
are coding regions, and white boxes indicate untranslated regions.
TaATG10a和TaATG10b的表达抑制作用在抗病系中
更突出。外源 ABA处理后, 在感病材料中 2个基因
的表达受抑制, 而在抗病材料上首先表现为被抑制
(接种后 0~6 h), 此后明显变为被激活。同时检测 2
个基因表达水平, 也获得了类似的结果。
2.7 TaATG10b的原核表达和蛋白纯化
利用构建的 TaATG10b 原核表达载体, 将该基因
导入大肠杆菌, 经 IPTG诱导表达和 Ni柱亲和层析过
程获得了纯化蛋白(图 8)。该蛋白的分子量为 24.26 kD,
再加上克隆到载体上后引入的N端标签分子量6.8 kD,
结果与理论值(~31 kD)相符, 表明本试验获得了纯度
较高的原核表达产物, 可以满足抗体制备要求。

图 4 TaATG10-GFP融合蛋白在洋葱表皮细胞中的亚细胞定位
Fig. 4 Subcellular localization of TaATG10-GFP fusion structures in onion epidermal cells (Bar = 100 μm)

图 5 TaATG10基因互补酵母 ATG10突变体分析
Fig. 5 Functional complementation of ATG10-defective yeast by TaATG10 genes

3 讨论
细胞自噬在植物生长、发育、衰老和逆境胁迫
响应等过程中均扮演了重要角色。ATG10 作为参与
自噬小体形成的核心因子之一, 指导 ATG12-ATG5
连接物形成的最后一步反应[6,8]。已在拟南芥[12]和水
稻[15]中分别鉴定了 1个和 2个 ATG10基因。突变体
分析表明, 植物ATG10与酵母ATG10同样都在自噬
小体形成过程中不可或缺[12,15]。本研究在小麦上鉴
定了 3 个 ATG10 基因, 三者序列高度相似, 在进化
树上被聚类在相邻的末端分支上。染色体定位结果
也表明 3个 TaATG10均定位于小麦第 2部分同源群
染色体 2A (TaATG10a)、 2B (TaATG10c)和 2D
(TaATG10b)上。3个小麦 ATG10基因的表达产物都
含有保守的Autophagy_act_C结构域和 ATG12结合
位点半胱氨酸残基。亚细胞定位显示 TaATG10a 和
第 8期 张 微等: 小麦自噬相关基因 ATG10的克隆及白粉菌侵染诱导的 ATG10的表达 1399


TaATG10b 的编码蛋白定位于细胞质, 这与已报道
的酵母ATG10和水稻ATG10b的细胞质定位结果[12,15]
一致。拟南芥的 ATG4[27]、ATG6[21]和 ATG8[28]和烟
草的 ATG6[29]能够互补酵母相应基因突变株的自噬
功能。本研究发现小麦 TaATG10a和 TaATG10b也能
够互补酵母 ATG10 基因突变株的自噬功能, 进一步
说明这 2个基因是酵母 ATG10的功能性同源基因。
TaATG10a和 TaATG10b具有类似的 2种可变剪接模
式, SV1 剪接模型产生编码正常功能蛋白的 mRNA,
SV2剪接模型产生的 mRNA编码 C端截短的可能无
功能的 isoform。2 种可变剪接方式的存在可能是小
麦 ATG10基因表达调控的一种方式。

图 6 白粉菌侵染条件下 TaATG10a和 TaATG10b的相对表达
Fig. 6 Relative expression levels of TaATG10a and TaATG10b in response to infection by Blumeria graminis f. sp. tritici (Bgt)
A: 抗病材料为 92R137/扬麦 1587(Pm21), 感病材料为扬麦 158; B: 抗病材料为Mich.Amber/Chancellor8(Pm3f), 感病材料为Chancellor。
A: the resistant line is 92R137/Yangmai 1587 (Pm21) and the susceptible line is Yangmai 158; B: the resistant line is
Mich.Amber/Chancellor8(Pm3f) and the susceptible line is Chancellor.

图 7 外源激素诱导下 TaATG10a和 TaATG10b在 Pm21近等基因系中的相对表达
Fig. 7 Relative expression levels of TaATG10a and TaATG10b induced by exogenous phytohormones in Pm21 isogenic lines
1400 作 物 学 报 第 40卷


图 8 TaATG10b的原核表达和纯化
Fig. 8 Prokaryotic expression and purification of TaATG10b
M: 分子量标准; 1: 未诱导对照; 2: IPTG诱导 2 h; 3: IPTG诱导
6.5 h; 4~8: TaATG10b的 Ni 柱亲和层析过程收集液, 其中 4为流
穿液; 5和 6为 300 mmol L–1咪唑洗脱第 1、第 2管收集液; 7和 8
为 500 mmol L–1咪唑洗脱第 1、第 2管收集液。箭头示目标蛋白。
M: protein ruler; 1: E. coli lysate of non-induction control; 2: in-
duced by IPTG for 2 h; 3: induced by IPTG for 6.5 h; 4–8: collec-
tions in the process of TaATG10b purification by Ni affinity chro-
matography, including flow-through fraction (4), the first (5) and
second (6) one-milliliter elute of 300 mmol L–1 imidazole and the
first (7) and second (8) one-milliliter elute of 500 mmol L–1 imida-
zole. The arrow indicates the expressed product of TaATG10b.

动物细胞自噬与免疫过程密切相关, 这种细胞
自噬参与的清除入侵细病原菌、寄生虫和病毒的过
程被称为 Xenophagy[30]。病原侵染也能够诱导植物
ATG10基因及其他 ATG基因的上调表达, 进而激活
细胞自噬活性。植物细胞自噬与先天性免疫的关系
已经在多种拟南芥-病原系统中得到证实, 并成为近
年来植物细胞自噬功能的研究热点[2,16-17]。如拟南芥
atg10 突变体对腐生真菌 A. brassicicola 的感病性增
强[13], 但对半活体寄生细菌病原 P. syringae和活体寄
生白粉病真菌病原 G. cichoracearum的抗性提高[14,18]。
为了揭示 ATG10 基因与小麦响应白粉菌侵染的关系,
本研究系统分析了 2 个抗病反应和 2 个感病反应在
白粉菌侵染早期对小麦 ATG10 基因表达的调控情
况。在接种白粉菌后 36 h内, TaATG10a和 TaATG10b
在 Pm21介导的抗病反应中分别在 0~10 h和 16~24 h
呈现 2 次上调表达 , 这与感病近等基因系扬麦 158
上的先抑制后诱导表达模式明显不同。接种后
0~16 h 是小麦表皮细胞通过接触而识别入侵白粉菌,
并诱导一系列抗病反应抵抗白粉菌入侵的关键时
期。这一时期 TaATG10基因在抗、感 2种反应中呈
现迥异的表达模式, 说明在接种白粉菌后发生较早
的一次 ATG10基因激活对 Pm21介导的抗病反应至
关重要。而较晚(接种后 16~24 h)出现一次的诱导表
达, 2个TaATG10基因在感病反应(扬麦158和Chancellor)
中的诱导表达程度明显高于抗病反应中, 其原因可
能是接种 16 h后感病反应中有更多的白粉菌孢子成
功侵入小麦表皮细胞, 随后进入吸器发育和建立寄
生关系阶段, 因而这一时期激活的防卫反应以及相
关的自噬过程在感病反应中表现更为明显。
出乎意料的是, Pm3f 介导的小种专一性抗病反
应并没有诱导 2个 TaATG10基因的表达, 相反抑制
了基因表达。其原因可能包括以下几个方面: (1)不同
ATG10家族成员功能有所不同, TaATG10c或其他可
能存在而没有得到鉴定的小麦 ATG10参与了小麦对
白粉菌侵染的响应。(2)在某些抗病反应类型或某些
植物-病原菌系统中, ATG10的表达程度与自噬活性
并不一致。Shin 等 [15]发现 , 尽管甲基紫精(methyl
viologen, MV)处理能够诱导水稻细胞自噬的激活 ,
但是表达分析却发现MV处理导致 ATG10基因在叶
片中的表达量下降。(3)尽管都是参与自噬过程的关
键因子, 但 ATG10与其他 ATG基因在植物免疫反应
中的作用可能有所不同。Lenz 等 [14]发现 , 拟南芥
atg5或 atg10突变体均对腐生真菌 A. brassicicola的
侵染诱导呈现坏死斑扩展现象, 但是在 atg5 突变体
上还同时观察到菌丝增强生长, 而在 atg10 突变体
上未观察到。(4)不同类型抗病基因介导的抗病反应
与细胞自噬的关系有所不同。Hofius 等[31]发现, 在
TIR-NB-LRR 类抗病基因(RPS4)介导的拟南芥抗 P.
syringae 反应中, 过敏性细胞死亡的执行依赖于正
常的细胞自噬活性 ; 而 CC-NB-LRR 类抗病基因
(RPS2)介导的过敏性细胞死亡却不依赖于细胞自噬
功能。Pm21 和 Pm3f介导的抗白粉病反应也都具有
过敏性细胞死亡的特征[32-33]。Pm21介导的包括过敏
性细胞死亡在内的抗病机制可能是自噬依赖性的 ,
而 Pm3f 介导的抗病反应与细胞自噬活性的关系可
能不大。
SA 信号通路参与了植物对活体寄生病原的免
疫反应; 而 JA/乙烯信号通路参与了植物对腐生病
原的免疫反应[34-35]。除广泛研究的 SA和 JA/乙烯信
号途径外, ABA 也是植物响应病原侵染的重要调控
因子[36]。大麦[37]和拟南芥[38]的抗白粉病反应均依赖
于 ABA 信号途径。SA 及其类似物能够激活拟南芥
细胞自噬[39]。细胞自噬调控植物免疫反应及病原侵
染诱导的细胞死亡也与激素信号途径密切相关[2]。
本研究中, 外源乙烯和 SA 处理能够在感白粉病材
料扬麦 158上激活 TaATG10基因的表达, 而在抗白
粉病近等基因系 92R137/扬麦 1587上抑制 TaATG10
基因的表达; ABA则具有与乙烯/SA相反的作用。因
此, 我们推测乙烯和 SA 信号通路与感白粉病反应
中 TaATG10 参与的自噬活性调控有关, 而 ABA 信
第 8期 张 微等: 小麦自噬相关基因 ATG10的克隆及白粉菌侵染诱导的 ATG10的表达 1401


号通路则与抗白粉病反应中 TaATG10 参与的自噬
活性调控有关。这 3 种植物激素在抗、感材料上对
TaATG10 表达的不同调控模式可能与抗、感表型密
切相关。Me-JA对抗、感材料的 TaATG10基因具有
相似的抑制作用 , 表明 JA 信号通路可能负调控
TaATG10 参与的细胞自噬活性, 而且与抗、感表型
无关。
4 结论
克隆了 3 个小麦 ATG10 基因 , 它们是酵母
ATG10的功能性同源基因。TaATG10a和 TaATG10b
基因的编码蛋白被定位于细胞质中。小麦对白粉菌
侵染的免疫反应涉及对 TaATG10及其参与的自噬过
程的调控, 调控模式因抗、感反应, 广谱或小种专化
抗病类型, 以及小麦遗传背景而异。植物外源激素
对 TaATG10表达的调控模式也在抗、感材料中有明
显差异, 可能是导致抗、感表型差异的原因之一。
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