全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(8): 15011505 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家科技支撑计划项目(2011BAD35B03)和西北农林科技大学基础科研业务费专项基金(ZD2012001)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 马翎健, E-mail: mlingjian@126.com, Tel: 13891836986
第一作者联系方式: E-mail: nmslmrm@gmail.com
Received(收稿日期): 2014-01-21; Accepted(接受日期): 2014-06-16; Published online(网络出版日期): 2014-06-21.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20140621.0845.004.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.01501
ATP合成相关基因在小麦 BNS不育系育性转换中的差异表达
王 震 范晓静 张 淼 张芳凝 李桂东 马翎健*
西北农林科技大学农学院, 陕西杨凌 712100
摘 要: 为了探讨 ATP合酶 α亚基和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(APRT)与温敏雄性不育系 BNS育性的联系, 利用荧光实
时定量 PCR方法, 在花药发育的 4个重要时期(四分体期、单核期、二核期和三核期), 定量检测 ATP合酶 α亚基和 APRT
相关基因在不育及可育条件下花药中的 mRNA 表达水平。不育条件下, ATP 合酶 α 亚基基因从四分体到二核期表达量
持续下降, 与可育株相比在单核期表达量显著下降; APRT1在 4个时期的表达量低于其在相应可育条件下的表达量, 而
APRT2 基因在 BNS 不育和可育条件下维持较低的表达水平。APRT 相关基因表达量在三核期均有较显著提高, 且可育
条件下比不育条件下提高更明显。因此认为, ATP合酶 α亚基基因与 BNS育性转换密切正相关, APRT基因在三核期转
录水平的变化与 BNS育性转换有一定关系。
关键词: 小麦; BNS雄性不育; ATP合酶 α亚基; 腺嘌呤磷酸核糖基转移酶; 荧光实时定量 PCR
Differential Expression of ATP Synthesis Related Gene in Fertility Conversion
of Wheat BNS Male Sterile Line
WANG Zhen, FAN Xiao-Jing, ZHANG Miao, ZHANG Fang-Ning, LI Gui-Dong, and MA Ling-Jian*
College of Agronomy, Northwest A&F University, Yangling 712100, China
Abstract: BNS male sterile line is a temperature-sensitive type in wheat. This study aimed at disclosing the role of ATPase α
submit and the adenine phosphoribosyl transferase (APRT) in BNS male sterility. At four key stages of pollen development, the
differential expressions of ATPase α submit gene and APRT were analyzed using fluorescence real-time quantitative PCR
(qRT-PCR) technique. Under sterile condition, the relative expression of ATPase α submit gene decreased constantly from tetrad
phase to binucleated stage. Particularly, the expression of ATPase α submit gene in uninucleated period was significantly lower in
sterile plant than in fertile plant. At four stages, APRT1 had lower expressions under sterile condition than under fertile condition,
whereas, APRT2 maintained low expression level in fertility conversion. The transcription levels of APRT genes increased sig-
nificantly in trinucleate period, and the variation was more obvious in fertile plants than in sterile plants. Therefore, ATPase α
submit is positively related to fertility conversion in BNS sterile line and APRT genes probably play a role in trinucleate period.
Keywords: Wheat; BNS male sterility; ATPase α submit; Adenine phosphoribosyl transferase; qRT-PCR
高等植物雄性不育性在农作物杂种优势利用上具有
广阔的应用前景 , 其中光温敏雄性不育两系法已成为小
麦杂种优势利用的重要途径之一。近年来我国发现的 ES、
C49S、BS、YS 和最新发现的 BNS 等优良光温敏雄性不
育系中有些组合已应用到生产 , 加强对温光敏雄性不育
系的研究, 对小麦杂种优势的利用具有重要的意义。BNS
不育系是由一个对温度敏感的自然突变体 BNY-S 改良而
成的新型生态不育系[1-2], 在我国湖南、河北、陕西以及
黄淮麦区表现不育性好、遗传稳定、育性转换容易等特点,
且该不育系抗低温能力强, 早熟, 丰产性好, 应用潜力很
大[3-5]。
光温敏雄性不育是一种遗传上比较特殊的不育类型,
其不育基因的表达依赖于一定的光照或(和)温度条件, 同
一基因型种子通过播期调节, 可发育成不育和可育 2种类
型, 使其成为研究育性相关基因的理想材料。Xing 等[1]
通过克隆 BNY-S 温敏雄性不育系的 cDNA, 得到与其育
性相关的 TaAPT2 基因。Guo 等[6]利用 BSA 法和 SSR 标
记技术分析不育系 337S/华麦 8构建的 F2群体, 获得 2个
主效基因 wptms1/5B和 wptms2/2B 璘。周琳 等[7]研究认为,
YS 型雄性不育系 A3017 是由 MADS-box 转录因子控制,
1502 作 物 学 报 第 40卷
表达量高时表现不育, 表达量低时表现可育。对小麦雄性
不育系育性相关基因的研究 , 不仅会对其杂种优势利用
产生促进作用 , 而且还对揭示植物发育和生殖调控机制
具有重要意义。
三磷酸腺苷(ATP)是能量储存、运输和供应的主要载
体。ATP合酶是 ATP合成的重要组织者, 是高等植物体内
最大的酶系之一。腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(APRT)是 ATP
嘌呤补救途径中催化底物腺嘌呤碱基和磷酸核糖焦磷酸
(PRPP)转化为一磷酸腺苷酸(AMP)的关键酶。研究发现,
植物雄性不育与能量代谢失衡有一定相关。姚雅琴等[8]利用
电镜细胞化学标记技术分析 K 型小麦雄性不育系和其保
持系花药组织中的 ATP 酶活性, 发现不育系在二核期花
粉粒质膜上的 ATP酶活性增加不明显。韩艳芬等[9]采用克
隆测序与 PCR 产物直接测序方法, 发现黏类小麦细胞质
雄性不育与线粒体 atp6 基因转录本保守区的编辑有一定
的相关性。Xing 等 [1]通过分析温敏不育小麦 BNY-S 中
APRT的变化, 发现 BNY-S育性转换与 APRT基因相关。
李友勇等[10]研究发现, ATP合酶 α和 β亚基相关蛋白质在
BNS中表达异常, 并推测其可能是 BNS不育的源头蛋白,
为了进一步验证和探讨这种联系, 本研究以 ATP 合酶 α
亚基与 ATP 嘌呤补救合成途径中的腺嘌呤磷酸核糖基转
移酶 (APRT)相关基因为目的基因 , 利用荧光实时定量
PCR 技术, 检测该基因在 BNS 不育和可育条件下花粉发
育的关键时期 mRNA 表达特性, 在基因表达水平上探讨
ATP合成与小麦雄性不育发生的关系。
1 材料与方法
1.1 材料种植及取材方法
2012 年秋将 BNS 不育系(由河南科技学院提供)播种于
西北农林科技大学北校区实验田, 根据 BNS 的育性转换规
律[2-5], 分 10月 1日和 11月 1日两期播种, 在花粉发育的四
分体至三核期, 分别取 BNS的花药样品用于基因表达分析。
10 月 1 日播种的 BNS 表现完全不育, 植株花粉败育率在
99%以上, 自交结实率为 0; 11月 1日播种的 BNS表现可育,
可育花粉达 50%以上, 套袋自交结实率达 30%~70%。
于取样日 8:00 左右, 根据植株外部形态选取花粉处
于不同发育时期的幼穗[11], 3次重复。材料经镜检确认小
孢子发育时期准确一致后, 采用 I2-KI 染色法判断所取花
药的花粉活力。在 15℃以下环境, 于冰块上剥取样穗中上
部小穗第 1和第 2小花的 6枚花药, 液氮冷冻 1 min, –80℃
冰箱保存备用。
1.2 总 RNA的提取与反转录
利用 MiniBEST Universal RNA Extraction Kit试剂盒
(TaKaRa)提取总 RNA, 在 1.5%琼脂糖凝胶上电泳检测其
完整性 , 同时用紫外分光光度仪测定吸光值 , 分析其纯
度。采用 PrimeScript RT reagent Kit (TaKaRa)反转录试剂
盒, 按操作说明利用随机引物反转录合成 cDNA链, –40℃
保存备用。
1.3 荧光定量 RT-PCR分析
根据 NCBI 数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)所公
布的 ATP合酶 α亚基(AT2G07698)序列信息设计特异引物
(表 1), 按张建奎等 [12]报道的引物序列 , 扩增 APRT1
(U22442)和 APRT2 (AY255503)基因, 以 β-Actin为内参基
因。所有引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成。
扩增体系 25 μL, 包括正、反向特异引物各 1 μL,
cDNA模板 2.5 μL, SYBR Premix ExTaq II (Tli RNaseH
Plus) (2×) 12.5 μL。扩增程序为 95℃预变性 30 s; 95℃变
性 5 s, 退火 30 s, 40个循环。反应结束后升温至 95 , ℃ 然
后按 0.5 s℃ –1缓慢降温至 55 , ℃ 持续读取荧光信号获得
熔解曲线。
以可育条件下四分体时期为对照 , 设其基因表达量
为 1, 采用 2–∆∆Ct方法[13]计算不育条件下各时期的相对表
达量。用 SPSS16.0 软件作数据 one-way ANOVA, 用
Duncan’s法作显著性比较。
2 结果与分析
2.1 荧光定量体系的建立和特异性测试
以小麦 β-Actin 为内参基因校正 cDNA 的拷贝数, 由
熔解曲线(图 1)可知 β-Actin熔解温度为 85.5 , ATP℃ 合酶
α 亚基基因、APRT1 和 APRT2 的熔解温度分别为 79.5、
86.0 和 73.0 , ℃ 并根据熔解确定最佳退火温度(表 1); 然
后对引物与模板的比例、荧光信号读取时间作出优化, 以
减少杂峰的出现, 提高 PCR 产物的纯度。调整后使 3 个
重复间的 Ct值差异控制在 1以内, 4个基因的熔解曲线均
为单一峰, 说明引物特异性良好, 干扰成分少。
2.2 在 BNS 育性转换过程中 ATP 合成相关基因的荧光
定量分析
2.2.1 ATP 合酶 α 亚基基因的表达差异 在不育条件
表 1 本研究设计的特异引物序列及其退火温度(Tm)
Table 1 Sequences and annealing temperature (Tm) of specific primers designed in this study
引物 Primer Tm (℃) 序列 Sequence (5′–3′)
ATPase α subunit 53.0 F: CGATGTTGGTGAGGCAAGT; R: AAGGGCACGGGATGTGTA
APRT1 53.5 F: CCGGAGGCGTGCGGCTTC; R: CAGTACAGACTATCATCCTTCATTGACATG
APRT2 53.0 F: AAGCAACATTAACTCACTTGTTGAG; R: CGAGACAATGGAATAAACTAATGTTG
β-Actin 58.0 F: CTCCCTCACAACAACCGC; R: TACCAGGAACTTCCATACCAAC
第 8期 王 震等: ATP合成相关基因在小麦 BNS不育系育性转换中的差异表达 1503
图 1 β-Actin、ATP合酶 α亚基基因、APRT1和 APRT2的熔解曲线
Fig. 1 Melting curves of β-Actin, ATPase α subunit gene, APRT1, and APRT2
下 ATP合酶 α亚基基因 mRNA表达量在前 3个发育时期
持续下降, 四分体至单核期缓慢下降, 二核期显著下降,
四分体时期为 4 个时期表达量的最高时段(图 2-A)。在对
照可育条件下, 单核期表达量高于四分体和二核期, 二核
期和三核期分别为 4个时期表达量的最低和最高阶段。
ATP合酶 α亚基基因 mRNA 在 BNS不育条件下 4个时期
的表达量均低于相应可育条件下的表达量 , 由此推断
ATP 合酶 α 亚基基因的下调表达与 BNS 花粉败育有关。
BNS 不育条件和可育条件下的 ATP 合酶 α 亚基基因表达
量在单核期出现显著差异 , 而在四分体时期和二核期差
异不显著, 说明单核期是 BNS 育性转换的关键时期。在
三核期ATP合酶 α亚基基因表达量同样出现显著差异, 可
育株的基因表达量比不育株高大约 4倍, 此结果证明花药
发育后期 ATP 含量与育性密切相关。
2.2.2 APRT1 和 APRT2 的表达差异 在不育条件下
APRT1 mRNA表达量 4个时期呈现波动的趋势, 2次波峰
出现在单核、三核期, 单核期表达量最高, 二核期表达量
最低, 且四分体、单核和三核期差异不显著(图 2-B)。对
照可育条件下 APRT1表达量在前 3个发育时期持续下降,
三核期表达量有显著提升, 说明三核期 APRT1 基因表达
量与 BNS 育性密切相关。仅可育条件下的单核期与不育
条件下四分体、单核、三核期表达量差异不显著 , 且
APRT1基因在 BNS可育条件下 4个时期的表达量高于相
应不育条件下。
APRT2 基因在 BNS 不育条件和可育条件下总体维持
较低的表达水平, 不育条件下四分体、单核和二核期表达
差异不显著, 四分体时期表达量最低, 三核期表达量最高,
二核与三核期表达差异显著; 三核期比二核期表达量提
升 2.23倍。可育条件下单核期相对表达量达到最低值, 单
核、二核期表达差异不显著, 仅在三核期存在较显著的表
达上调, 提升 2.26 倍(图 2-C)。可育条件下的单核、二核
期同不育条件下的四分体、单核、二核期 APRT2 基因相
对表达量差异不显著。与 APRT1基因相比, APRT2基因在
BNS 四分体、单核、三核期表达量都弱于 APRT1 基因。
比对 APRT1 和 APRT2 基因表达趋势后可知, 除对照时期
外, 仅在三核期 2 个基因的表达量出现显著差异, 且可育
比不育条件下提升更明显。
3 讨论
植物体旺盛的能量代谢是正常生命活动的保证, ATP
是细胞内各种物质合成的直接能源。多种作物的花粉败育
研究表明, 花药中 ATP 含量与育性密切相关, 可育株的
ATP含量比不育株高数倍, 而且影响 ATP分解反应和转换
速率的 ATP酶活性也以可育株比不育株强[8]。宋国琦等[14]
在小麦 YS雄性不育 A3017中分离出 ATP合酶 α亚基基因,
另外, 对水稻红莲型和小麦黏性雄性不育的研究发现, ATP
相关基因不同编辑方式导致雄性不育[9,15]。这些研究证据
表明, ATP合酶基因变异或表达异常与不育相关。ATP合酶
1504 作 物 学 报 第 40卷
图 2 ATP合酶 α亚基基因(A)、APRT1 (B)和 APRT2 (C)在花粉发育过程的相对表达量
Fig. 2 Relative expressions of ATPase α subunit gene (A), APRT1 (B), and APRT2 (C) during pollen development
I: 四分体期; II: 单核期; III: 二核期; IV: 三核期。以可育条件下四分体期为对照。
柱上不同字母表示不育和可育条件下不同时期间差异显著(P < 0.05)。
I: tetrad phase; II: uninucleated period; III: binucleated period; IV: trinucleate period. The expression level at tertad phase under fertile
condition was used as control. Different letters above columns indicate significant difference of expression level among different stages
under sterile and fertile conditions (P < 0.05).
α 亚基是 ATP 合成酶 F1F0 结构的重要组成部分, 本试验
中 , 与 BNS 可育条件下表达结果比较 , 不育条件下的
ATP合酶 α亚基基因在前 3个时期表达持续下降, 单核期
相对表达量有显著差异, 说明ATP合酶 α亚基基因表达量
与 BNS 育性转换密切正相关, 尤其在单核期这种关系更
为明显, 这与苏晴[16]的观察结果一致。在三核期 ATP 合
酶 α亚基可育株的基因表达量比不育株升高大约 4倍, 说
明花药发育后期 ATP 含量与花粉育性紧密相关。
在生物体内, ATP的合成主要依赖于 2条途径, 即从
头合成途径和嘌呤补救途径。其中嘌呤补救途径有 2个基
本路线, 即腺嘌呤直接转化为一磷酸腺苷酸(一步法); 腺
嘌呤先转化为腺苷酸, 再进行磷酸化。腺嘌呤磷酸核糖基
转移酶(APRT)是一步法中催化底物腺嘌呤碱基和磷酸核
糖焦磷酸(PRPP)转化为一磷酸腺苷酸(AMP)的关键酶。
Xing 等[1]研究表明, 温敏核不育小麦 BNY-S 育性转换初
期的幼穗中 APRT2 基因转录产物的丰度较不育处理前显
著降低, 其他器官则没有明显变化, 且 BNY-S 的 APRT2
基因 SNP位点中一个碱基 A换成 C, 导致 APRT酶二级结
构在螺旋、延伸链和环的位置和数量上许多变化, 可能影
响 APRT 酶对腺嘌呤和 PRPP的结合效率。本研究结果显
示, 温敏核不育小麦 BNS 在不育条件下, 四分体期至三
核期的 APRT1 基因的转录水平比可育条件下低, 表明其
育性转换与幼穗中 APRT1 基因转录水平有一定关系。在
植物体中, APRT 基因以多基因家族的形式存在。Southern
分析表明, 在大麦基因组中至少有 2 个基因编码 APRT [17],
在小麦中也已报道了 2条基因编码 APRT [1]。拟南芥中的
APRT2 基因比 APRT1 具有更高的细胞分裂素亲和力, 但
是在植物中表达强度弱于 APRT1 [12], 后者结论与本试验
结果相同, 但这种现象出现的原因还需进一步研究。
在 BNS 不育和可育条件下 APRT 基因相对表达量水
平较 ATP合酶 α亚基基因低, 但在三核期 APRT基因相对
表达量均有较显著提高 , 且可育条件下比不育条件下提
升更明显, 即使是 4个时期都维持较低表达水平的 APRT2
基因, 在三核期表达量也分别提升了 2.23 倍和 2.26 倍。
原因可能是 ATP 合酶亚基操纵子上游有温度感应子, 在
BNS 中, 该温度感应子是隐性突变, 突变后对转录活化
温度感应的阈值提高了, 因此在较低的温度下, 感应子不
活化, 操纵子控制下的 ATP 合酶亚基基因表达量减少或
不表达[10], 导致 ATP 从头合成途径无法进行。此时 ATP
合成的嘌呤补救途径将部分替代从头合成途径 , 以保证
花粉育性相关物质的顺利合成, 从而表现出 APRT基因的
表达上调。与从头合成途径相比, APRT 能更节能有效地
直接利用细胞中的代谢产物腺嘌呤合成 AMP, 进一步转
化为 ATP, 因此, 鉴于 APRT在维持细胞内 ATP平衡中的
作用, APRT 基因的表达水平也极可能通过能量代谢途径
的变化而与植物雄性不育相关, 即 BNS 花粉中嘌呤补救
途径的强弱将决定其育性的转换程度。此种机制外在表现
为在完全不育条件下 , 不育系花药内还有少量小孢子具
有育性; 在完全可育条件下, 可育株的花粉也不能够全部
转为可育[18-19]。
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