全 文 ：武汉植物学研究 ,
甘蓝型油菜小抱子胚状体发生
的细胞学观察
‘
余凤群 傅爱汝“ 刘后利
华中农业大学农学系 武汉
提 要 应用甘蓝型油案 系保 为材料研究小抱子胚发生过程 , 结果表明 , 在小抱子
离体培养 内 , 随培养天数增加 , 小抱子的存活率迅速下降 。 部分小饱子培养后出现细
胞膨大和分裂 , 并沿 一细胞 、 “ 工 ”形 一细胞 、 多细胞原胚 、 胚柄球形胚 、心形胚最终发育成鱼
雷形胚 。一般在心形胚阶段 , 胚柄脱离胚主体部分游离到培养基中 。大多数膨大的细胞不能分
裂或分裂后停止发育或发育异常 。
关键词 甘蓝型油菜 , 小饱子培养 , 胚状体发生
游离小抱子培养是获得油菜单倍体的重要途径
。研究油菜小抱子培养技术及其应用 ,
国内外已有许多报道 〔‘’。 但就小抱子胚早期发生过程及游离小抱子培养后的细胞形态观
察却报道不多 。 通过研究甘蓝型油菜游离小抱子培养后的细胞形态变化及胚状体发生过
程 , 将为进一步提高油菜小抱子胚产量奠定细胞学基础 , 并将有助于丰富植物体细胞胚胎
学的内容 。
材料与方法
, 选材与种植
选用华中农业大学作物遗传育种研究所油菜研究室筛选和培育的易成胚甘蓝型油菜
记 加倍单倍体 系保 为供试材料 , 种植在华中农业大学试验 田 ,
按常规方法栽培管理 。
分离和培养小抱子
于油菜开花期摘取主花序或分枝花序上 长花蕾 , 每次试验取花蕾 个 。 经
酒精泡 , 升汞消毒 , 无菌水洗 次后 , 花蕾转移至 。 长试管
收稿 日 一 。 一 。 , 修回 日 一 。 一 。 第一作者 女 , 岁 副教授 博士 , 从事作物遗传育种方面研究 。
国家教委高等学校博士点基金资助项 目 。
” 现工作单位 福建省邵武市沿山农技站 邮政编码 。。
武 汉 植 物 学 研 究 第 卷
中 , 加入约 一 含 , 培 养基 的大量 、 微量 元 素 , 及铁盐 和 有机成份 , 附加
。 和 写蔗糖 , , ℃灭菌 的液体培养基 , 用平头玻棒磨碎
花蕾 , 再加 一 左右 , 经 目双层尼龙网过滤 , 滤液收集于 离心管中 ,
用 一 定容至 , 离心 。 此时小抱子沉于管底 , 弃去上清液 , 并
加 一 悬浮小抱子 , 再离心 。 如此共重复 次 。 然后悬浮小抱子于 一 含
培养基基本成分 , 含 蔗糖 , 不含激素 , , 拜 滤膜过滤灭菌 的液体
培养基中 , 分装在 培养皿中 , 每皿 培养液 , 封 口 。 先在 ℃
黑 暗条件下培养 , 后转移至 ℃黑 暗条件下培养 , 当肉眼可见胚时 , 摇床振荡培养
, ℃ , 黑暗 。
倒置显微镜观察及统计胚数
接种后每 或每隔 在 倒置显微镜下观察小抱子及胚状体的发育情况 ,
统计膨大及分裂细胞数并照相 。 接种后 , 按 次重复试验的结果统计胚数 , 计算胚产
量 。
荧光显微镜制样及观察
取 小抱子悬浮培养液于小指形管中 , 再加 滴 溶液 , 混匀 ,
室温下作用 后 , 制片置于 荧光显微镜下 , 统计具荧光反应的活细胞
占小抱子总数的百分 比 。
半薄切片制样
小抱子培养的悬浮液经离心沉淀 , 弃去培养基 , 用 戊二醛固定 , 置于 ℃冰箱中过
夜 。 次 日重离心 , 用 琼脂固化小抱子后加 戊二醛固定液 , 磷酸缓冲液清洗 , 饿酸
固定 , 磷酸缓冲液清洗 , 丙酮梯度脱水 , 常规 包埋 , 一 型超薄切片机切
片 , 切片厚度 拜 , 甲苯胺蓝染色 , 显微镜观察 、拍照
。
结果与分析
培养细胞的生活力
小抱子刚分离
及 培养后 不 同天数细胞
的活 力情 况 见 表 。 从
表 中可以看 出 , 刚分离
悬浮培养于 培养基
表 游离小抱子培养后不同天数细胞的生活力
项 目 培 养 天 数
。
细胞存活力
观察细胞数
中的小抱子 已有部分死亡 。 其原因可能是分离过程中研磨造成机械损失或不适宜的分离
和培养条件等因素造成的 。 但是大量小抱子死亡是在培养后 内发生的 , 并且随着
培养天数增加 , 尚具生活力的细胞越来越少 , 至培养后 周将近 的细胞 已死亡
。 至培
养后 周具活力的细胞只占 。 在培养后 时已肉眼可见鱼雷形胚状体 , 统计胚
状体产量为平均每花药产胚 个 , 按每花药 万个小抱子计 〔 〕, 形成鱼雷期胚状体
小抱子的比例约占 。
培养细胞的膨大与分裂
从 长的花蕾中分离的小泡子 , 直径大约为 “ , 呈圆形 。 培养 后
第 期 余凤群等 甘蓝型油菜小饱子胚状体发生的细胞学观察
观察 , 部分细胞出现明显膨大 。 后 , 膨大的细胞直径达 “ , 部分膨大的细胞开
始分裂 图版 。 而未明显膨大的细胞一般不发生分裂 。 这说明小抱子培养后细胞的膨
大是其分裂的先兆 。观察培养后 细胞的形态 表 表明 , 在培养后 中 , 其细
胞膨大和分裂的比例均是
随着培养天数的延长而增
加 , 其增 加 的速度至 培 养
后第 趋于缓慢或基
本保持不变 。 这一结果亦
说 明 , 多数细胞 的膨大开
始于小抱子培养后
内 , 而 细 胞 的第 次分 裂
是 发 生 在 培 养 后 一
中 。 如果超过上述期限还
没有 明 显 膨大 或分裂 , 细
胞 将 不 再 出 现 膨 大 和 分
项 目
表 培养细胞的膨大与分裂
培 养 天 数
蛇细乐公几膨大
细胞
分裂细胞 写
观察细胞数
分裂细胞类型 一细胞 一 细胞 一细胞
一细胞 一细胞 一细胞
多细胞团 多细胞团
裂 。此外 , 在同期观察的情况下 , 分裂的细胞数大大少于膨大的细胞数 , 这说明分裂仅发生
在少部分膨大的小抱子中 。 培养 后观察时 , 细胞往往只分裂 次 , 后部分细胞进行
了第 次分裂 , 第 后部分细胞 已进行多次分裂 , 但仍有一些细胞停留在 一细胞 、
一细胞阶段 , 出现 一细胞 、 一细胞与多细胞团并存的现象 。 然而 , 从培养细胞活力测定结果
来看 , 培养后 的小抱子存活力显著地低于细胞膨大和分裂的细胞频率 , 这说明部
分膨大和分裂的细胞可能发育受阻而失去生活力 。
小抱子胚的形成过程及细胞形态
具有胚状体发生能力的小抱子在合适的条件下培养后 , 首先发生细胞膨大 , 然后分裂
形成 一 细胞原胚 图版 , 。 该原胚的 个子细胞的细胞质均浓厚 , 但其细胞大小相
近或具明显差别 。 这可能是分裂形成 个大小相同的细胞之后 , 又继而发生类似于合子
一 细胞原胚中顶细胞与基细胞的分化 , 使 个子细胞显示出明显差异
。 随后 , 个子细胞
之一先发生垂直于子细胞壁方向的分裂 , 形成“ 工 ” 一细胞原胚 图版 , , 并继而发生
垂直及平行方向的分裂 , 形成多细胞团的胚状体主体部分 图版 , 。 一 细胞原胚中的
另一子细胞分裂较慢 , 一般发生平行方向分裂形成胚柄 图版 。 在小抱子培养 一
后 , 正常胚状体一般发育成近似于长形或圆球状且携带着胚柄 图版 , , 。胚的主体
部分显著大于胚柄部分 , 且细胞小而排列紧密 , 外层细胞质浓 , 内层开始出现薄壁细胞 图
版 。 这一时期类似于合子胚的球形胚阶段 。 随着胚状体的进一步生长 , 胚顶端子叶
原基分化而使胚状体呈心形 图版 , , 此时胚柄大多已脱落并游离到液体培养基中 。
随着子叶和胚轴细胞的继续分裂 , 胚体积不断增大而发育成鱼雷胚 图版 。
如前所述 , 在本试验中发育成鱼雷形胚状体的小抱子只占 , 即绝大多数小抱
子在通向胚状体形成的途中死亡或发育异常 。 主要表现为 ①未发生明显膨大的细胞在
培养 后细胞质开始收缩和瓦解 图版 , 培养 后细胞质几乎全部退化或剩
下残迹 , 小抱子呈“ 空壳 ”状 图版 。 ②在培养 后部分明显膨大细胞的细胞质
武 汉 植 物 学 研 究 第 卷
浓厚 , 并积累了大量脂肪和淀粉 , 具有胚性细胞的特征 〔 , , 但由于细胞恶性膨大 , 并胀破小
抱子壁且没有分裂 图版 。 这种细胞一般在培养 后开始解体 , 放出内含物 图
版 。 ③有的小抱子启动分裂后又停止分裂 , 或者异常分裂形成畸形多细胞团 图版
。 此外 , 我们曾观察到 , 在培养后 鱼雷状胚 已形成时 , 还能见到 一细胞原胚
、 一细胞
原胚 、 多细胞团及球形胚和心形胚并存 。 除较大的球形胚和心形胚外 , 其它细胞经
染色时一般没有荧光反应 , 这说明这些细胞可能是启动 至数次分裂后 , 由于种种原 因
又停止发育且死亡 。
根据表 中第 天细胞膨大与分裂的比例 , 及第 天对胚状体数 目的统计 , 推测在本试
验中 系保 游离小抱子经过培养后 , 小抱子朝各途径发育比例大致为 ①未明显膨
大死亡的小抱子占 , 其中包括分离过程中死亡的部分小抱子 ②发生膨大但未分
裂而死亡的小抱子占 ③启动分裂但发育停止或死亡以及发育异常形成畸形细胞
团或发育缓慢形成小胚的小抱子占 , 其中除部分小胚通过改善培养条件可进一步
发育外 , 其余各种细胞将最终走向死亡 ④发育成正常鱼雷形胚的小抱子占。 。
讨论
获得小抱子胚状体是甘蓝型油菜小抱子培养应用于遗传和育种实践的先决条件 。 从
本研究来看 , 只有极少数小抱子最终能发育成鱼雷形胚状体 。 为了提高小抱子胚产量 , 减
少小抱子在通向胚状体形成途径的死亡或发育异常的频率 , 应该改善分离小抱子的条件 ,
以减少分离过程造成小抱子的死亡 。通过改善培养条件和培养方法 , 以提高小抱子有效膨
大和分裂的比例 , 增加形成正常胚状体的可能性 。 本试验材料保 是我们通过多年试验
筛选出的易成胚材料 , 胚产量高达 个胚 花药 。 这一胚产量虽足以满足油菜遗传育
种等应用研究的需要 , 但相对于被游离的小抱子群体来讲 , 形成胚的小抱子仍占很低比例
。 因此 , 进一步提高小抱子胚的产量仍具巨大潜力 。 本研究通过对小抱子培养后
细胞形态的变化及胚状体形成关系的观察 , 使我们可在小抱子培养的早期预测供试材料
是否能形成胚或胚状体产量的高低 。 如果在小抱子培养后 一 内未见小抱子膨大 , 则
可能无胚状体发生 。 如果有小抱子膨大并见细胞分裂 , 则可能形成胚 。 分裂的频率愈高 ,
则胚状体产量越高
。
有关油菜小抱子胚的发生过程 , 等 ”曾认为是沿球形胚 、 心形胚和
鱼雷形胚的顺序而发育 , 但对胚的早期发育及胚柄的来源与去向等问题未作说明 。 一般认
为 , 追踪胚状体原始细胞发生是比较困难的 〔。 。 本研究因采用游离小抱子培养及以胚状体
发生频率高的品系为材料 , 通过倒置显微镜及切片观察表 明 , 一 细胞原胚分裂形成 一细胞
原胚为“ 工 ”型 , 这一方式与合子胚的早期分裂极为类似 。至于是否还存在其它方式的分裂
以及 一细胞原胚中 个子细胞的极性问题还 尚待进一步研究 。 在本研究中 , 球形胚可观
察明显的胚柄 , 到心形期一般脱落于培养基中 。而合子胚的胚柄通常在胚发育过程中逐渐
退化 , 成熟时可见残迹 〔 , 。
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第 期 余凤群等 甘蓝型油菜小抱子胚状体发生的细胞学观察
参 考 文 献
余凤群 芸苔属植物未成熟小抱子培养技术的研究和应用 中国油料 , ,
,
陀 , , ‘
余凤群 , 傅丽霞 , 刘后利等 油菜小抱子胚发生的超微结构和胚状体形态 西北植物学报 , ,
胡适宜 被子植物胚胎学 北京 北京人民教育出版社
傅文吾 甘蓝型油菜胚胎发生 华中农学院学报 ,
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