全 文 ：武汉植物学研究
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利用电激法转化小麦
幼胚的研究 ’
柯遐义 黄 粤 石和平 李宝健
∀中5/) 大学生物工程中心 广州 !
& # ! ∃
提 要 利用我们实验室 自制的脉冲放电式电激仪 : ;< = 一 ∋ , 我们将含 >., 基因即 ;? ≅ 酶
∀Α 2 ∗ 9 Α 25− ∗ 42 , 58 5− . 8 8 4Β /4, . − 9 Χ8 , . 9 8 ∃基因的 ΑΔ Ε 9& # 质粒 Δ Φ ? 导 入 了一个春小麦品种
∀≅ ,5 456 + Γ . 894 5∗ + Γ Η Ι ∃“≅ ϑ∗ ∗ ∋ ”的幼胚中 。 经过在含有 Α Α 4 ∀Α 2 ∗ 9 Α 25− ∗ 42 ,58 5− ∃的选择培养基
上筛选 , 得到 了抗 Α ;4 的愈伤组织和 再生小苗 。 ;Κ 7 检测与 Δ Φ ? 点杂交结果显示 , 外源 >.,
基因已整合进了转基因的小麦植株中 。
关键词 小麦 , 幼胚 , >., 基因 , 电激 , 转基因植株
小麦是我国 , 也是世界上最重要的农作物之一 。通过基因工程对其品种进行改良具有
十分重要的意义 。 但与其它一些农作物 , 如水稻和玉米等的遗传改良工作相比 , 人们在这
一领域取得的进展较为缓慢 。 其中一个重要的原因就在于人们直到最近几年才开始摸索
出一套比较有效的小麦基因转化系统〔’一” 。
到目前为止 , 人们正式报道获得的转基因小麦植株及其后代 , 均系通过成功运用基因
枪轰击这一转化技术‘’一 ’〕 。 Λ . 9 5/ 等〔‘〕以经过长期培养而得到的胚性愈伤组织为受体进行
转化 , 由于该方法的历时较长且受基因型限制而未能得到进一步发展和更广泛的应用 。
1 8 Μ 9 等〔# ,和 38 6Μ 8 , 等〔∋〕分别采用经过预培养的幼胚和幼胚的盾片组织为转化受体 , 从
而大大缩短了获取转基因植株所需的时间 , 并使其易于应用到一般栽培小麦品种的基因
转化工作中。
与基因枪轰击转化相似 , 电激法也可利用植物材料的组织细胞为受体进行组织 电激
转化 , 并获得了水稻〔‘, ! , 、玉米 〔‘ , ’〕等的转基因植株 。 ? −Ν ,8. 9 Ο
Π 45 等〔Θ〕曾利用电激法将外
源 Ρ +9 基因导入小麦幼胚组织细胞中 , 在被转化组织中检测到 了 Ρ +9 基因的瞬间表达 , 但
未能得到转基因的愈伤组织与植株 。在此 , 我们报道利用电激转化小麦幼胚获取转基因植
株的研究 。
收稿 日 %
  ! 一
#一
Π Ι 修回 日 %
  Π 一 & Σ 一 #  。 第一作者 % 男 , ∋ # 岁 , 讲师 ∀硕士 ∃ 。
奋 “八六三 ”高科技资助项 目。
武 汉 植 物 学 研 究 第
! 卷
材料与方法

Ι
植物材料与电激转化
春小麦品种 ∀ ’, 54 56 + Γ . 8 9 ,5Τ + Γ Η Ι ∃“≅ # & & ∋ ”播种于大 田 , 待受粉
# (
! Ν 后 , 将其
穗子剪下并放在 & Υ 乙醇中浸泡约
Γ 5− , 无菌水洗 ∋ ( Σ 次 , 然后剥出幼胚 。 将幼胚转至
& Ι
Υ : Ρ Κ
# 中
! Γ 5− 后 , 再用无菌水洗 Σ 一 ! 次 , 最后放入 : ;< = 一∋ 电激仪 〔!〕的电激小
室中进行 电激 。 每个小室 装有
& & 拌Η 的 : 8 Α 8 9 电激缓 冲液〔〕∀内含 Α Δ Ε ∋ ∗ ϑ 质粒 〔‘。,
Δ Φ ? #& 拼Ρ ς Γ Η 、小牛胸腺 Δ Φ ? !& 拼Ρ ς Γ Η ∃和约 #& 个幼胚 。 电激仪的电激参数如下 % 脉冲
数 Φ; 一 # , , 脉冲强度 了衬一 Π# 娜 , 电压 Λ; 一
& ∗ ∗ & Λ , 循环数 Φ6 一
! , 循环间隔时间≅ % (

! , 放电针尖至液面距离 2 一 ∋ 一 ! Γ Γ , 长脉冲输出方式 。

Ι # 转化材料的选择培养与再生
将电激 转 化 的 幼 胚 放 在 无 Α ;4 的愈伤组织 诱 导培 养基 上 ∀Ε = 基 本 成 分 附 加
! & & Γ Ρ ς Η 水解 酪 蛋 白 、 # & & Γ Ρ ς Η 谷 氨 酞胺 、
! & Γ Ρ ς Η 天 门冬 氨酸 、 # Γ Ρ ς Η ϑ , Σ 一Δ 、
& Ι ∋ Γ Ρ ςΗ Ο ≅ ∃培 养 ∋ Ν , 然后转入 含有 Α;4 的上述培 养基 ∀Α;4 浓度分别 为
、 ∋ 、 ! 、 Θ 、
Θ Γ Ρ ς Η ∃中进行选择与继代培养 , 继代时间
& (
Σ Ν 、 #! ( #Θ ‘Κ于黑暗中 。 经选择培养而
存 活下 来 的愈 伤 组 织被 转至 再 生培 养基 ∀Ε = 培 养基 成分 附加 Ο ≅
Γ Ρ ς Η 、 Φ ? ?
& Ι Σ Γ Ρ ς Η ∃中 , 于
Π & & ΩΞ 光强下培养 , 每天光照
Π 2 。 当再生的小植株 /一 # 8 Γ 高时 , 再
转至 Φ 。 培养基进行生根壮苗培养 。

Ι ∋ 转基因植株的分子检测 ’
将选择培养后再生的小麦植株叶片和作为对照组正常生长的小麦植株叶片剪下各约
! & & Γ Ρ , 液氮冷冻后充分磨碎 , 用 Κ ≅ ? 3 法〔, ”提取总 Δ Φ ? , 然后进行 ;Κ 7 分子检测和
Δ Φ ? 点杂交〔’#〕。
根据 >., 基因序列设计的两引物长皆为 #& > Α ,两引物间 Δ Φ ? 片段长度为 Σ∋ >Α 。 引
物序列分别为 , ! ’一? Κ Κ ? ≅ Κ Ψ ≅ Κ? ? Κ Κ ? Κ ≅ ? Κ? ≅ 一∋ ’和 ! ’一? Ψ ≅ Κ Κ ? Ψ Κ≅ Ψ Κ Κ ? Ψ ? ? Ζ
? ΚΚ Κ 一 ∋ ’ 。
Δ Φ ? 点杂交所用探针制备 % 用 = Γ . / 酶切消化适量 Α Δ Ε ∋ &# 质粒 Δ Φ ? , 用低融点
琼脂糖法〔‘, , 回收长度约 & Ι Π Μ > 的 >., 基因片段 , 再用随机引物试剂盒和 ∋ , ; 一Ν Κ ≅ ; 进行
标记之 。
植株总 Δ Φ ? 不经酶切 , 直接点样于尼龙膜上 , 然后与 >., 基因探针杂交 。具体方法参
照 =. Γ > , ∗ ∗ Μ 等 〔‘# , 。
# 结果与讨论
#Ι
转基因植株的获得
经过 Σ & 一 !& Ν 的选择培养后 , 从
ΣΘ 个电激转化的幼胚中 , 约有 !& Υ产生了愈伤组
织 , 其中除有 ∋ 块属胚性愈伤组织外 , 其余都属于非胚性愈伤组织 。 胚性愈伤组织一开始
就生长缓慢 , 经 Σ& 一 !& Ν 选择后 , 长至直径为 # ( ∋ Γ Γ 大小的愈伤组织 , 转至再生培养
基后均形成绿点 , 但只有其中一块分化出了小苗 ∀见图
∃ 。 而上述非胚性愈伤组织则从一
开始就生长较快 ∀可长至直径达 !一 Γ Γ ∃ , 直到选择培养基中 Α ;4 浓度达到 ! 拌Ρ ς Γ Η 和


第 # 期 柯遐 义等 % 利用电激法转化小麦幼胚的研究
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柯遐义  张秀文 , 石和平等  以玉米幼胚 为受体的外源基因转化研究  广东农业科学 , # >>∃ , ? ≅ #∀ Α #Χ
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