全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2016, 42(7): 10941099 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由山东省自然科学基金项目(ZR2013CM036)和山东省良种工程项目(2014-2017)资助。
This study was supported by Natural Science Foundation of Shandong (ZR2013CM036) and Shandong Province Germplasm Innovation and
Utilization Project (2014–2017).
 通讯作者(Corresponding authors): 万书波, E-mail: wansb@saas.ac.cn, Tel: 0531-83178335; 彭振英, E-mail: pengzhenying2005@126.com
第一作者联系方式: E-mail: zhengling0000@sina.com, Tel: 0531-83178083
Received(收稿日期): 2016-01-11; Accepted(接受日期): 2016-05-09; Published online(网络出版日期): 2016-05-11.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160511.1551.006.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2016.01094
花生 AhDGAT2a基因启动子的克隆和功能验证
郑 玲 1,2 史灵敏 1,3 田海莹 1,2 单 雷 1,2 边 斐 1 郭 峰 1
宣 宁 1 万书波 1,2,* 彭振英 1,2,3,*
1山东省农业科学院生物技术研究中心 / 山东省作物遗传改良与生态生理重点实验室, 山东济南 250100; 2山东大学生命科学学院,
山东济南 250100; 3新疆农业大学农学院, 新疆乌鲁木齐 830000
摘 要: 二酰甘油酰基转移酶(DGAT)是三酰甘油(TAG)合成途径的限速酶, 对脂肪酸合成的调节具有关键作用。为了研
究 AhDGAT2a的表达调控, 利用 GenomeWalking方法从鲁花 14基因组中克隆了 AhDGAT2a上游 5侧翼调控区 1200 bp
序列 , 即 AhDGAT2a 启动子 (pAhDGAT2a)序列 , 并利用生物信息学软件分析其包含的调控元件 , 发现其含有多个
TATA-box 和 CAAT-box、光调控元件、胁迫防御相关元件和激素响应元件。用 pAhDGAT2a 构建 pAhDGAT2a:GUS 植
物表达载体并转化烟草品种 SR1。利用组织染色法鉴定转基因烟草的 GUS 表达模式, 发现在转基因烟草的各个器官均
有 GUS酶活, 在柱头、花药和幼嫩种子中表达量较高, 说明 pAhDGAT2a具有一定的组成型启动子活性。
关键词: 花生; AhDGAT2a基因; 启动子; 功能验证
Cloning and Functional Analysis of Peanut AhDGAT2a Promoter
ZHENG Ling1,2, SHI Ling-Min1,3, TIAN Hai-Ying1,2, SHAN Lei1,2, BIAN Fei1, GUO Feng1, XUAN Ning1,
WAN Shuo-Bo1,2,*, and PENG Zhen-Ying1,2,3,*
1 Biotechnology Research Center, Shandong Academy of Agricultural Sciences / Shandong Provincial Key Laboratory of Crop Genetic Improvement,
Ecology and Physiology, Jinan 250100, China; 2 College of Life Science, Shandong University, Jinan 250100, China; 3 College of Agronomy, Xinjiang
Agricultural University, Urumqi 830000, China
Abstract: Diacylglycerol acyltransferase (DGAT) is a rate-limiting enzyme in triacylglycerol (TAG) biosynthesis pathway. In this
study, GenomeWalking method was used for cloning the promoter sequence of AhDGAT2a gene from Luhua 14, and finally a
1200 bp fragment flanking 5′-upstream of AhDGAT2a was obtained and named as pAhDGAT2a. The crucial regulatory elements
in pAhDGAT2a were further analyzed with software PlantCARE. There were many TATA-box, CAAT-box, light regulation, stress
and defense response and hormone response elements. To assess the activity of pAhDGAT2a, we constructed pAhDGAT2a:GUS
cassettes and introduced it into the tobacco SR1 genome by Agrobacterium-mediated transformation. Expression pattern was
monitored by histochemical staining. Results showed that GUS activity driven by the pAhDGAT2a was detected in almost all
vegetative and reproductive tissues, with a higher expression level in stigma, anther and young seeds than in the other organs,
indicating that pAhDGAT2a has a constitutive promoter activity.
Keywords: Arachis hypogaea L.; AhDGAT2a gene; Promoter; Function analysis
植物油是食用油的主要来源 , 约占全世界脂类消耗
的 75%[1]。植物油是由脂肪酸和甘油化合而成的天然化合
物。脂肪酸, 是指一端含有一个羧基的长的脂肪族碳氢链,
是机体主要能量来源之一。植物油的不饱和脂肪酸含量比
较高, 作为食用油, 可以降低人体血液中胆固醇的含量,
降低动脉硬化发生的几率 [2]。三酰甘油 (triacylgycerol,
TAG)是大多数植物和动物体内最重要的油脂贮藏形式 ,
具有重要的社会经济价值。酰基辅酶 A:二酰甘油酰基转
移酶(acyl-CoA diacylgycerol acyltransferase, DGAT)是一
种内质网细胞微粒体酶 , 其主要作用是催化二酰甘油
(diacylglycerol, DAG)加上酰基脂肪酸形成 TAG [3]。该基
因不仅与脂肪酸合成相关 , 在种子萌发和叶片衰老等过
第 7期 郑 玲等: 花生 AhDGAT2a基因启动子的克隆和功能验证 1095


程中也有一定的作用[4-7]。
1956年DGAT基因首次被发现[8], 并很快引起研究人
员的广泛关注。根据结构和细胞定位的差异, DGAT被分
为 DGAT1、DGAT2、WS/DGAT和胞质 DGAT四种类型[9-10]。
DGAT1 属于包括酰基辅酶 A 胆固醇酰基转移酶 ACAT1
和 ACAT2 在内的膜结合酰基转移酶 (membrane-bound
O-acyltransferases, NBOAT)家族的一部分[11]。DGAT2 是
一个蛋白超级家族, 在动物[12]、植物[13]和酵母[14]中都存
在 , 但是与 DGAT1 蛋白家族没有明显的相关性。
WS/DGAT和胞质 DGAT是近几年发现的 DGAT基因家族
的新成员, 目前相关研究较少。胞质 DGAT (Cyto DGAT)
是从花生未成熟种子中获得的一类新型二酰甘油酰基转
移酶基因 [9], 该基因没有跨膜结构 , 与 WS/DGAT 具有
13%的一致性, 与 DGAT1和 DGAT2家族具有不到 10%的
相似性。DGAT1和 DGAT2大多被定位于内质网[15-16], 而
胞质 DGAT是一种定位于细胞质中的可溶性蛋白[9]。
DGAT1 和 DGAT2 对于种子油脂合成非常重要[17-18],
是 Kennedy 途径中唯一的限速酶。在拟南芥中过量表达
DGAT1 基因可使种子含油量显著提高, 而且可使转基因
拟南芥种子内的 DGAT活性比野生型提高 10%~70% [19]。
在玉米中过量表达 DGAT1 不仅可使转基因玉米种子含油
量提高, 而且改变了油脂组成[20]。DGAT2 在大豆等转基
因油料作物中过量表达均能提高种子的含油量[21-22]。
DGAT基因一直是油料作物的研究热点。花生在我国
的种植面积已超过 460万公顷, 总产量居世界首位[23]。花
生籽仁粗脂肪含量 50%左右, 仅次于芝麻[24]。由于 DGAT
在植物种子发育过程中影响种子油分含量、脂肪酸组成等,
对于油料作物花生 DGAT的研究具有重要经济意义。目前
花生的 DGAT 基因也有一些研究成果 [9, 25-27], 但是对
DGAT基因启动子的研究却很少。
我们前期从花生中克隆得到了 AhDGAT2a基因
(GenBank登录号为JF897614), 该基因编码区为1005 bp,
将该基因在烟草中过表达 , 发现其能改变转基因烟草叶
片的总脂肪酸含量和组成[25]。将AhDGAT2a基因在大肠杆
菌Rosetta (DE3)表达 , 能使大肠杆菌的体积增大2.4~2.5
倍, 同时提高大肠杆菌的总脂肪酸含量[26]。为进一步研究
AhDGAT2a基因的表达模式和基因组信息 , 我们通过
GenomeWalking方法从花生中克隆了AhDGAT2a基因的启
动子序列(pAhDGAT2a), 并通过农杆菌介导的遗传转化
法转化烟草进行功能验证。这为我们研究植物DGAT2的
功能和油料作物TAG的合成及调控提供了依据 , 为我们
培育油料作物新品种奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料及菌液
花生品种鲁花 14 由实验室保存, 室内培育后取幼叶,
液氮速冻保存在–80℃。烟草品种 SR1由实验室保存。大
肠杆菌(Escherichia coil) DH5α, 根癌农杆菌(Agrobacterium
tumefaciens)菌株 LBA4404, 表达载体 pCAMBIA2301 均
由本实验室保存。
1.2 生化试剂及试剂盒
材料基因组 DNA提取试剂盒、凝胶回收试剂盒和质
粒 DNA 提取试剂盒为 TIANGEN 公司产品。Genome
Walking试剂盒购自 TaKaRa。T4 DNA连接酶及限制性内
切酶购自 Fermentas。其他化学试剂为国药产品。引物合
成和测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
1.3 pAhDGAT2a克隆与序列测定
pAhDGAT2a的克隆按照 GenomeWalking试剂盒进行
3 轮扩增。用到的引物 SP1: 5-GGAGAGAGGTAGAA
AGAGAAG-3, SP2: 5-CGCAAGCGCCAGCGTCGTTTT
GAAGC-3, SP3: 5-CCGCCGGCGGCGCCACCGTGACG
TT-3从上海生工合成。反应体系含基因组 DNA 1 µg、2.5
mmol L–1 dNTPs混合物 8 µL、10×LA PCR buffer II 5 µL、
5 U TaKaRa LA Taq 0.5 µL、100 µmol L–1 AP1 Primer 1
µL、10 µmol L–1 SP1 Primer 1 µL, ddH2O加到总体积 50
µL。反应条件为 94℃ 1 min, 98℃ 1 min, 5个循环的 94
℃ 30 s, 65℃ 1 min, 72℃ 2 min, 然后 94℃ 30 s; 25℃ 3
min; 72℃ 2 min, 15个循环的 94℃ 30 s; 65℃ 1 min; 72
℃ 2 min; 94℃ 30 s; 65℃ 1 min; 72℃ 2 min; 94℃ 30 s;
44℃ 1 min; 72℃ 2 min, 最后 72℃延伸 10 min。第 1轮
产物稀释 100倍后取 1 µL作为第 2轮模板, 以AP1 Primer
为上游引物, SP2 为下游引物, 其余同第 1 轮扩增体系。
反应条件为 15个循环的 94℃ 30 s; 65℃ 1 min; 72℃ 2
min; 94℃ 30 s; 65℃ 1 min; 72℃ 2 min; 94℃ 30 s; 44℃
1 min; 72℃ 2 min, 最后 72℃延伸 10 min。第 2轮产物稀
释 100倍后取 1 µL作为第 3轮模板, 以 AP1 Primer为上
游引物, SP3 为下游引物其余同第 1 轮扩增体系, 反应条
件同第 2 轮。第 2 轮和第 3 轮 PCR 产物经琼脂糖凝胶电
泳检测, 回收纯化目的条带, 连接到 pMD18-T载体测序。
测序完成后用 PlantCARE软件分析其调控元件。
1.4 pAhDGAT2a:GUS植物表达载体构建
将得到的 pAhDGAT2a序列用引物 PD2F/PD2R扩增,
引物序列为 PD2F: 5-TCTAGAACGACTGCCACATTATA
CATTCTAGC-3, PD2R: 5-CCATGGTTTGGATTCGGTGG
CTGTTG-3, 引物两侧分别添加 Xba I和 Nco I酶切位点。
提取花生幼叶的基因组 DNA, 用基因组 DNA为模板进行
PCR 扩增, 得到的序列进行双酶切, 利用 T4 连接酶连接
到 pCAMBIA2301 载体, 替换 pCAMBIA2301 载体上的
CaMV35S启动子。连接体系为 PCR片段 6 µL, 载体 DNA
2 µL, 10×T4连接酶 1 µL, T4 DNA连接酶 1 µL。上述体系
于 16℃过夜连接, 连接体系转化大肠杆菌 DH5α 感受态,
测序确定 pAhDGAT2a:GUS表达载体构建成功。将构建好的
pAhDGAT2a:GUS 表达载体转化农杆菌 LBA4404 感受态细
胞, 挑取单菌落进行 PCR验证, 阳性克隆保存菌液待用。
1.5 烟草遗传转化
烟草种子经 75%乙醇和次氯酸钠消毒, 无菌水洗净
1096 作 物 学 报 第 42卷


后播于 1/2 MS0基本培养基上生长 4~5周, 利用叶盘法转
化烟草。将携带 pAhDGAT2a:GUS 表达载体的农杆菌于
28℃, 200转 min–1振荡培养至对数生长期。取烟草叶片,
剪成小块(0.5 cm × 0.5 cm)置 MS0重悬的菌液中 15 min,
取出后用无菌滤纸吸干水分。在 MS分化培养基上暗培养
2 d后取出, 于 MS选择培养基(含 100 mg L–1 kanamycin)
上诱导长出丛生芽 , 将丛生芽切下放入伸长培养基长至
3~5 cm时, 转移到生根培养基使其生根。将生根后的幼苗
移入盛有无菌土的花盆, 温室常规管理。
1.6 阳性植株的分子检测
利用 CTAB 法提取转基因烟草叶片的 DNA, 利用引
物 PD2F/PD2R进行 PCR检测。将阳性烟草的幼苗和其他
组织器官加入 GUS染液, 37℃保温 16 h。用 70%乙醇冲洗
浸泡, 在体视解剖镜下观察染色情况并照相。
2 结果与分析
2.1 pAhDGAT2a启动子克隆与测序
利用 GenomeWalking 试剂盒 , 经过 3 轮扩增得到
pAhDGAT2a的核苷酸片段(图 1), 长度 1200 bp左右。将
该序列连接到 pMD18-T 载体上测序表明 , 该序列为
AhDGAT2a基因的启动子序列。

图 1 pAhDGAT2a的两轮扩增结果
Fig. 1 PCR products of pAhDGAT2a promoter
M: DL2000; A: 第 2轮扩增结果; B: 第 3轮扩增结果。
M: DL2000; A: products of the second round PCR; B: products of
the third round PCR.

2.2 pAhDGAT2a启动子的序列分析
PlantCARE分析显示该序列含有 126个 TATA-box和
22个 CAAT-box元件, 符合启动子的一般特点。该启动子
序列含有多个与胁迫和防御相关的顺式作用元件, 主要
包括一个参与干旱应答反应的MBS元件, 3个参与高温应
答反应的 HSE 元件 , 2 个参与胁迫和防御应答反应的
TC-rich repeats。另外还含有 3 种激素应答元件, 包括 2
个激素应答元件 TGA-元件, 2个茉莉酸应答元件 CGTCA-
motif 和 TGACG-motif, 一个赤霉素应答元件 GARE-
motif。该启动子还含有真菌激活子应答元件 W1-box及一
些光应答元件(Sp1、I-box、GT1-motif、ACE和 MNF1)。
这表明 AhDGAT2a的表达调控可能受多种因素的影响。
2.3 烟草的遗传转化与分子检测
先利用卡那霉素初步筛选, 再利用 PCR 方法检测转
基因烟草株系(图 2)。结果表明, 有 14 个株系在 1200 bp
左右出现条带, 该片段与目的条带大小一致, 表明我们得
到了阳性转基因烟草株系。
2.4 转基因烟草的 GUS染色
利用 GUS 染色方法检测 GUS 基因在 T2代转基因烟
草的各组织器官表达的结果表明(图 3), GUS 在转基因烟
草的营养和生殖器官均有表达, 其中在柱头、花药和幼嫩
种子中表达量较高(图 3-G, H), 而在花丝和花柱中则基本
不表达(图 3-F, G)。
3 讨论
TAG是大多数植物和动物体内最重要的油脂贮藏形
式, DGAT 是 TAG 合成反应的限速酶, 对于种子油脂合
成非常重要 [17-18]。在拟南芥等多种植物中过量表达
DGAT 基因均能显著提高种子的含油量 [17,19,28-30]。我们
实验室前期从花生中克隆得到了 DGAT2 基因 , 将其与
CaMV35S 启动子相连接 , 构建植物表达载体转化烟草
并对其进行了功能验证 , 发现其能提高转基因烟草的总
脂肪酸含量 [25]。
启动子是一段位于结构基因 5端上游区的DNA序列,
能够使 RNA 聚合酶与之结合并起始目标基因转录, 是转
录水平上基因表达调控的关键部位。启动子上的顺式作用
元件通常含有 TATA-box、CAAT-box和 GC-box元件, 其
中 TATA-box 是启动子上最具特征的序列。本研究的
pAhDGAT2a 中含有 126 个 TATA-box 和 22 个 CAAT-box
元件, 表明其具有典型启动子的特征。
不同的启动子都具有自己特异的调节序列, 如 USE、
MSP 等。大多数绿色植物都包含若干个光应答元件(light
response element), 如 G-box[31-32]、I-box[31]、GT1元件(或

图 2 PCR检测转基因烟草
Fig. 2 PCR detection of the transgenic tobacco lines
1~18: 转基因烟草株系; M: DL2000; +: 阳性对照; –: 阴性对照; WT: 野生型烟草。
1–18: transgenic tobacco lines; M: DL2000; +: positive control; –: negative control; WT: wide type tobacco.
第 7期 郑 玲等: 花生 AhDGAT2a基因启动子的克隆和功能验证 1097



图 3 转基因烟草的 GUS染色图
Fig. 3 GUS staining of the transformed tobacco lines
A~D: 野生型烟草; E~H: 转基因烟草; A, E: 烟草幼苗; B, F: 花;
C, G: 花药和柱头; D, H: 未成熟的种子。
A~C, E~G比例尺为 1 cm; D, H比例尺为 1 mm。
A–D, wild type tobacco; E–H, transgenic tobacco. A and E:
seedlings; B and F: flowers; C and G: anthers and stigmas;
D and H: immature seeds. Bars = 1 cm in A–C and E–G; bars =
1 mm in D, H.

GATA 元件)[33]、AT 富含元件[34-35]、Z-box[36]等, 这些作
用元件对光调控的转录激活是必需的[37]。在 pAhDGAT2a
中也含有一些光应答元件, 而前期研究表明 AhDGAT2 基
因在花生叶片中具有一定的表达量 [25], 这些结果表明
AhDGAT2 的表达调控可能会受到光信号的影响。
pAhDGAT2a 还包含激素响应元件和胁迫诱导元件, 预示
AhDGAT2a的表达受激素诱导, 并且在胁迫响应中起一定
的作用。我们前期分析了 AhDGAT2基因在不同胁迫(冷、
干旱、盐、紫外照射、ABA、机械损伤和病害)下的表达
模式, 结果表明 AhDGAT2 基因在受到机械损伤时表达下
调最明显, 在冷、干旱、盐和紫外照射胁迫下表达量略有
下降, 而在 ABA 处理和病害胁迫下表达显著上调[25]。这
恰好与 pAhDGAT2a含有多种胁迫相关元件相吻合。在他
人研究中也有类似报道 , 如麻风树的种子特异性启动子
JcMFT1 受脱落酸诱导, 是由于其含有 ABA 应答元件、
G-box、RY repeat等元件[38]; Xu等[39]在中国华东野生葡
萄中克隆了一个受白粉病和赤星病诱导表达的 VpSTS 诱
导型启动子, 通过序列分析发现该启动子含有 Box-W1、
TC-rich element、ABRE、MBS、LTR等特殊元件。
目前关于植物 DGAT1 基因组织特异性表达的研究有
较多报道, 而关于植物 DGAT2 基因的组织器官特异性表
达的研究较少。普遍认为大多数高等植物的 DGAT1 基因
在各组织器官中均表达, 而 DGAT2 则与植物种子中特殊
脂肪酸的积累有关。拟南芥 DGAT1 在发育中的种子、花
瓣、花芽中表达量高, 而在叶和茎中表达量低[19], 大多数
双子叶植物例如大豆、斑鸠菊、油菜的表达模式与拟南芥
相似[14,17,40], 而旱金莲DGAT1只在发育的种子中表达[41]。
桐树 DGAT2 基因在种子发育中期被较强诱导表达, 而在
其他器官中表达量很低, 表明桐树 DGAT2 与种子中脂肪
酸积累直接相关 [28]。斑鸠菊、大戟、琉璃苣和蓖麻的
DGAT2基因在种子发育早期高表达, 而大豆 DGAT2基因
在种子中的表达量很低。相反, 大豆 DGAT1 基因在种子
中表达量较高[42]。我们前期关于 AhDGAT2基因组织器官
特异性表达模式研究表明 , 该基因在花生的各个器官都
表达, 但是在叶、花以及种子发育前期表达量较高[25]。本
研究中将 pAhDGAT2a 构建 GUS 植物表达载体并转化烟
草, 结果发现该序列不仅能正确启动 GUS 基因表达, 而
且在转基因烟草的各个器官中都表达 , 与我们前期研究
结果一致, 但是与桐树 DGAT2和大豆 DGAT2的表达特点
显著不同。本研究中 GUS 活性在转基因烟草柱头和花药
中较强表达, 显示出 AhDGAT2a 基因在花生授粉中的重
要性, 这一点在其他文献中未见报道。这些研究均表明,
DGAT1与 DGAT2基因的组织器官特异性表达模式因物种
而异。二者不仅在植物种子脂肪酸合成中具有重要作用,
同时对于其他组织器官内的脂肪酸合成(比如维持细胞膜
脂类的动态平衡), 甚至对于植物个体的整个发育过程都
具有十分重要的作用。
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