全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(1): 60−67 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家转基因生物新品种培育重大专项(2011ZX08010-004)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 夏兰琴, E-mail: xialq@mail.caas.net.cn, Tel: 010-82105804
第一作者联系方式: E-mail: mdh2493@126.com, Tel: 13609123593
Received(收稿日期): 2012-04-19; Accepted(接受日期): 2012-09-05; Published online(网络出版日期): 2012-11-14.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20121114.1645.017.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.00060
基因枪转化小麦主要轰击参数的优化
闵东红 1 何 莎 1,2 张 彦 2 夏兰琴 2,*
1西北农林科技大学农学院, 陕西杨凌 712100; 2中国农业科学院作物科学研究所, 北京 100081
摘 要: 基因枪转化是目前小麦遗传转化的主要方法。影响基因枪转化效率的主要参数有轰击距离、轰击压力、DNA
总量及浓度、金粉颗粒大小及用量等。为改善目前小麦遗传转化效率偏低的现状, 以普通小麦品种科农 199 为受体
材料, 设金粉大小(0.6 μm和 1.0 μm)、轰击距离(5.5 cm和 8.5 cm)及轰击压力(650、900和 1100 psi)三因素共 12个处
理, 利用 pAHC25质粒转化小麦幼胚, 以确定最佳轰击参数, 建立稳定高效的普通小麦基因枪转化体系。结果表明, 3
个因素的不同组合对幼胚的愈伤诱导效率没有明显影响, 但对再生率影响较大, 以金粉 0.6 μm、轰击距离 5.5 cm的
再生率最高。3个因素组合的不同处理对 GUS瞬时表达有明显影响, 以金粉 0.6 μm、轰击距离 5.5 cm和轰击压力 650
psi处理的 GUS瞬时表达量最高。本试验最终获得 28株转基因植株, 其中 12株来自金粉 0.6 μm、轰击距离 5.5 cm
和轰击压力 650 psi的处理, 该处理的平均转化率达 2.45%。
关键词: 小麦; 基因枪转化; 轰击参数; 转化效率
Optimization of Key Bombardment Parameters in Biolistic Mediated Trans-
formation in Wheat
MIN Dong-Hong1, HE Sha1,2, ZHANG Yan2, and XIA Lan-Qin2,*
1 College of Agronomy, Northwest A＆F University, Yangling 712100, China; 2 Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences,
Beijing 100081, China
Abstract: Biolistic mediated method is an important approach in wheat genetic transformation. The objective of this study was to
optimize the bombardment parameters and establish an efficient and stable biolistic transformation system using common wheat
(Triticum aestivum L.) variety Kenong 199 with 12 treatments of parameter combinations composed of gold particle size, target
distance, and acceleration pressure. The results indicated that different combinations of parameters had different effects on the
transient expression of GUS gene encoding β-glucuronidase, regeneration of calli, and final transformation efficiency. The pa-
rameter combination of 0.6 μm gold, 5.5 cm target distance, and 650 psi acceleration pressure exhibited good regeneration and the
highest level GUS transient expression. Furthermore, stable expression of GUS gene in transgenic lines was confirmed by histo-
chemical staining assay. Of the 28 transgenic T0 plants obtained, 12 were from the treatment with the above optimized parameter
combination, with an average transformation efficiency of 2.45%.
Keywords: Wheat; Biolistic mediated-transformation; Bombardment parameter; Transformation efficiency
转基因技术能将不同物种来源的目的基因人工
重组和遗传转移, 打破物种间基因交流的屏障, 拓
宽作物遗传改良的基因来源。将转基因技术应用于
小麦的遗传改良, 对于培育具有突破性小麦新品种
具有重要意义。目前, 小麦遗传转化主要采用基因
枪法和农杆菌介导法, 其中基因枪法占 68.8% [1]。相
对于农杆菌转化等其他遗传转化方法, 基因枪转化
具有可转化受体基因型广泛、可控性强、操作简便
等优点。自 1992 年 Vasil 等[2]利用基因枪转化获得
首例抗除草剂转基因小麦以来, 基因枪介导的小麦
遗传转化在抗病、抗逆、品质改良、提高产量等领
域取得了显著进展[3-8]。
第 1期 闵东红等: 基因枪转化小麦主要轰击参数的优化 61


由于小麦再生能力差, 转化效率低成为小麦转
基因研究与应用中亟待解决的问题。优化转化体系、
提高转化效率一直是国内外的一个研究热点, 并对
外植体[10]、培养基成分[10-12]、筛选基因的选择[13-15]、
轰击参数的优化 [15-17]等开展了大量工作。例如 ,
Hagio[18]认为选择合适的基因表达载体及受体组织、
优化基因枪轰击参数可有效提高基因枪的转化效
率。基因枪轰击参数主要包括金粉颗粒大小、轰击距
离、轰击压力和真空度等。目前, 在小麦基因枪遗传
转化研究中, 真空度多采用 27~28 inches Hg [16,19], 但
金粉颗粒大小、轰击距离、轰击压力这 3 个参数变
化较大。应用最多的是 Bio-Rad 0.6 μm和 1.0 μm的
金粉颗粒, 轰击距离一般为 6~12 cm, 轰击压力一
般在 650~1550 psi 之间[20]。Rasco-Gaunt 等[16]认为
0.6 μm的金粉能获得好的效果, 相比 1.0 μm对细胞
的损伤更小。Indra等[20]提出轰击距离影响金粉的分
布, 12 cm比 6 cm或 9 cm时金粉分布更均匀, 轰击
效果更好; 而 Rasco-Gaunt等[16]则认为 5.5 cm的轰
击距离能得到较高的瞬时表达量。较低的轰击压 650~
1100 psi 可使外源基因的瞬时表达量明显增高[16,21],
轰击距离短、轰击压高将会导致愈伤组织损伤, 进
而影响再生能力[22]。
基因型对小麦的遗传转化成功与否及转化效
率也有重要影响 , 不同基因型在胚性愈伤组织诱
导、继代维持及分化、再生能力等方面均表现出较
大差异 [23-25]。选择合适的小麦基因型不仅可以提高
转化效率 , 更重要的是可以实现转基因小麦的快
速产业化。近年来虽然小麦基因枪遗传转化研究发
展较快 , 国内也有很多针对不同小麦品种优化转
化条件的研究报道 [19,21,26-29], 但是适用于基因枪
转化的小麦品种(基因型)仍然十分有限, 并且转化
效率偏低现象未得到改善。因此, 提高转化效率和
扩大基因型范围 , 建立和优化适合中国小麦品种
的转化体系 , 对促进我国小麦转基因研究具有重
要意义。
科农 199 是中国科学院遗传与发育生物学研究
所选育的普通小麦新品种, 表现分蘖力强, 灌浆快,
落黄好, 籽粒饱满等优良农艺性状, 同时具有高产、
广适、抗逆、节肥等特性[30]。该品种组培再生能力
强, 是进行小麦遗传转化的优良受体材料。本研究
对小麦基因枪转化中的金粉大小、轰击距离和轰击
压力 3 个参数进行优化组合, 以期建立和完善普通
小麦基因枪转化体系。
1 材料与方法
1.1 材料及幼胚准备
以普通小麦品种科农 199 为基因枪转化的受体
材料。质粒为 pAHC25, 全长 9.6 kb, 含筛选基因
BAR和报告基因 GUS, 均由玉米 Ubi启动子驱动(图
1), 由本实验室保存。金粉和可裂膜购自 Bio-Rad公
司(美国), 所有引物由北京六合华大基因科技股份
有限公司合成。

图 1 pAHC25质粒 BAR和 GUS基因表达盒图谱
Fig. 1 Schematic show of BAR and GUS gene cassettes in
pAHC25
UBI: Ubiquitin启动子; NOS: 终止子; 箭头表示引物位置。
UBI: Ubiquitin promoter; NOS: NOS terminator; arrows represent
the site of primers.

取科农 199 开花后 14~16 d 的未成熟种子, 用
10%次氯酸钠消毒处理后, 在无菌条件下剥离幼胚,
切去胚芽, 盾片组织向上置含 9%甘露醇的MS高渗
培养基(MS+2 mg L−1 2,4-D)上, 每个培养皿(90 mm)
接种约 60个幼胚, 置 22 ℃、黑暗条件下预培养 1~2
d后用于基因枪轰击。
1.2 基因枪轰击
1.2.1 微弹制备 以 0.6 μm 的金粉为例, 50 μL
金粉悬浮液(20 mg mL−1)中加入 5 μL质粒 DNA (1
μg μL−1)、50 μL氯化钙(2.5 mol L−1)和 20 μL亚精胺
(0.1 mol L−1), 混匀, 离心弃上清液; 用 150 μL无水
乙醇重新悬浮, 2次离心后弃上清液, 再加 85 μL无
水乙醇, 悬浮置冰上。将包被有 DNA的金粉悬浮液
涂于微弹承载片, 每片 5 μL, 待干燥后用于轰击。
每次涂液前将悬浮液漩涡处理使之混合均匀。
1.2.2 轰击转化 对 3 个参数共设 12 个处理(表
1), 每处理 12 皿, 用 PDS-1000/He 基因枪(Bio-Rad,
美国)轰击, 每皿轰击 1次。
1.3 抗性愈伤及植株的筛选
于 4.5%MS 培养基上暗培养轰击后的幼胚, 诱
导愈伤 3 周 , 然后进行再生筛选 , 采用 PPT
(L-phosphinothricin)作为筛选剂筛选 2轮, 第 1轮再
生筛选培养于 22 16 h℃ 光照条件(50 μmol s−1 m−2)
下, 在 RDZ PPT2.5培养基(RDZ培养基[31]加 2.5 mg
L−1 PPT)中培养 3周; 第 2轮再生筛选, 培养于 22 ℃
16 h光照条件(50 μmol s−1 m−2)下在 RDZ PPT3.5培

62 作 物 学 报 第 39卷

表 1 基因枪轰击时的不同参数组合
Table 1 Combinations of parameters for wheat particle bombardment
处理编号 Treatment No. 参数
Parameter T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11 T12
金粉大小 Gold particle size (µm) 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
轰击压力 Acceleration pressure (psi) 650 650 900 900 1100 1100 650 650 900 900 1100 1100
轰击距离 Target distance (cm) 5.5 8.5 5.5 8.5 5.5 8.5 5.5 8.5 5.5 8.5 5.5 8.5

养基(RDZ培养基+3.5 mg L−1 PPT)中培养 3周, 利用
再生培养基壮苗培养 1~3周后移栽入土。
1.4 转基因植株的检测与分析
1.4.1 PCR和 Southern分析 采用天根生化科技
有限公司的植物基因组 DNA 提取试剂盒提取转基
因小麦基因组DNA, 用GUS基因特异性引物GUSF/
GUSR, 序列为 GUSF: 5′-AGTGTACGTATCACCG
TTTGTGTGAAC-3′和 GUSR: 5′-ATCGCCGCTTTG
GACATACCATCCGTA-3′, 检测除草剂抗性植株 ,
预期产物长为 1051 bp, 扩增程序为: 94℃预变性 3
min; 94℃变性 40 s; 60℃退火 45 s; 72℃延伸 1 min,
35个循环; 72℃延伸 10 min, 扩增产物经 1.2%琼脂
糖凝胶电泳后, 检测特异条带。Southern 杂交采用
Roche 高效 DNA 地高辛标记和检测试剂盒Ⅰ。取
30 μg基因组 DNA, Sac I过夜酶切, 0.8%琼脂糖凝胶
于 1×TAE buffer中 30 V电泳 12 h, 后用毛细管虹吸
印迹法转移至带正电的尼龙膜上。以 1051 bp 长的
GUS基因的 PCR产物为模板, 用随机引物法地高辛
标记探针, 42℃杂交 16 h以上。洗膜及显色的具体
过程见说明书。
1.4.2 GUS 组织化学染色法 X-Gluc 染色反应
液成分为 50 mmol L−1 Na3PO4、0.1% Trition-100、
20%甲醇和 0.5 mg mL−1 X-Gluc (pH 7.0)。待测组织
与该反应液在 37 ℃保温 3~5 h后, 以 75%乙醇脱色,
立体显微镜拍照。
1.4.3 统计分析 采用软件 SPSS14 中的 S-N-K
法统计分析数据, 每组实验 3 次重复。S-N-K (Stu-
dent-Newman-Keul)法也称 q 检验, 是将一组 k 个平
均数由大到小排列后, 根据所比较的 2 个处理平均
数的差数是几个平均数间的极差分别确定最小显著
极差值 LSRα的方法。
2 结果与分析
2.1 愈伤组织诱导、筛选、分化和 GUS检测
用金粉包被含有 BAR 基因和 GUS 基因的
pAHC25后 , 在不同轰击参数条件下转化科农 199
幼胚, 诱导愈伤(图 2-A), 愈伤组织体积大, 色泽淡
黄, 上面布满珊瑚状突起; 愈伤组织转入第 1 轮再



图 2 基因枪介导 pAHC25转化科农 199获得转基因植株
Fig. 2 Biolistic-mediated transformation of Kenong 199 with pAHC25 vector
A: 基因枪轰击后的小麦幼胚诱导愈伤; B: 小麦愈伤组织在 RDZ PPT2.5上的第 1轮再生筛选; C: 再生植株在 RDZ PPT3.5上的第 2
轮筛选; D: 2轮筛选后的抗性植株在 R培养基上壮苗; E和 F: 抗性植株转入土中; G: 部分转基因植株叶片的 GUS表达。
A: embryogenesis of calli on induction medium after bombardment; B: regenerated shoots from calli on RDZ PPT2.5 medium; C: regenerated
shoots from calli on RDZ PPT3.5 medium; D: growth of PPT resistant plants on R medium; E and F: positive plants transferred to soil;
G: stable GUS expression in the leaves of partial transgenic plants.
第 1期 闵东红等: 基因枪转化小麦主要轰击参数的优化 63


生筛选 RDZ PPT2.5培养基筛选 21 d (图 2-B), 长出
绿色小芽, 有的分化出少量的细根; 将再生组织转
到第 2轮再生筛选 RDZ PPT3.5培养基筛选 21 d (图
2-C), 分化出根和叶; 然后将抗性植株转到 R 培养
基上壮根 7 d (图 2-D), 转入花盆(图 2-E, F)。从 PCR
阳性的植株取少量叶片, 用 GUS 组织化学染色法
进行检测(图 2-G), 共获得 13株GUS阳性转基因植
株。
2.2 不同的轰击参数组合对幼胚的愈伤诱导和
再生的影响
不同参数轰击对幼胚愈伤诱导效率的影响不大,
不同参数组合轰击幼胚的平均愈伤诱导率介于
84.9%与 98.0%之间, 但轰击参数对幼胚再生率的影
响差异明显(表 2)。从单个因素来看, S-N-K 分析显
示, 不同轰击压力对再生的影响差异不明显; 金粉
颗粒大小和轰击距离对再生效率的影响较大, 金粉
0.6 μm的平均再生率为 53.6%, 明显高于 1.0 μm时
的 37.2% (P<0.01), 轰击距离为 5.5 cm的平均再生
率为 52.5% , 显著高于 8.5 cm时的 38.3% (P<0.01)。
从参数组合来看, S-N-K 分析显示, 将 12 个处理分
为 4组, 第 1组为T1处理; 第 2组为T3和T5处理; 第
3组为 T2、T4、T7~T11处理; T12处理为第 4组, 组间
存在显著差异(P<0.05), 组内无明显差异。其中, 第
1组(T1处理)金粉为 0.6 μm、可裂膜 650 psi、轰击
距离为 5.5 cm 时, 平均再生率达到 68.7%, 为所有
处理中最高, 与其他处理都有显著差异; 仅次之为
第 2组, 即金粉 0.6 μm、可裂膜 900 psi、轰击距离
5.5 cm (T3处理)和金粉 0.6 μm、可裂膜 1100 psi、轰
击距离 5.5 cm (T5处理), 平均再生率分别为 60.6%
和 59.5%; 第 3 组(T2、T4、T7~T11处理)中各处理的
再生率无显著差异, 比 T12处理的再生率稍高, 但总
体比第 1、第 2组低; 第 4组(T12处理)金粉为 1.0 μm、
可裂膜 1100 psi、轰击距离为 8.5 cm的再生率最低,
仅为 23.3%, 与其他处理相比显著降低(P<0.01)。
2.3 不同的轰击参数组合对 GUS 瞬时表达的影
响
基因枪轰击后 3 d, 从每个实验组中分别随机挑
选 10个胚进行 GUS组织化学染色(图 3), 统计平均
每胚的 GUS 瞬时表达量(表 3)。图 4 显示了不同参
数下轰击后 GUS瞬时表达的差异。从单个参数来看,
S-N-K 分析表明, 当金粉为 0.6 μm 时, 平均每胚的
GUS 瞬时表达量为 43.6±2.1, 明显高于金粉为 1.0
μm时的 13.9±1.4 (图 4-A), 差异极显著(P<0.01); 轰
击距离增加至 8.5 cm, 平均每胚的 GUS瞬时表达量
为 11.2±1.4, 显著低于轰击距离为 5.5 cm 时的
55.9±4.8 (P<0.01)(图 4-B); 轰击压力对 GUS瞬时表
达也有重要的影响, 650 psi与 900 psi的影响差异不
大, 但当轰击压提高到 1100 psi 时, 每个胚的平均
GUS 瞬时表达量明显减少(图 4-C), 与低轰击压时
有显著差异(P<0.01)。从参数组合来看, S-N-K分析
显示, 12个处理分为 3组, 第 1组为 T1和 T3处理, 第
2组为 T5处理, 其他处理为第 3组, 组间差异极显著
(P<0.01), 组内无明显差异。T1和T3处理得到的GUS
瞬时表达量明显大于其他处理, 其中 T1处理即金粉
0.6 μm、轰击距离 5.5 cm和轰击压力 650 psi得到的
平均每胚的 GUS瞬时表达量最大(图 3-A), 为 84.2±
7.3 (表 3)。
2.4 不同的轰击参数组合对转化效率的影响
12 个处理共获得 1341 个抗性植株。利用 GUS
基因的特异性引物进行 PCR 检测(图 5), 共鉴定出

表 2 不同轰击参数组合条件下的诱导愈伤率和再生率
Table 2 Embryogenesis and regeneration efficiency under different bombardment parameters (%)
轰击压力 Acceleration pressure 项目
Item
金粉颗粒大小
Gold particle size
轰击距离
Target distance 650 psi 900 psi 1100 psi
平均值
Average
5.5 cm 97.1 98.0 94.1 95.8 0.6 μm
8.5 cm 95.6 94.2 92.3 92.9
5.5 cm 94.8 90.3 86.8 89.8 1.0 μm
8.5 cm 90.1 91.5 86.8 87.7
诱导愈伤
Embryogenesis efficiency
平均值 Mean 93.8 92.8 80.0
5.5 cm 68.7 60.6 59.5 62.5 0.6 μm
8.5 cm 40.3 42.5 52.8 44.8
5.5 cm 40.4 43.9 44.7 42.6 1.0 μm
8.5 cm 36.8 37.1 23.3 31.9
再生率
Regeneration efficiency
平均值 Mean 46.1 45.6 44.6
64 作 物 学 报 第 39卷

表 3 轰击后 3 d幼胚的 GUS瞬时表达情况
Table 3 GUS transient expression in immature wheat embryos at three days after bombardment
处理
Treatment
胚数
Number of
embryos tested
平均每胚的 GUS瞬时表达量
Number of blue spots per
embryo
处理
Treatment
胚数
Number of
embryos tested
平均每胚的 GUS瞬时表达量
Number of blue spots per
embryo
T1 30 84.2±7.3 T7 30 23.9±2.9
T2 30 15.2±2.9 T8 30 11.5±1.0
T3 30 76.6±4.2 T9 30 25.6±4.1
T4 30 21.5±1.5 T10 30 4.2±1.0
T5 30 54.8±8.1 T11 30 13.4±0.9
T6 30 7.5±2.5 T12 30 4.5±1.8
GUS瞬时表达量为 3次重复的平均值±标准误。GUS transient expressions are shown as mean±SE of three replicates.

图 3 基因枪轰击后 3d幼胚的 GUS瞬时表达情况
Fig. 3 GUS transient expression of wheat immature embryos at three days after bombardment

图 4 不同轰击参数对基因枪转化小麦 GUS瞬时表达的影响
Fig. 4 Effects of different bombardment parameters on the GUS transient expression in wheat genetic transformation
A: 金粉大小对 GUS瞬时表达的影响; B: 轰击距离对 GUS瞬时表达的影响; C: 轰击压对 GUS瞬时表达的影响。误差线代表标准误。
A: Effect of gold particle size on the GUS transient expression; B: Effect of target distance on the GUS transient expression; C: Effect of
acceleration pressure on the GUS transient expression. Error bar represents standard error.


图 5 T0代转基因小麦的 PCR检测
Fig. 5 PCR analysis of T0 generation transgenic wheat lines
M: DL2000; 1: CK+; 2: CK–; 3, 4, 6~8, 10, 11: 阳性植株;
5和 9: 非转基因植株。
M: DL2000; 1: CK+; 2: CK–; 3, 4, 6-8, 10, and 11: transgenic T0
plants; 5 and 9: non-transgenic plants.

GUS 基因 PCR 阳性植株 28 株。其中参数为金粉
0.6 μm, 可裂膜 650 psi, 轰击距离 5.5 cm的组合获
得 12 株。金粉 0.6 μm, 可裂膜 900 psi, 轰击距离
5.5 cm 的组合获得 10 株; 金粉 0.6 μm, 可裂膜
1100 psi, 轰击距离 5.5 cm的组合获得 5 株; 金粉
0.6 μm, 可裂膜 1100 psi, 轰击距离 8.5 cm的组合
只获得 1 株转基因植株; 金粉为 1.0 μm 的组合没
有得到转基因植株(表 4)。进一步 GUS 染色鉴定表
明, 28 株 PCR 阳性植株中, 有 13 株 GUS 表达, 15
株 GUS 没有表达(图 2-G)。Southern blot分析结果
表明, 部分转基因植株的 GUS 基因不表达可能与
转基因的拷贝数有关 , 拷贝多可能导致基因沉默
(图 6)。
第 1期 闵东红等: 基因枪转化小麦主要轰击参数的优化 65


表 4 不同轰击参数组合下的 PCR阳性植株数、GUS阳性植株数和转化率
Table 4 PCR positive plants, GUS positive plants, and final transformation efficiency in different treatments
处理
Treatment
接种幼胚总数(个)
Total embryos
最终成活的转化植株数
Survived plants
PCR阳性植株数
PCR positive plants
GUS阳性植株数
GUS positive plants
转化率
Transformation efficiency (%)
T1 489 196 12 5 2.45
T2 385 87 0 0 —
T3 446 152 10 4 2.24
T4 431 103 0 0 —
T5 407 137 5 3 1.23
T6 418 125 1 1 0.24
T7 444 101 0 0 —
T8 424 88 0 0 —
T9 431 102 0 0 —
T10 414 87 0 0 —
T11 425 107 0 0 —
T12 427 56 0 0 —
转化率(%)=PCR阳性苗数/接种幼胚总数×100。Transformation efficiency (%)= PCR positive plants/ total embryos×100.


图 6 T0代转基因植株的 Southern blot分析
Fig. 6 Southern blot analysis of four randomly selected
transgenic T0 plants
基因组 DNA用 Sac I酶切, 质粒 DNA用 Hind III酶切, 杂交探
针为 1051 bp的 GUS基因片段。1和 2: PCR检测阳性但不表达
的转基因植株; 3和 4: GUS表达转基因植株; 5: 非转基因对照
(CK–); 6: pAHC25; M: λ-Hind III ladder。
Genomic and plasmid DNA were digested with Sac I and Hind III,
and hybridized probe is a 1051 bp GUS gene fragment. 1 and 2:
positive transgenic T0 plants without GUS expression; 3 and 4:
positive transgenic T0 plants with GUS expression; 5:
non-transformed control CK–; 6: pAHC25; M: λ-Hind III ladder.

3 讨论
基因枪已广泛应用于某些小麦品种遗传转化研
究中[2,17,32-33]。影响基因枪转化小麦的因素很多, 主
要有外植体、培养基成分、筛选基因的选择、轰击
参数等。轰击参数的优化是提高小麦遗传转化稳定
性和效率的工作重点。为了提高基因枪转化普通小
麦的效率, 我们从优化轰击参数入手, 选择了金粉
大小、轰击距离和轰击压力 3 个对转化成功与否和
转化效率有重要影响的参数, 优化了科农 199基因
枪转化体系。本实验中各个处理对幼胚的再生率、
瞬时表达量、和转化效率的影响是由这 3 个参数综
合体现的, 同时又与组培系统、受体材料有着密切
的关系, 所得结果与前人的研究不尽相同。我们发
现, 金粉大小对 GUS 瞬时表达有明显的影响, 用
0.6 μm金粉的 GUS瞬时表达量明显高于用 1.0 μm
的(图 4-A), 这可能是由于 1.0 μm 的金粉在微弹制
作过程中更容易被聚集, 对组织的机械损伤可能也
更大[16]。通常情况下, 轰击距离的增加会降低 GUS
瞬时表达率, 用 8.5 cm的距离轰击的GUS瞬时表达
量明显低于用 5.5 cm的(图 4-B), 这与 Folling等[34]
的报道相一致。轰击压对 GUS 瞬时表达也有影响,
650 psi的轰击压与 900 psi对 GUS瞬时表达影响没
有明显差异, 但当用 1100 psi 时瞬时表达率明显下
降, Rasco-Gaunt 等[16]认为低的轰击压力使 GUS 蓝
斑分布更均匀, 对组织伤害也小。此外, 基因枪法转
化效率主要取决于小麦再生体系的效率[35]。我们发
现, 不同的轰击参数对再生效率会产生重要影响(表
3), 本试验中 0.6 μm×5.5 cm×650 psi处理的小麦幼
胚平均再生率达 68.7%, 明显高于其他处理
(P<0.05)。
早期的基因枪法转化小麦的转化频率大约为
1%[14], 随着人们对转化过程中各种参数的优化, 转
化率有所提高 [32], 但大多数高转化率多是以
Bobwhite 等模式品种为受体材料获得的, 而这些品
种的农艺性状较差, 在我国小麦育种中很难利用。
本研究利用科农 199 这一中国推广小麦品种为转化
受体 , 愈伤诱导效果很好 , 愈伤组织体积大 , 色泽
淡黄 , 上面布满珊瑚状突起 , 平均愈伤诱导率在
84.9%以上 , 最高可达 98.0%, 再生植株茎秆健壮 ,
66 作 物 学 报 第 39卷

生长良好, 0.6 μm×5.5 cm×650 psi处理的平均再生
率可达 68.7%, 由此可以看出, 科农 199为基因枪转
化的理想受体材料。遗憾的是, 本实验虽然获得抗
性再生植株较多, 但阳性植株数较少, 分析其原因
大致有两个: 第一, 非抗性再生植株可能有逃逸现
象, 筛选剂浓度的选择与受体基因型有关, 不同的
基因型要求的筛选浓度也不同[28,36]。我们采用 2.5
mg L−1 PPT及 3.5 mg L−1 PPT两个浓度梯度, 对于科
农199来说可能偏低, 以后的实验可以适当提高 PPT
浓度或减少筛选周期增加筛选次数等。第二, 组培
污染和移苗成活率低。由于可控温室的空间有限 ,
使再生植株不能及时转入花盆以致出现小老苗和组
培污染现象, 再加上缓苗阶段的温度和光照等条件
不适, 造成移苗成活率降低。
基因枪转化具有宿主广泛、可控性强、操作简
便等优点。然而其缺点也显而易见, 如易插入载体
骨架序列, 以抗生素基因、抗除草剂基因等作为选
择标记可能带来的安全隐患等, 安全转基因体系的
建立势在必行。近些年, 人们开始 DNA线性片段的
直接转化研究[37], 这为转基因小麦的研发拓展了新
方向。因此, 基因枪转化普通小麦优化体系的建立
是非常必要的。通过对轰击幼胚后的 GUS瞬时表达
及愈伤诱导率和再生率的研究, 我们优化了基因枪
转化小麦科农 199 的轰击参数, 可为今后开展普通
小麦基因枪转化线性 DNA片段研究提供依据。
4 结论
不同金粉大小、轰击距离和轰击压力组合对幼
胚的愈伤诱导效率没有明显的影响, 但对再生率、
GUS 瞬时表达及转化效率的影响较大, 以金粉 0.6
μm、轰击距离 5.5 cm和轰击压力 650 psi的组合效
果最好。
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