全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(3): 405−415 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家转基因生物新品种培育重大专项(2009ZX08001-010B)和山东省农业良种工程(2012–2014)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 刘炜, E-mail: wheiliu@163.com, Tel: 0531-83179572
第一作者联系方式: E-mail: zhangguojia314@163.com
Received(收稿日期): 2013-06-20; Accepted(接受日期): 2013-12-14; Published online(网络出版日期): 2014-01-17.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20140117.1627.001.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.00405
花生 AhSOS2基因的克隆及功能初探
张国嘉 1,2 侯 蕾 2 王庆国 2 徐建第 3 李 臻 2 刘 晓 2 戴绍军 1
刘 炜 2,*
1东北林业大学盐碱地生物资源环境研究中心 / 东北油田盐碱植被恢复与重建教育部重点实验室, 黑龙江哈尔滨 150040; 2山东省农业科
学院生物技术研究中心 / 山东省作物遗传改良与生态生理重点实验室, 山东济南 250100; 3山东省水稻研究所, 山东济南 250100
摘 要: SOS2 (Salt Overly Sensitive 2)作为植物中一类重要的耐盐相关基因, 在调控细胞内离子平衡及参与植物对盐
害的响应及适应过程中具有重要作用。本研究通过 RACE的方法, 从花生叶片中分离到一长 1462 bp、包含 1341 bp
开放阅读框(ORF)的 cDNA片段, 生物信息学分析显示, 该基因属 SOS2类基因, 被命名为 AhSOS2 (GenBank登录号
为 HG797656), 编码 446个氨基酸, 为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。对基因表达特性的荧光定量 PCR分析显示, AhSOS2
在花生中为组成型表达; 且受盐胁迫及干旱诱导。经 250 mmol L–1 NaCl处理后, 该基因在花生幼苗茎中被诱导表达,
表达量约是对照茎中的 30倍; 而在 30% PEG-6000模拟干旱处理下, 该基因在花生幼苗叶中表达量也明显升高。综
合以上结果, 显示 AhSOS2可能参与并调控花生对逆境的抗性及耐受性。目前, 已成功构建了 AhSOS2的植物双元表
达载体 pCAMBIA1301P-AhSOS2并获得转基因植株, 初步功能分析显示, 过表达 AhSOS2基因的转基因水稻对盐胁迫
的耐受性提高。预期这方面的工作对于解析花生对盐害、干旱等逆境的适应及防御机制, 进而指导花生抗性育种及
品质改良具有重要意义。
关键词: 花生; SOS2类基因 AhSOS2; 荧光定量 PCR; 表达特性; 抗逆; 品质改良
Cloning and Functional Characterization of Peanut Gene AhSOS2
ZHANG Guo-Jia1,2, HOU Lei2, WANG Qing-Guo2, XU Jian-Di3, LI Zhen2, LIU Xiao2, DAI Shao-Jun1, and
LIU Wei2,*
1Alkali Soil Natural Environmental Science Center, Northeast Forestry University / Key Laboratory of Saline-alkali Vegetation Ecology Restoration in
Oil Field, Ministry of Education, Harbin 150040, China; 2 Biotechnology Research Center, Shandong Academy of Agricultural Sciences / Key Labo-
ratory of Genetic Improvement, Ecology and Physiology of Crops, Shandong Province, Jinan 250100, China; 3 Shandong Rice Research Institute,
Shandong Province, Jinan 250100, China
Abstract: SOS2 (Salt Overly Sensitive 2) is a kind of important salt tolerance genes, which is involved in mediating the intracel-
lular ion balance and plays an important role in the response of plants to salt damage and adaptation. In this study, a 1462 bp
full-length cDNA, including a 1341 bp open reading frame, was isolated and harvested by RACE method. As the gene showed
more than 70% homologous to members of SOS2 subfamily in other plants by bioinformatics analysis, it is then named as Ah-
SOS2 (GenBank accession number HG797656). Its coding protein AhSOS2 has 446 amino acids, and is a member of serine/
threonine protein kinases. Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) analysis showed that AhSOS2 was expressed constitutively in
peanut tissues, and could be induced to express higher under salt and drought treatments. When treated with 250 mmol L–1 NaCl,
the gene expression level increased dramatically to about 30 times higher than that of control in the stems of peanut seedlings,
while the expression level of AhSOS2 increased markedly in the leaves of peanut seedlings when treated by drought stress that
imitated by 30% PEG-6000. AhSOS2 is supposed to participate in stress resistance and tolerance in peanut. The expression binary
vector of pCAMBIA1301P-AhSOS2 was constructed and the transgenic rice plants were obtained. The primary functional verifi-
cation showed that the ability of salt tolerance and adaptation was enhanced in AhSOS2 overexpression rice. The above research is
expected to uncover the adversity defense mechanisms of peanut grown under stress conditions, and further guide the resistance
406 作 物 学 报 第 40卷


breeding and quality improvement of peanut.
Keywords: Peanut; SOS2 gene AhSOS2; Quantitative real-time PCR; Expression pattern; Stress resistance; Quality im-
provement
土壤盐渍化是严重影响农作物生长和生态环境
的非生物胁迫因素之一[1]。植物在生长过程中经常
会受到高盐等不良环境影响 , 导致植物水分亏缺 ,
进一步产生离子毒害及渗透胁迫, 从而影响植物的
生长发育, 严重时会导致植物死亡[2]。植物在响应及
适应盐胁迫的过程中 , 形成了一系列调控机制 [3],
如渗透调节、离子区域化、活性氧清除等。其中, 胁
迫信号的感知和转导是引起植物产生理化响应及发
生变化的关键步骤。SOS (salt overly sensitive)信号
转导途径作为植物耐盐性相关的重要信号转导途径
之一, 在模式植物拟南芥中已有较深入的研究。且
已有证据证明, SOS信号途径除参与植物盐胁迫响
应及抗逆过程外, 还可以和其他信号途径交叉成网
络来共同发挥对不同生物学过程的调控作用 [4-5]。
SOS信号途径首先由朱健康等报道, 他们利用快中
子轰击(fast neutron bombardment)、T-DNA诱变以及
化学突变(如EMS诱导)等方法, 创制了大量的拟南
芥(Arabidopsis thaliana)突变植株, 从中筛选获得了
5组盐敏感SOS突变体 , 并进一步鉴定了5个SOS信
号通路的基因, 即AtSOS1、AtSOS2、AtSOS3、AtSOS4
和AtSOS5[6-14]。其中SOS2是拟南芥中重要的耐盐基
因之一[9]。SOS2对调控植物细胞中Na+、K+平衡具有
重要作用 , 对环境中高浓度的Na+和低浓度的K+非
常敏感, 其相关突变体缺乏对盐胁迫的耐受性。拟
南芥中AtSOS2基因位于5号染色体上 , 预期编码丝
氨酸 /苏氨酸蛋白激酶 , 其N-末端催化位点与酵母
SNF1激酶和哺乳动物的AMPK激酶非常相似, 在盐
胁迫下, 该基因在拟南芥根中表达明显被促进[9]。植
物在受到高盐胁迫时, SOS信号通路中的SOS3作为
Ca2+感受器, 能够激活体内的SOS2蛋白激酶, 并与
SOS2结合形成SOS3-SOS2蛋白激酶复合物, 通过磷
酸化激活SOS1, 使细胞膜上的Na+/H+逆向转运蛋白
发挥作用, 将体内的Na+排出体外, 维持体内的离子
平衡[15]。Hu等[16]从苹果中分离到CIPK基因MdSOS2,
通过序列比对和系统进化树分析, 显示该基因与拟
南芥中AtSOS2基因相似性很高, 且该基因受盐胁迫
诱导, 酵母双杂交试验证明, MdSOS2蛋白N-端可分
别与MdSOS3和AtSOS3相互作用 , 从而共同调控苹
果的耐盐性。Quan等[17]通过质壁分离和GFP染色技
术 , 证明了 SOS3的同系物 SCABP8/CBL10可与
SOS2蛋白激酶相互作用, 且SCABP8与SOS2还可共
同激活SOS1, 从而协同作用以提高拟南芥幼苗的耐
盐性。
花生(Arachis hypogaea L.)作为一种重要的经
济和油料作物 , 其产量和品质与人类生活密切相
关 [18-19]。花生主要生长于干旱和半干旱地区, 对较
低的叶片水势具有一定的耐受性[20]。在长期的恶劣
环境及进化过程中, 其体内形成了一定的防御系统,
并选择性地积累了部分胁迫抗性基因, 在植株维持
生命力及对逆境的适应中发挥了重要作用。然而 ,
目前有关花生耐盐抗逆及其在胁迫下体内离子稳态
调节及适应机制的报道仍较少[21]。因此, 利用现代
生物技术, 发掘花生抗逆相关基因并开展抗逆转基
因育种具有非常重要的意义。本研究在以往对抗性
SOS2 类基因相关报道的基础上, 通过设计简并引物,
并结合 5′Race和 3′Race的方法, 从花生叶片中分离
获得基因 AhSOS2, 进一步利用荧光定量 PCR 技术,
对正常生长及胁迫处理后的花生幼苗中 AhSOS2 的
表达特性进行了研究, 结果显示 AhSOS2 的表达受
盐害、干旱等胁迫诱导, 暗示该基因在抗盐及抗旱
过程中具有一定生物学功能。同时 , 通过构建
AhSOS2 的植物表达载体获得了部分转基因水稻材
料 , 对基因功能的初步研究结果显示该基因在抗
盐、抗逆过程中具有一定作用。这方面的研究成果,
预期将为揭示 AhSOS2 参与耐盐及抗旱过程及其调
控机制, 进而完善逆境下花生生长的防御网络构建,
及花生抗性育种和品质改良提供指导。
1 材料与方法
1.1 试验材料
将花生(Arachis hypogaea L.)品种鲁花 14 的种
子置培养皿中, 光照 16 h、25℃和黑暗 8 h、20℃条
件下浸泡 2 d, 萌发后播于盛有沙石的花盆中, 充分
浇水, 在温度 25℃和相对湿度 80%的条件下, 于温
室培养 15 d, 分别取生长一致的材料, 以浇灌及喷
施的方式处理。(1)以 30% PEG-6000 模拟干旱, 分
别处理 0、3、6、12、24和 48 h; (2)以 250 mmol L–1
NaCl分别处理 0、3、6、12、24和 48 h。取每种处
理的根、茎、叶、花、果针各 0.2 g (其中花和果针
取自大田生长植株), 经液氮速冻后 , 保存于–80℃
第 3期 张国嘉等: 花生 AhSOS2基因的克隆及功能初探 407


冰箱备用。
cDNA Synthesis Kit (D6210A TaKaRa)和 DNA
Purification Kit (DV805A TaKaRa), 均购自大连
TaKaRa 公司 ; 高纯质粒回收试剂盒 (DP1002 Bio
Teke)购自北京百泰克生物技术有限公司; 大肠杆菌
Trans DH5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有
限公司; 引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成及
山东省农业科学院生物技术研究中心测序。
用 于 基 因 扩 增 的 简 并 引 物 为 AhSOS2j1:
5′-CAGATHAAAAGRGAGATATCNATHATGAA-3′
及AhSOS2j2: 5′-GATARKGYAATCATCTCRAANGC
ATTCAT-3′; 用于扩增 AhSOS2 基因全长的引物为
AhSOS21: 5′-GGTACCTAGATTAGCCGTTAGCGTTG
T-3′及 AhSOS22: 5′-TCTAGACTGGATCATACAGT
CATTTGTCG-3′ (下画线分别表示 Kpn I和 Xba I酶
切位点), 用于 5′ RACE 扩增的 2 条嵌套引物为
AhSOS25I: 5′-ACCGGAACATAGTTTCTCCTGAAC
C-3′和 AhSOS25O: CATTATCAAAGGACCTCCCTC
AGTAC-3′, 用于 3′ RACE 扩增的 2 条嵌套引物为
AhSOS23I: 5′-GAGGTGCTAGGCAATCAAGGTTAT
G-3′ 和 AhSOS23: 5′-CGGATTGAGTGCATTGAC
AAAGC-3′; 用于 Real-time PCR 的引物为 Real-R:
5′-CACAGAGACTTGAAGCCT-3′及 Real-F: 5′-GGA
GAACATCAACACCCT-3′; 以 Actin为内对照, 其引
物序列为 P677F: 5′-GTCATCGTCATCCTCTTCTC-3′
和 P677R: 5′-CATTCCTGTTCCATTGTCAC-3′。
1.2 花生 RNA的提取及单链 cDNA合成
参照 SDS 法 [22]提取花生 RNA, 参照 cDNA
Synthesis Kit (D6210A TaKaRa)合成单链 cDNA, 具
体操作详见其说明书。
1.3 AhSOS2基因简并序列的克隆
参考已发表的拟南芥 SOS2 基因序列, 结合检
索 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)数据库,
获得不同物种中 SOS2 类基因序列信息, 其中包括:
大豆(Glycine max)中的 GmSOS2 (GenBank登录号为
XP_003549757), 胡 杨 (Populus euphratica) 中 的
PeSOS2 (GenBank 登录号为 ACN76476), 蓖麻
(Ricinus communis)中的 RcSOS2 (GenBank登录号为
XP_002524508), 葡萄 (Vitis vinifera)中的 VvSOS2
(GenBank 登录号为 XP_002285262), 芥菜(Brassica
juncea)中的BjSOS2 (GenBank登录号为ABM66448),
毛果杨(Populus trichocarpa)中的 PtSOS2 (GenBank
登录号为 XP_002324651), 百脉根(Lotus japonicus)
中的 LjSOS2 (GenBank 登录号为 BAD95978); 参考
以上 SOS2 类基因的氨基酸序列并设计简并引物,
PCR反应条件为 94℃ 3 min; 之后 94℃ 30 s、50℃
30 s、72℃ 1 min、共 30个循环; 最后 72℃ 10 min;
初步获得 AhSOS2 的 EST 序列。对扩增产物的测序
结果进行 BlastX分析, 以验证结果的正确性。
1.4 AhSOS2基因 3′端和 5′端序列的获得
在获得 AhSOS2 基因 EST 序列的基础上, 分别
设计 5′Race 和 3′Race 特异性引物 , 参照试剂盒
5′-Full RACE Kit (Code D315, TaKaRa)及 3′-Full
RACE Core Set (Code D314, TaKaRa)说明书扩增
AhSOS2 的 5′末端和 3′末端, 利用 CAP3 软件拼接
ESTs片段, 获得 AhSOS2基因电子拼接序列。
1.5 AhSOS2基因全长序列的获得
以花生叶片提取的 RNA 反转录获得的单链
cDNA为模板, 以参照电子拼接获得的 AhSOS2全长
序列设计的特异性引物 AhSOS21 和 AhSOS22 进行
PCR扩增, 获得 AhSOS2基因的全序列, PCR反应条
件为, 94℃ 3 min; 之后 94℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃
1.5 min、共 35个循环; 最后 72℃ 10 min。将扩增
产物进行测序和 BlastX 比对, 同时比对分析推导出
的氨基酸序列与来源于其他物种的 SOS2 类基因的
相应氨基酸序列。
1.6 实时荧光定量 PCR对基因的表达模式分析
分别提取花生根、茎、叶、花、果针的总 RNA,
利用 cDNA Synthesis Kit试剂盒反转录成单链 cDNA,
根据获得的 AhSOS2 基因全长序列, 设计荧光定量
PCR 特异性引物 Real-R 及 Real-F, 以 Actin 作为内
对照, 反应在 ABI PRISM 7900HT (Applied Biosys-
tems)荧光定量 PCR 仪上进行 , 反应体系为 20 μL,
参考 FastStart Universal SYBR Green Master (Rox)
(13135900 罗氏)说明书, 反应条件为 95℃ 10 min;
95℃ 10 s; 60℃ 20 s; 72℃ 20 s; 40个循环。按照
2–ΔΔCT 法计算基因的相对表达量。用实时荧光定量
PCR 法分析花生 AhSOS2 基因的组织表达模式、盐
胁迫及干旱胁迫下的表达特性。
1.7 AhSOS2植物双元表达载体的构建及转化
1.7.1 植物表达载体的构建 将PCR获得的
AhSOS2基因全长序列 , 与在商业化载体pCAMBIA
1301基础上外源添加CaMV35S启动子及NOS终止子
改造获得的植物表达载体pCAMBIA1301P[23], 分别
用Kpn I和Xba I双酶切, 回收酶切片段, 用T4 DNA
连接酶连接 , 获得重组质粒 , 命名为 pCAMBIA
408 作 物 学 报 第 40卷


1301P-AhSOS2, 并测序验证。
1.7.2 水稻的遗传转化 将构建好的含有目的基
因的植物表达载体pCAMBIA1301P-AhSOS2, 经液
氮冻融法[24]导入根癌农杆菌LBA4404所制备的感受
态细胞中, 通过PCR鉴定阳性克隆。参照刘巧泉等[25]
的方法对水稻中花11愈伤组织进行遗传转化, 经共
培养及抗性筛选, 目前已获得部分转基因水稻, 并
对其功能进行初步分析。
1.8 转基因植株的组织化学染色及 PCR鉴定
1.8.1 GUS组织化学染色 按照Jefferson[26]的方
法进行GUS组织化学染色分析。选取2~3 cm T1代转
基因水稻叶片浸泡在预先配制好的GUS染液里 ,
37℃保温、染色过夜, 之后用75%乙醇脱色至阴性对
照为白色, 于体视显微镜(LEICA S-系列)下观察染
色结果, 照相并记录。
1.8.2 转基因植株的PCR检测 以经GUS组织化
学染色筛选获得的阳性转基因植株为材料 , 利用
CTAB [27]法提取基因组 DNA, 以其为模板 , 以
AhSOS21和AhSOS22为引物进行PCR, 确认转基因
水稻。
1.9 转基因水稻对盐胁迫的耐受性检测
为了测试转基因水稻对盐胁迫的耐受性, 挑取
籽粒饱满的T1代转基因水稻种子, 黑暗下于培养皿
中浸种2~3 d, 之后将萌动的种子移入放有水稻培养
液的纸杯中, 于28℃, 16 h光照, 8 h黑暗条件下培养,
待生长7 d后, 水稻幼苗长至三叶期时分别进行0、
100和250 mmol L–1 NaCl处理, 以相同处理条件下未
转基因的水稻为对照, 对比观察转基因水稻和对照
在盐胁迫条件下的生长状况, 及叶片的持绿性、萎
蔫情况和根生长状况的异同, 并拍照记录。
2 结果与分析
2.1 AhSOS2简并序列的克隆
以花生叶片提取的总 RNA反转录的单链 cDNA
为模板 , 以简并引物 AhSOS2j1 和 AhSOS2j2 对
AhSOS2 的简并区域进行扩增, 获得 PCR 产物长度
为 780 bp, 与预期的大小一致(图 1)。
2.2 AhSOS2基因全长序列的克隆及分析
以所获得的 AhSOS2 简并区序列为模板, 利用
cDNA末端快速克隆技术, 设计 5′ RACE和 3′ RACE
特异性引物 , 参照相应试剂盒说明书分别扩增
AhSOS2 的 5′和 3′末端, 扩增序列经 BlastX 比对验
证。利用 DNAMAN 5.0软件, 获得基因的电子拼接
cDNA 全长序列。参照拼接的基因全长序列设计特
异性引物 , 经 RCR 获得全长为 1462 bp 的基因
AhSOS2 (图 2)。将基因 AhSOS2 的测序结果进行
BlastX比对, 结果与基因电子拼接序列基本一致。

图 1 利用简并引物对 AhSOS2序列的 PCR扩增
Fig. 1 PCR amplification of AhSOS2 with degenerate primers
M: 100 bp DNA分子量; 1~3: AhSOS2在 50℃、52℃和 54℃解链
温度下的 PCR扩增产物。
M: 100 bp DNA ladder marker; 1–3: PCR products of AhSOS2 with
melting temperature (Tm) at 50℃, 52℃, and 54℃.


图 2 AhSOS2的全长序列扩增
Fig. 2 Amplification of full-length cDNA of AhSOS2
M: 2 kb plus DNA marker; 1~4: AhSOS2的 PCR产物。
M: 2 kb plus DNA marker; 1–4: PCR products of AhSOS2.

2.3 基因 AhSOS2的生物信息学分析
将获得的全长为 1462 bp的 AhSOS2的 cDNA序
列经 NCBI (http://ncbi.nlm.ncih.gov/) BlastX分析显
示, AhSOS2 基因包含一个 1341 bp 的开放阅读框,
110 bp的 5′端非翻译区, 及 11 bp的 3′端非翻译区。
利用在线网站 Expasy (http://www.expasy.org/tools/
protparam.html)对 AhSOS2基因进行生物信息学分析,
结果显示, 花生 AhSOS2基因编码 446个氨基酸残基,
分子量为 51 kD, 等电点为 8.68。
同时, 利用在线网站 Expasy (http://web.expasy.
org/cgi-bin/protscale/protscale.pl?1)对该基因氨基酸
序列的亲水性 /疏水性分析 , 由图可看出 (图 3),
AhSOS2编码蛋白的疏水区和亲水区交替出现, 依据
氨基酸分值越低亲水性越强和分值越高疏水性越强
的规律 , 在整个肽链中 , 亲水性氨基酸均匀分布 ,
且多于疏水性氨基酸。因此, 整个多肽链表现为亲
水性, AhSOS2蛋白为亲水性蛋白。
第 3期 张国嘉等: 花生 AhSOS2基因的克隆及功能初探 409


利用 SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)
网站, 对 AhSOS2 蛋白的结构域预测发现, AhSOS2
蛋白在第 11 到 264 氨基酸之间含有一个 S_TKc 保
守结构域, 为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶区(图 4)。采用
在线蛋白质序列信号肽分析工具 Sigalp4.1 对
AhSOS2分析显示(图略), 蛋白 N端无信号肽, 推测
AhSOS2 蛋白属非分泌型蛋白。利用 TMHMM
(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0)工具分
析显示(图略), AhSOS2 无跨膜结构域, 这一特征与
蛋白激酶无跨膜结构域相吻合, 暗示该蛋白在细胞
内不会发生迁移。
花生 AhSOS2 蛋白序列经 Blastp 比对, 获得一
系列同源性较高的蛋白序列, 其中选取注释为 SOS2
类的蛋白序列, 利用 DNAMAN5.0 软件与 AhSOS2
序列进一步比对(图 5)显示 , AhSOS2 与番茄中的
SOS2类蛋白的相似性达到了 76%, 与陆地棉、拟南
芥、芥菜和大豆中相应序列的相似性分别达到了
75%、75%、71%和 50%。

图 3 AhSOS2基因的疏水性/亲水性分析
Fig. 3 Hydrophobicity/hydrophilicity analysis of AhSOS2

图 4 SMART网站对 AhSOS2蛋白结构域预测
Fig. 4 Domain prediction of AhSOS2 by SMART analysis

图 5 花生 AhSOS2编码氨基酸序列与其他物种中 SOS2类基因编码的氨基酸序列的比对分析
Fig. 5 Comparison of amino acid sequences of SOS2 between Arachis hypogasa and some other species
AtSOS2: 拟南芥(Arabidopsis thaliana); GmSOS2: 大豆(Glycine max); GpSOS2b: 陆地棉(Gossypium hirsutum);
BjSOS2: 芥菜(Brassica juncea); SlSOS2: 番茄(Solanum lycopersicum)。
AtSOS2: (Arabidopsis thaliana); GmSOS2: soybean (Glycine max); GpSOS2b: cotton (Gossypium hirsutum);
BjSOS2: mustard (Brassica juncea); SlSOS2: tomato (Solanum lycopersicum).
410 作 物 学 报 第 40卷


同时, 利用MEGA5.2软件对花生 AhSOS2蛋白
进行系统进化树分析(图 6)显示, AhSOS2 与其他物
种的 CIPK 类蛋白激酶 (CBL-interacting protein
kinases)亲缘关系均达到了 75%以上, 其中与大豆和
百脉根中相应蛋白的同源性达到了 85%, 与葡萄、
蓖麻、胡杨中相应蛋白的同源性达到了 80%, 与黄
瓜、毛果杨中相应蛋白的同源性达到了 79%。
2.4 AhSOS2基因的表达特性研究
2.4.1 AhSOS2基因的组织表达模式分析 分别

图 6 AhSOS2的氨基酸序列与其他物种中 CIPK家族氨基酸序
列的系统进化树分析
Fig. 6 Phylogenetic tree analysis of amino acid sequences of
SOS2 between Arachis hypogasa and some other species
SbProtein: 高粱(Sorghum bicolor); ZmCBL-PK: 玉米(Zea mays);
OsOs06g: 水稻(Oryza sativa); HgCBL-PK24: 青稞(Hordeum
vulgare subsp. spontaneum); BpCBL-PK24: 二穗短柄草
(Brachypodium distachyon); AhSOS2: 花生(Arachis hypogaea);
Gm CBL-PK24: 大豆(Glycine max); Lj CBL-PK: 百脉根(Lotus
japonicus); CsCBL-PK: 黄瓜(Cucumis sativus); Md S/T-PK: 苹果
(Malus × domestica); GpSOS2b: 陆地棉(Gossypium hirsutum); At
CBL-PK24: 拟南芥(Arabidopsis thaliana); BjSOS2: 芥菜
(Brassica juncea); Vv CBL-PK: 葡萄(Vitis vinifera); SlCBL-PK24:
番茄(Solanum lycopersicum); Rc-CBL-PK: 蓖麻(Ricinus commu-
nis); PpCBL-PK26: 胡杨(Populuseu phratica); Pt protein: 毛果杨
(Populus trichocarpa)。
SbProtein: Chinese sorghum (Sorghum bicolor); ZmCBL-PK: corn
(Zea mays); OsOs06g: rice (Oryza sativa); HgCBL-PK24: barley
(Hordeum vulgare subsp. spontaneum); BpCBL-PK24: two spike
Brachypodium (Brachypodium distachyon); AhSOS2: peanut (Ara-
chis hypogaea); Gm CBL-PK24: soybean (Glycine max); Lj
CBL-PK: corniculatus (Lotus japonicus); CsCBL-PK: cucumber
(Cucumis sativus); Md S/T-PK: apple (Malus × domestica);
GpSOS2b: cotton (Gossypium hirsutum); At CBL-PK24: Arabidop-
sis (Arabidopsis thaliana); BjSOS2: mustard (Brassica juncea); Vv
CBL-PK: grapes (Vitis vinifera); SlCBL-PK24: tomato (Solanum
lycopersicum); Rc-CBL-PK: castor oil plant (Ricinus communis);
PpCBL-PK26: populus (Populuseu phratica); Pt protein: populus
(Populustri chocarpa).
提取花生鲁花 14的根、茎、叶、花、果针的总 RNA,
利用 cDNA Synthesis Kit (TaKaRa)试剂盒反转录成
单链 cDNA, 根据所获得的 AhSOS2基因全长序列设
计荧光定量特异性引物, 以花生 Actin 作为内对照,
对目的片段进行扩增, 按照 2–ΔΔCT 法计算基因的相
对表达量。结果显示 (图 7), 在正常生长条件下 ,
AhSOS2在花生各组织中均表达, 但在花中表达强度
较高, 表达量约为在其他组织中的 12倍。

图 7 荧光定量 PCR对 AhSOS2基因的组织表达模式分析
Fig. 7 Quantitative real-time PCR analysis of expression
patterns of AhSOS2

2.4.2 盐及干旱胁迫下AhSOS2的表达特性研究
生长15 d的花生幼苗, 按照材料和方法中所述
分别以250 mmol L–1 NaCl和30% PEG-6000进行处理,
之后将植物材料提取RNA并利用cDNA Synthesis
Kit (TaKaRa)试剂盒反转录成单链cDNA, 以之为模
板 , 以花生Actin作为内对照 , 以Real-R和Real-F作
为AhSOS2荧光定量特异性引物对目的片段进行扩
增, 按照2–ΔΔCT法计算基因的相对表达量。
随 250 mmol L–1 NaCl处理时间的延长, AhSOS2
在花生的根、茎、叶中的表达量都有所上调, 但在
茎中表达量变化最明显, NaCl处理 48 h是未处理时
的 30 倍以上; 而在根中, 随着 NaCl 处理时间的延长,
表达量逐渐上调, 在 NaCl处理 48 h后最高, 是未处
理时的 3.5 倍; 而该基因在花生叶中的表达受 NaCl
诱导不是很明显 , 表现先下调再上调的趋势 , 且
NaCl处理 48 h仅比未处理时提高 20% (图 8)。
30% PEG-6000 模拟干旱处理条件下, AhSOS2
在花生的根、茎、叶中表达量都有所上调(图 9), 在
叶中, 经 PEG处理 48 h是未经处理时的 12倍; 在茎
中, 当 PEG 处理 6 h 是未经处理时的 3.5 倍, 而在
PEG处理 12 h表达量又略有下调, 处理 24 h后又恢
复到未处理时的 3.4倍, 且随着处理时间的延长, 该
基因表达水平又有所下调; 而在根中 AhSOS2 基因
对干旱的响应较弱, 经 PEG 处理 12 h 是未处理的
1.7倍左右。结果表明, AhSOS2基因能够对盐及干旱
处理产生响应, 基因表达受胁迫诱导, 暗示 AhSOS2
第 3期 张国嘉等: 花生 AhSOS2基因的克隆及功能初探 411



图 8 荧光定量 PCR对盐胁迫下 AhSOS2表达模式分析
Fig. 8 Quantitative real-time PCR analysis of the expression pattern of AhSOS2 under NaCl treatment
A: 花生的根; B: 茎; C: 叶; 0、3、6、12、24和 48 h: 250 mmol L–1 NaCl对花生的不同处理时间。
A: root; B: stem; L: leaf; 0, 3, 6, 12, 24, and 48 h: treatment time with 250 mmol L–1 NaCl.

图 9 荧光定量 PCR对干旱胁迫下 AhSOS2的表达模式分析
Fig. 9 Quantitative real-time PCR analysis of the expression pattern of AhSOS2 under drought
A: 花生的根; B: 茎; C: 叶; 0、3、6、12、24和 48 h: 30% PEG-6000处理花生的时间。
A: root; B: stem; L: leaf; 0, 3, 6, 12, 24, and 48 h: treatment time with 30% PEG-6000.

在花生抗盐和抗旱过程中具有一定的作用。
2.5 AhSOS2 植物双元表达载体的构建及水稻的
遗传转化
将植物表达载体 pCAMBIA1301P-AhSOS2 转化
大肠杆菌 Trans DH5α, 对重组阳性克隆进行酶切(图
10)及菌液 PCR鉴定(图 11), 证明植物双元表达载体
构建成功(图 12)。
将构建好的植物表达载体 pCAMBIA1301P-
AhSOS2 经液氮冻融法导入根癌农杆菌 LBA4404 感
受态细胞, 经 PCR 菌液鉴定阳性克隆, 对水稻愈伤

图 10 重组质粒 pCAMBIA1301P-AhSOS2的酶切鉴定
Fig. 10 Double digestion of recombinant plasmid of pCAM-
BIA1301P-AhSOS2
M: DNA marker DL5000; 1~2: 重组质粒
pCAMBIA1301P-AhSOS2的 Kpn I和 Xba I双酶切检测。
M: DNA marker DL5000; 1–2: double digestion of recombinant
plasmid pCAMBIA1301P-AhSOS2 by Kpn I and Xba I.
组织进行遗传转化, 目前已获得转基因水稻苗, 并
对其功能进行初步分析。
2.6 转基因植株的组织化学染色及 PCR鉴定
T1代转基因水稻植株GUS组织化学染色显示, 阴
性对照的叶片中未观察到显示GUS活力的蓝色(图 13),
仅在转基因水稻叶片中观察到有代表 GUS 活性的蓝
色。PCR检测结果(图 14)显示, 经 GUS组织化学染色
的阳性转基因水稻中大部分扩增出了与目的基因片段
大小一致的特异性条带, 均为阳性植株, 未转基因的
野生型水稻叶片中没有扩增出此特异条带。

图 11 重组质粒 pCAMBIA1301P-AhSOS2的菌液 PCR检测
Fig. 11 PCR identification of recombinant plasmid of pCAM-
BIA1301P-AhSOS2
M: trans5K plus DNA marker; (+): 阳性对照; (–): 阴性对照; 1~4:
转化成功的重组质粒。
M: trans5K plus DNA marker; (+): positive control; (–): negative
control; 1–4: The recombinant plasmid of pCAM-
BIA1301P-AhSOS2.
412 作 物 学 报 第 40卷



图 12 植物表达载体 pCAMBIA1301P-AhSOS2的质粒图谱
Fig. 12 Plasmid map of expression vector pCAMBIA1301P-AhSOS2


图 13 转基因水稻叶片的 GUS组织染色
Fig. 13 GUS staining of leaf of transgenic rice
CK: 对照; T1: 转基因水稻叶片。
CK: control; T1: leaf of transgenic rice.

2.7 转基因水稻对高盐的耐受性分析
长至三叶期的转基因水稻 T1代株系, 经不同浓
度的 NaCl处理 3 d 后, 与对照水稻相比, 其盐胁迫
的抗性及耐性均提高。如图 15所示, 无论转 AhSOS2
基因的水稻还是对照水稻, 在盐胁迫下, 随着 NaCl
处理浓度的提高, 植株生长均受到不同程度的损伤,
但总体来说, 转基因株系在不同 NaCl浓度下的长势
均优于对照植株。其中在 250 mmol L–1 NaCl处理下,
这种长势差异最为明显, 经 250 mmol L–1 NaCl处理
3 d后, 对照株系叶片黄化和萎蔫程度都很严重, 茎
杆因脱水严重而变细、抗倒伏能力降低, 且根部生
长受抑制; 而转基因水稻叶片在短时间高盐处理下
仅出现轻微的黄化和萎蔫, 茎部相对粗壮、抗倒伏
能力较好 , 虽然根部生长也受到一定程度的抑制 ,
但整体生长状态较好。

图 14 转基因株系的 PCR鉴定
Fig. 14 PCR identification of transgenic lines
M: 2 kb plus DNA marker; 1~15: 转基因株系; (+): 阳性对照; (–): 阴性对照。
M: 2 kb plus DNA marker; 1–15: transgenic lines; (+): positive control; (–): negative control.
第 3期 张国嘉等: 花生 AhSOS2基因的克隆及功能初探 413



图 15 转基因水稻株系耐盐性鉴定
Fig. 15 Salt-tolerance identification of transgenic rice
CK: 盐胁迫处理 3 d后的对照水稻, 从左至右分别为 0、100和
250 mmol L–1 NaCl处理; T1: 盐胁迫处理 3 d后的转 AhSOS2基
因水稻, 从左至右分别为 0、100和 250 mmol L–1 NaCl处理。
CK: The phenotypes of wild-type rice after salt treatment for three
days. From left to right: 0, 100, and 250 mmol L–1 NaCl treatment;
T1: The phenotypes of transgenic rice after salt treatment for three
days. From left to right: 0, 100, and 250 mmol L–1 NaCl treatment.

3 讨论
盐害和干旱胁迫严重影响作物的产量和品质。
植物耐逆性研究不仅对作物遗传改良有重要意义 ,
还有助于人们理解诸如基因调控、信号传导、离子
转运和矿质营养等生物学机制, 也是植物基础生物
学研究的一个重要组成部分[28]。盐胁迫可破坏细胞
的正常离子分布和动态平衡, 干扰代谢过程及产生
大量的活性氧, 引起细胞膜脂过氧化和蛋白质破坏,
甚至植物死亡[29]。干旱胁迫可使植物生物膜结构与
功能受到影响, 并引起叶绿素、核酸和蛋白质等大
分子损伤, 进而导致一系列生理生化过程的改变及
光合器官活性下降[30]。已知SOS信号途径在植物耐
盐及抗逆过程中发挥重要作用。SOS途径成员SOS1
基因位于细胞质膜上, 编码Na+/H+逆向转运蛋白[31]。
SOS2基因编码丝氨酸 /苏氨酸蛋白激酶 , 包含C-端
调控区和N-端催化区[9]。SOS3基因包含一个N-豆蔻
酰化结构域, 是植物实现耐盐性所必需的[32]。目前,
对拟南芥中SOS信号途径的研究比较清楚 , Chin-
nusamy等[29]报道, 盐胁迫导致拟南芥体内Ca2+信号
的产生及传递, 相关信号进一步激活编码Ca2+结合
蛋白的SOS3, 从而SOS3与蛋白激酶SOS2一起 , 参
与调控细胞质膜Na+/H+逆向转运蛋白SOS1以及其他
通道蛋白, 从而对细胞内Na+的外排及细胞内外K+、
Na+的均衡起调控作用。而SOS2和SOS3突变体植株,
由于SOS信号途径缺失, 导致细胞内Na+的外排及细
胞内外K+、Na+平衡受到影响, 从而造成突变体植株
生长异常[33-34]。SOS类基因家族各成员在植物中的
表达具有一定的组织特异性, 且其表达调控具有一
定的复杂性, 说明该家族基因可能参与多种信号途
径, 并在维持细胞稳态、活性氧的清除和生长调节
等方面发挥重要的作用。
花生(Arachis hypogaea L.)作为重要的油料作物,
其品质及产量对国民经济的发展具有重要影响。然
而由于花生是异源四倍体, 基因组庞大, 目前尚无
完整的花生基因组序列信息。为深入研究花生在盐
害、干旱等胁迫条件下的生长、响应及防御机制, 我
们参考其他物种中SOS2的基因序列, 通过设计简并
引物结合RACE的方法, 从花生中分离到了SOS2基
因, 命名为AhSOS2。全长1462 bp, 包含一个1341 bp
的开放阅读框、110 bp的5′端非翻译区及11 bp的3′
端非翻译区。这与拟南芥[9]、苹果[16]、水稻[35]中已
知SOS2基因的结构特征相似。基因所编码的蛋白序
列经多重比对显示, 花生AhSOS2和大豆、番茄、拟
南芥、芥菜、陆地棉等植物中的SOS2类成员亲缘关
系较近, 同源性在70%以上, 显示AhSOS2属于SOS2
基因家族 , 推测AhSOS2与拟南芥 [36-37]等植物中已
报道的SOS2可能具有相似的生物学功能, 且在植物
响应干旱、高盐、渗透胁迫等多种信号途径中发挥
作用。
利用在线网站 Expasy (http://www.expasy.org/
tools/protparam.html)对AhSOS2基因进行生物信息学
分析显示, 花生AhSOS2基因所编码氨基酸序列的第
11到第264位之间存在一个S_TKc保守结构域, 为丝
氨酸/苏氨酸蛋白激酶区特征结构, 其N-端催化区与
酵母SNF1 (sucrose nonfermenting l)及哺乳动物蛋白
激酶AMPK (adenosine 5’-monophosphate-activated
protein kinase)相似, C-端为调控区。蛋白质的磷酸化
和去磷酸化过程在植物对逆境信号的识别及信号在
植物体内的转导中起重要作用, 并普遍存在于如光
合作用、细胞的生长发育、基因表达、甚至癌变等
生命活动中[38-39]。
AhSOS2的氨基酸序列与其他植物 SOS2类基因
编码的氨基酸序列的系统进化树分析显示, 其与蛋
白激酶 CIPK (CBL-interacting protein kinase)具有相
似的保守结构域。以往研究报道, 蛋白激酶 CIPK及
SOS2 均属蔗糖非酵解型相关蛋白激酶 3 (SNF1-
related protein kinase 3, SnRK3)亚家族 [40]。已知
SnRK 家族是广泛存在于植物中的一类丝氨酸/苏氨
414 作 物 学 报 第 40卷


酸蛋白激酶, 家族成员可不同程度地参与胁迫响应
过程[38-39, 41], 尤其在盐胁迫(包括离子、氧化及渗透
胁迫)响应等方面发挥作用[40-41], 在植物的抗逆生理
研究中具有非常重要的作用。推测 AhSOS2 作为
SnRK 家族的一员, 在抗盐及胁迫响应方面也具有
相似的生物学功能。同时 , 结构域预测显示 , Ah-
SOS2蛋白质序列N-端无信号肽, 无跨膜结构域, 暗
示 AhSOS2是非分泌型蛋白, 在细胞内不易迁移。
用荧光定量PCR的方法研究AhSOS2基因的组织
表达特性显示, 正常生长条件下, AhSOS2基因在花
生中为组成型表达, 且在花中表达丰度最高, 是在
根、茎、叶、果针等组织中表达的12倍。鉴于表达
部位与生物学功能的相关性, 推测花生AhSOS2基因
可能在调节花的发生和发育过程中发挥一定作用。
诱导表达模式分析显示, 基因AhSOS2的表达受盐胁
迫及干旱的诱导, 在250 mmol L–1 NaCl处理条件下,
随处理时间的延长, AhSOS2基因在花生的根、茎、
叶中表达量都有所上调, 尤以茎中明显增强, 约是
未经处理时的30倍。这一现象与以往报道的高盐胁
迫使胞质中游离Ca2+浓度快速上升 [44-45], 而Ca2+信
使通过信号传递网络, 从而调控AhSOS2基因参与高
盐胁迫应答过程的结果相似[21]。而在30% PEG-6000
模拟干旱处理条件下, 基因在花生幼苗叶中表达量
升高幅度最大, 约是未经处理时的12倍, 在根和茎
中表达量也有不同程度的上调。综合以上结果, 可
以推断, AhSOS2基因通过响应盐及干旱胁迫, 进一
步参与相关信号转导途径, 在花生抗盐、抗旱及其
他抗逆过程中发挥作用。
利用植物基因工程技术可以明显加快抗逆植物
新品种的培育进程。Hu 等证明, 当 NaCl 浓度升高
到 150 mmol L–1和 200 mmol L–1时, 与对照和 SOS2
突变体相比, MdSOS2转基因株系表现出很高的耐盐
性[16]。Zhu等[46]对培养 5 d的野生型拟南芥和 SOS2
突变体拟南芥进行 50 mmol L–1和 100 mmol L–1 NaCl
处理, 发现高盐抑制了植物的根部和地上部分的生
长。本研究中, 鉴于花生的遗传转化周期较长、体
系有待进一步完善, 目前已将基因 AhSOS2 转化入
模式植物水稻中, 并已获得转基因植株。对筛选获
得的 T1代转 AhSOS2 基因的水稻株系耐盐能力初步
分析显示, 该基因在水稻中的过表达可在一定程度
上增强并提高受体材料对盐胁迫的抗性及耐受性。
在此基础上, 我们拟对基因的生物学功能做进一步
验证, 以期为作物的抗逆性研究及抗性育种提供新
思路和候选基因。同时, 从蛋白水平上对基因编码
产物的结构、活性及生物学功能研究正在进行, 希
望为 SOS2 基因及其家族成员参与植物抗逆及相关
机理提供更多的理论证据。
4 结论
从花生中克隆了基因 AhSOS2, 它与番茄等物种
中 SOS2 类基因序列相近, 为 SOS2 类基因家族成
员。正常生长条件下 AhSOS2 基因为组成型表达。
250 mmol L–1 NaCl和 30% PEG-6000模拟干旱均可
诱导 AhSOS2基因的表达, 暗示花生 AhSOS2基因在
植物胁迫响应及抗逆过程中发挥重要的作用, 过表
达 AhSOS2 基因的转基因水稻增强了对盐的耐受性,
可作为候选基因进一步应用于农业生产。
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