全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(7): 1285−1289 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

基金项目: 国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2006AA10A115); 国家自然科学基金项目(30771361); 山东省农科院创新基金项目(2006YCX-012)
作者简介: 刘峰(1981−), 男, 山东青岛人, 硕士研究生。E-mail: jiafeng2002@sina.com
*
通讯作者(Corresponding author): 单世华(1971–), 男, 博士, 研究员。Tel: 0532-87629307; E-mail: shhshan@gmail.com
Received(收稿日期): 2007-09-29; Accepted(接受日期): 2007-12-06.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.01285
农杆菌介导轮状病毒抗原蛋白 VP4基因遗传转化花生的研究
刘 峰 1, 2, 3 万书波 1 毕玉平 2 闫彩霞 1 李春娟 1 赵晋平 2 单世华 1,*
(1 山东省花生研究所, 山东青岛 266100; 2 山东省农业科学院高新技术研究中心, 山东济南 250100; 3 中国科学院海洋研究所, 山东
青岛 266071)
摘 要: 选用鲁花 14 与花育 23 花生品种, 通过农杆菌介导开展了轮状病毒抗原蛋白 VP4 基因遗传转化研究, 从转
化植株中随机选取 26株表现 Kan抗性植株进行 npt II基因的 PCR检测, 结果有 22株能扩增出 620 bp左右的 npt II
基因条带, 阳性率约为 84.62%。提取 npt II基因显示为阳性的植株叶片 DNA作模板, 用 VP4基因特异引物进行 PCR
扩增, 经琼脂糖凝胶电泳分析, 所有 npt II基因阳性的植株均扩增出了约 2 350 bp的特异性条带, 而野生型没有。对
部分转基因植株进一步进行 PCR-Southern 杂交和 Southern 杂交分析, 发现转基因植株中出现了阳性杂交信号, 表明
VP4基因的确已经整合到花生的基因组中, 并且是 1~2个拷贝。用 RT-PCR分析了 11株转 G1VP4基因的植株, 证明
插入鲁花 14中的 VP4基因已经正常转录, 利用Western blot方法检测筛选到的 4株转基因花生, 分别提取其蛋白, 在
30 kD处出现特异性蛋白条带, 这为获得转基因创新种质材料奠定了基础。
关键词: 花生; 子叶; 遗传转化; VP4基因
Transgenetic Research of Antigen VP4 Gene into Peanut (Arachis hypo-
gaea L.) via Agrobacterium tumefaciens
LIU Feng1,2,3, WAN Shu-Bo1, BI Yu-Ping2, YAN Cai-Xia1, LI Chun-Juan1, Zhao Jin-Ping2, and
SHAN Shi-Hua1,*
(1 Shandong Peanut Research Institute, Qingdao 266100, Shandong; 2 High-Tech Research Center, Shandong Academy of Agricultural Sciences,
Ji’nan 250100, Shandong; 3 Marine Biological Culture Collection, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, Shan-
dong, China)
Abstract: Peanut (Arachis hypogaea L.) is an important commercial crop worldwide and provides an excellent source of protein
and other nutrients. So it is one of the ideal vectors in oral vaccine of transgenic plant. The Agrobacterium strain LBA4404 har-
boring the binary vector pBI121 was used for transformation. The plasmid carries genes for VP4 (2 350 bp) of the human rotavi-
rus (HRV) driven by CaMV 35S promoter and neomycin phosphotransferase (npt II). Two peanut cultivars were used as source of
cotyledon explants in this experiment. Efficient transformation of cotyledons by A. tumefaciens strain LBA4404 carrying nptII
and VP4 gene on binary vectors led to the production of a large percentage of transgenic plants. Transformed individuals were
obtained through selection on medium containing 125 mg L−1 Kan. Integration of the transgenes was assessed by PCR amplifica-
tion and Southern blot hybridizations. Taking pBG1VP4 or pBG1VP4 plasmid as positive control, non-transformed peanut as
negative control, 22 plants among 26 plants grown up through selection on medium containing 125 mg L−1 Kan were assessed by
PCR amplification of 620 bp fragment of npt II gene. Then all of 22 plants were assessed by PCR amplification of 2 350 bp frag-
ment of VP4 gene. Taking VP4 gene with α-32P-dCTP maker as probe, five plants selected randomly from 22 positive plants
were analysed by PCR-Southern blot hybridizations and showed DNA bloting bands. Then the genomic DNA of 4 plants chosen
from PCR-Southern positive plants was further analyzed with Southern blot hybridizations and showed correspondent DNA blot-
ting bands. The results showed that the foreign gene was integrated into genome of transformated peanuts. The total RNA from 11
plants of Luhua 14 was assessed by RT-PCR analysis and evidenced the expression of G1VP4 gene. In addition, expression of
critical protein in 30 kD was assayed with Western-blot method. An edible vaccine based on the VP4 of human rotavirus (HRV)
could provide a means to protect children from severe acute diarrhea, enabling intact antigen to reach the gut associated lymphoid
tissue, as the rigid walls of the plant cell protect antigenic proteins from the acidic environment of stomach. Elevated expression
1286 作 物 学 报 第 34卷

of the rotavirus VP4 antigen in transgenic peanuts is a critical factor in the development of a safe and effective rotavirus vaccine.
Keywords: Peanut; Cotyledon; Genetic transformation; VP4 gene
花生(Arachis hypoaea L.)是世界范围内的一种重要
的油料作物 [1-2], 含有丰富的蛋白质和其他营养物质, 其
蛋白质含量可达 25%[7]。同时花生贮藏期长, 且生产规模
不受限制, 因此是生产口服基因工程疫苗的理想载体。
人源轮状病毒(human rotavirus, HRV)是世界范围内
引起婴幼儿传染性重症腹泻的主要病原 [4], 在发展中国
家尤为突出, 全世界每年约发病 100 亿人次, 导致 60 多
万儿童死亡。统计表明, 发达国家和发展中国家 90%以上
的 3岁以下儿童均感染过 HRV。对于 HRV引起的腹泻至
今尚无特效药, 发展疫苗控制 HRV 腹泻受到世界各国一
致的重视。尽管人们在探索生产婴幼儿腹泻轮状病毒疫苗
方面已做了许多工作, 并相继研制出第一代口服弱毒活
疫苗和第二代多价重配体疫苗, 但在临床使用中存在安
全性差、效果不稳定和生产成本较高诸多问题, 未能在全
球推广使用。因此, 完全有必要探索轮状病毒疫苗生产的
新途径。
VP4 蛋白是人源轮状病毒的外衣壳蛋白, 也是重要
的抗原蛋白, 因此利用花生基因工程技术将 VP4 基因转
入花生栽培种 , 可在花生中表达轮状病毒的重组蛋白 ,
进而生产预防轮状病毒感染的口服疫苗[5-6]。
花生组织培养, 国外从 20 世纪 40 年代, 我国从 20
世纪 70 年代开始研究, 已在花生营养和生殖器官建立了多
种再生体系[7]。高效植株再生体系的建立是植物基因工程的
关键环节之一。农杆菌介导的外源基因遗传转化是花生遗传
转化的重要手段[4-5], 已有较多成功的例子[3,8-15]。本实验所
建立完善的花生子叶再生体系是一个高效的花生遗传转化
系统, 已有取得转基因植株的报道, 通过转化条件的优化,
子叶已成为获得转基因花生植株的理想受体[3,16], 这一研究
可为进一步开展成品口服疫苗的研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 植物材料与菌株
花生(Arachis hypogaea L.)品种鲁花 14和花育 23, 由
山东省花生研究所提供。农杆菌菌株为 LBA 4404, 质粒
为双价表达载体 pBI121, 含 35S CaMV 启动子连接的人
源轮状病毒抗原蛋白 VP4基因(2 350 bp), 和新霉素磷酸
转移酶 npt II 基因, 即以卡那霉素(Kan)抗性基因作为抗
性筛选基因, 由中国农业科学院生物技术中心徐妙云博
士提供。
1.2 引物(由上海生工生物工程有限公司合成)
本实验分离得到的 VP4基因来自 A组人源轮状病毒
G1 型和 G2 型, 分别命名为 G1VP4 和 G2VP4, 根据它们
的序列, 设计通用引物。Primer 1为 5′- ACA ATG GCT
TCA CTC ATT TAT A-3′, Primer 2为 5′-CAC ATC CTC
AAT AGC GTT CTC AC-3′。
新霉素磷酸转移酶基因(nptⅡ)扩增引物, Primer 1′为
5′-TAG TCG GCT ATG ACT GGG CA-3′, Primer 2′为
5′-GCC AAC GCT ATG TCC TGA T-3′。
1.3 培养基类型
子叶诱导分化培养基(MSC1) 为 MS+6-BA 5.00 mg
L−1+2,4-D 1.50 mg L−1, 芽 伸 长 培 养 基 (MSC2) 为
MS+6-BA 0.50 mg L−1, 生根培养基(MSC3) 为 MS+NAA
2.00 mg L−1, pH 5.7~5.8。
1.4 实验方法
1.4.1 以子叶为外植体的遗传转化体系 (1)挑选成熟
花生种子, 用 70%酒精处理 1 min, 0.1%升汞(W/V)处理 10
min, 无菌水冲洗 4~6遍, 最后在无菌水中浸泡 2 h。剥去
种皮 , 延纵向分开 , 用解剖刀切去胚及与子叶相连的胚
轴处, 切成“V”型。(2)用加有 1 mL烟草提取物的 50 mL
农杆菌液(OD600 为 0.5~0.7)侵染子叶外植体 10 min, 于
MSC1固体培养基中暗培养 3 d后将外植体取出, 用含头
孢霉素(Cef) 250 mg L−1、羧苄青霉素(Carb) 250~500 mg
L−1的无菌水冲洗 4~5遍后, 接种至含 Cef 250 mg L−1、
Carb 250~500 mg L−1 的诱导分化培养基(MSC1)上 , 在
25 ±1℃ ℃、3 000~4 000 μmol m−2 s−1光强, 16 h光照条件
下选择培养 14 d。(3)转接到含 Cef 250 mg L−1、Carb
250~500 mg L−1、Kan 125 mg L−1 的诱导分化培养基
(MSC1)上继续培养, 每 14 d更换一次新鲜培养基。(4)当
有绿色芽点形成后 , 接种到含 Cef 250 mg L−1、Carb
250~500 mg L−1、Kan 125 mg L−1的芽伸长培养基(MSC2)
上促进芽分化及伸长。(5)当芽 3~4 片小叶时, 将其切下,
转接到含 Cef 250 mg L−1、Carb 250~500 mg L−1、Kan 25
mg L−1的生根培养基(MSC3)诱导生根, 约 2 周后根开始
形成。(6)将根系健壮的小植株移栽到经高温灭菌过的蛭
石中, 于室内光照条件下培养 2~3 周后, 然后移至温室,
土壤为灭菌的大田土。每个月用 Hoagland营养液浇一次,
定期用自来水浇灌。
1.4.2 植物表达载体的分子鉴定 农杆菌质粒 DNA
采用王友如的方法[17]提取, 用 BamH I+Sac I 双酶切, 同
时对质粒 DNA进行 PCR鉴定, 反应体系为 50 μL, 反应
程序为 94℃预变性 5 min, 94℃变性 55 s, 57℃退火 45 s,
72℃延伸 1 min, 30循环后, 72℃延伸 10 min, 4℃保存。最
后用 1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.4.3 转基因植株的分子检测
1.4.3.1 PCR 检测 再生花生植株基因组 DNA 采用
CTAB 法[18]提取, 扩增 npt II 基因和 VP4 基因的 PCR 体
系均为 50 μL, 反应程序分别为 94℃预变性 5 min, 94℃变
性 50 s, 55℃退火 45 s, 72℃延伸 1 min, 30循环后, 72℃延
伸 10 min, 4℃保存; 94℃ 5 min, 94 55 s, 57 50 s, 72 ℃ ℃ ℃
1 min, 30循环后, 72℃延伸 10 min, 4℃保存。
第 7期 刘 峰等: 农杆菌介导轮状病毒抗原蛋白 VP4基因遗传转化花生的研究 1287


1.4.3.2 PCR-Southern 和 Southern 检测 植物基因组
DNA 经 BamH I 酶切和 0.8%琼脂糖凝胶电泳后, 按照
Shambrook 方法[19]转移至尼龙膜上, 以α-32P-dCTP 标记
的 VP4 基因片段作探针, 按照 Shambrook 方法[19]进行
Southern杂交。PCR-Southern杂交转膜后方法同 Southern
杂交。
1.4.3.3 RT-PCR 检测 利用异硫氰酸胍法提取花生总
RNA, 利用 TaKaRa的 RNA PCR Kit (AMV)Ver2.1进行反
转录反应, 20 μL体系反应, 按以下程序进行反转录, 42 ℃
30 min, 99 5 min, 5 5 min℃ ℃ 。以反转录产物为模板, 100
μL PCR体系, 经 94 2 min; 94 30 s, 60 30 s, ℃ ℃ ℃ 延伸
72 1.5 min, 30℃ 个循环; 保温 72 10 min℃ 。用 1%的琼脂
糖凝胶电泳检测基因扩增情况。
1.4.4 转基因植株的蛋白检测 取各转基因植株的叶
片 1 g, 加 1 mL 1×PBS充分研磨; 取 250 μL上清液加 250
μL 2×SDS上样缓冲液, 100℃煮沸 5 min; 离心, 取 50 μL
上清液进行 12% SDS-PAGE 电泳 ; 电泳结束后参照
Shambrook方法[19]转膜及杂交。
1.4.5 所使用溶液的配制 1×PBS: 130 mmol L−1 NaCl,
10 mmol L−1 NaH2PO4, 10 mmol L−1 Na2HPO4 (pH 7.2)。转
移缓冲液: 25 mmol L−1 Tris-Cl (pH 8.3), 192 mmol L−1 甘
氨酸, 20%(V/V)甲醇, 0.037%(W/V) SDS。TBS: 20 mmol
L−1 Tris-Cl (pH 7.5), 150 mmol L−1 NaCl。膜封闭缓冲液:
TBS 含 3%(W/V) BSA。抗体封闭液: TBS 含 3% (W/V)
BSA。TBST缓冲液: TBS含 0.05 %(V/V) Tween-20。AP
buffer(碱性磷酸酶缓冲液): 0.1 mol L−1 NaCl, 5 mmol L−1
MgCl2, 100 mmol L−1 Tris-Cl (pH 9.5)。放于一密闭容器中,
储存于室温。BCIP/NBT显色液: 10 mL AP buffer, 33 μL
BCIP, 66 μL, NBT, 现配, 在 30 min之内使用。
2 结果与分析
2.1 植物表达载体的分子鉴定
本研究采用改良的农杆菌质粒 DNA 提取方法 [17],
提高了质粒 DNA 的得率, 提取的 DNA 可直接应用于酶
切和 PCR分析。从农杆菌 LBA4404中提取质粒 DNA进
行酶切和 PCR 分析, 表明植物表达载体已转入农杆菌中,
表达载体上分别含有目的基因 G1VP4 和 G2VP4, 可以用
于花生的遗传转化(图 1和图 2)。
2.2 花生抗性植株的分子检测
花生对卡那霉素 Kan 的抗性存在个体差异, 因而具
有卡那霉素抗性的植株未必就是转基因植株, 所以需要
在分子水平进一步验证。
2.2.1 PCR鉴定 随机选取 26株表现Kan抗性的花生
植株进行 npt II基因的 PCR检测, 结果有 22株能扩增出
620 bp左右的 npt II基因条带, 阳性率约为 84.62%, 图 3
是部分鲁花 14转基因植株 npt II基因 PCR扩增的结果。
以 npt II基因 PCR显示为阳性的植株基因组 DNA作
模板, 用 VP4基因特异引物进行 PCR扩增, 经 1%的琼脂

图 1 农杆菌质粒 DNA的 PCR检测
Fig. 1 PCR analysis of plasmid DNA
1, 2: pBG1VP4 质粒; 3, 4: pBG2VP4 质粒; M: λDNA/Hind III+
EcoR I marker。
1, 2: pBG1VP4; 3, 4: pBG2VP4; M: λDNA/Hind III+EcoR I marker.

图 2 质粒酶切检测
Fig. 2 Analysis of restriction enzymes cutting products
1, 3: 分别是 pBG1VP4和 pBG2VP4质粒的 BamH I+Sac I双酶切; 2, 4:
分别是 pBG1VP4和 pBG2VP4质粒;M: λDNA/Hind III+EcoR I marker。
1, 3: pBG1VP4 and pBG2VP4 digested with BamH I and Sac I respec-
tively; 2, 4: pBG1VP4 and pBG2VP4, respectively;
M: λDNA/Hind III+Eco R I marker.

图 3 部分转 VP4基因花生植株的 npt II PCR检测
Fig. 3 PCR analysis of some transgenic peanut genome
1: 阴性对照,模板为野生型植株 DNA; 6: 阳性对照,模板为 pBGVP4
DNA; 2~5, 8~10: 抗 Kan的转基因植株;
7, 11: 抗 Kan的阴性植株; M: DL 2000 marker。
1: negative control, DNA of wild type plants as template; 6: positive control,
pBGVP4 DNA as template; 2–5, 8–10: different transgenic plants;
7, 11: non-transgenic plants; M: DL 2000 marker.

糖凝胶电泳分析, 转基因植株均扩增出约 2 350 bp的特异
性条带(图 4 和图 5), 而野生型没有, 初步证明 VP4 基因
已整合到花生基因组中。
2.2.2 PCR-Southern 检测和 Southern 分析 用
α-32P-dCTP 标记的 VP4 基因特异探针对 5 株 npt II 基因
PCR 显示为阳性的植株进行基因组 PCR-Southern 杂交
检测, 结果显示外源基因已经整合进入花生基因组(图 6),
但外源基因的整合的拷贝数和是否转录表达还需要进一步
检测。
1288 作 物 学 报 第 34卷


图 4 部分转 G1VP4基因花生植株的 PCR检测
Fig. 4 PCR analysis of some transgenic peanut genome
1~5: 不同的转基因株系(1~4为鲁花 14, 5为花育 23); 6: 阴性对照,
模板为野生型植株 DNA;
7: 阳性对照, 模板为 pBG1VP4 DNA; M: DL 2000 marker。
1–5: different transgenic plants (1–4: Luhua 14; 5: Huayu23 ); 6: nega-
tive control, DNA of wild type plants as template;
7: positive control, pBG1VP4 DNA as template; M: DL 2000 marker.

图 5 部分转 G2VP4基因花生植株的 PCR检测
Fig. 5 PCR analysis of some transgenic peanut genome
1~8: 不同的转基因株系(1~3为鲁花 14, 4~8为花育 23); 9: 阴性对照,
模板为野生型植株 DNA;10:阳性对照,
模板为 pBG2VP4 DNA; M: DL 2000 marker。
1–8: different transgenic plants(1–3: Luhua 14; 4–8: Huayu 23);
9: negative control, DNA of wild type plants as template; 10: positive
control, pBG2VP4 DNA as template; M: DL 2000 marker.

图 6 部分转 VP4基因花生植株的 PCR-Southern检测
Fig. 6 PCR-Southern analysis of transgenic peanut plants
1: 阳性对照,模板为 pBGVP4 DNA; 2~6: 不同的转基因植株;
7: 阴性对照, 模板为野生型植株 DNA。
1: positive control, pBGVP4 DNA as template; 2–6: different transgenic
plants; 7: negative control, DNA of wild type plants as template.

对 npt II基因 PCR显示为阳性转基因株系进一步进
行 Southern 杂交分析, 用 BamH I 酶切基因组 DNA, 用
VP4基因的特异探针进行 Southern杂交, 结果发现 4株转
基因植株中出现了阳性杂交信号, 这表明 VP4 基因的确
已经整合到花生的基因组中, 并且是有 3 株系是单拷贝,
一个株系是双拷贝(如图 7)。
2.2.3 RT-PCR 分析 利用异硫氰酸胍法提取转 VP4
基因花生植株总 RNA, 琼脂糖凝胶电泳检测显示提取的
RNA情况良好(如图 8)。用 RT-PCR分析鲁花 14的 11株
转基因植株中 VP4 基因的表达情况, 结果表明插入鲁花
14中的 VP4基因已经正常转录(如图 9)。

图 7 部分转 VP4基因花生植株的 Southern blotting检测
Fig. 7 Southern blotting analysis of transgenic peanut plants
1~4: 转基因花生植株的基因组DNA分别用BamH I酶切后, 转膜杂交。
1–4: Genome DNA of transgenic peanut plants degested with BamH I
respectively.

图 8 部分转 VP4基因花生植株总 RNA
Fig. 8 The total RNA from transgenic peanut plants
1~8: 转 G1VP4基因的植株总 RNA。
1–8: total RNA extracted from G1VP4 transgenic plants.

图 9 转 G1VP4基因的鲁花 14花生植株的 RT-PCR检测
Fig. 9 RT-PCR analysis of transgenic peanut plants of Luhua 14
1~11:转 G1VP4基因的植株; M: DL 2000 marker ; 12:阴性对照。
1–11: different transgenic plants; M: DL 2000 marker; 12: negative control.

2.3 转基因植株的 Western印迹检测
挑选出部分转基因花生植株, 提取蛋白进行 Western
blot检测。结果显示转基因花生在 30 kD处出现一条野生
型花生没有的特异性免疫条带(图 10), 表明 VP4 基因已经
在转基因花生中成功表达。

图 10 部分转基因花生植株的 Western blot分析
Fig. 10 Western blot analysis of the partial transgenic peanut plants
1: 野生型花生的叶片; 2~5: VP4转化花生植株的叶片。
Lane 1: protein from wild type plants leaves; lanes 2–5: protein from
transgenic peanut plants leaves.
第 7期 刘 峰等: 农杆菌介导轮状病毒抗原蛋白 VP4基因遗传转化花生的研究 1289


3 讨论
植物疫苗的最初研究主要是利用烟草、马铃薯等为
对象, 1990 年 Curtiss 等首次报道了在烟草中表达链球菌
(Streptococcus)抗原蛋白 SpaA, 1997年 Tacket等[20]第一次
临床试验证明了转植物疫苗在抵抗传染性疾病方面的巨
大潜能。从实用角度出发, 已经开始用水稻、花生、玉米、
大豆等种子的可食部位进行研究。在这些植物种子的胚乳
部分, 疫苗基因得到高度表达和稳定的蓄积。
利用植物作为轮状病毒抗原蛋白的表达和递送的载
体已成为当今生物技术研究的热点之一。Matsumura等[21]
报道了转基因马铃薯中牛 A 组轮状病毒 (GAR)免疫原
VP6蛋白的生产。在转基因马铃薯中可检测到 GAR抗原。
用 PCR 和 RT-PCR方法检测了 VP6 基因的存在和其转录
产物。Yu 等[22]报道了转基因马铃薯中轮状病毒衣壳蛋白
VP6 的表达以及它在鼠中的口服免疫性。Chung 等[23]报
道了悬浮培养的转基因番茄细胞中含有重组轮状病毒
VP6蛋白产物。Wu等[24]指出, 转基因马铃薯表达轮状病
毒 VP7 蛋白的口服免疫鼠中, 诱导出高滴度的黏膜中和
IgA抗体。国内陈红岩等[25]首次以花生半胚作为外植体获
得转乙肝病毒表面抗原基因的植株 , 经 PCR、PCR-
Southern 杂交和 Southern 杂交检测证实目的基因已整合
到花生基因组中 , ELISA 检测证实了在花生中表达的
HBsAg 具有较好的活性, 转基因花生植株初提重组蛋白
经 HPLC 纯化、浓缩后注射初免一次的小鼠有明显的特
异性抗体产生, 表明转基因花生疫苗可以加强口服免疫。
鉴于以上前人的研究, 以花生为生物反应器开展口
服疫苗研制是完全可行的。本研究利用花生基因工程表达
系统生产轮状病毒口服疫苗的前期产物重组抗原蛋白
VP4, 为将来进一步研制抗病毒口服疫苗奠定基础, 具有
较高的实践价值和研究价值。这不仅使婴幼儿免受 HRV
腹泻的危害 , 降低患者的死亡率和治病费用 , 还可以为
我国在利用植物生物反应器生产人体疫苗方面积累宝贵
的经验。
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