全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2010, 36(3): 410421 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2006AA10Z156), 现代农业产业技术体系建设专项, 国家自然科学基金项目(30900907)和广
东省自然科学基金项目(07117967)资助。
*
通讯作者(Corresponding author): 梁炫强, E-mail: liang804@yahoo.com; Tel: 020-87597315
第一作者联系方式: E-mail: hongyanbin1979@yahoo.com.cn; Tel: 020-87511794
Received(收稿日期): 2009-10-12; Accepted(接受日期): 2009-12-08.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2010.00410
源于大豆 EST的花生属(Arachis)同源 SSR标记的开发及利用
洪彦彬 陈小平 刘海燕 周桂元 李少雄 温世杰 梁炫强*
广东省农业科学院作物研究所, 广东广州 510640
摘 要: 通过拼接 394 370条大豆 EST共获得 82 614条 Uni-EST, 其中 2 082条包含 2 191个 SSR位点, 平均每 22.96
kb EST出现 1个 SSR。二核苷酸重复在大豆 EST-SSR中所占比例最大(63.5%), 其次是三核苷酸重复(30.9%); AG/CT
在 SSR基序(motif)中出现频率最高(35.8%), AT/AT (25.4%)次之。2 082条 SSR-EST共设计引物 685对, 其中 582对在
4个大豆品种中得到有效扩增, 98对检测出多态性。582对可扩增引物在花生属中的可转移性分析表明, 大豆 EST-SSR
在花生属 9 大区组间的可转移性有所差异(12.4%~15.7%), 匍匐区组最高, 大根区组最低, 平均为 14.2%。79 对可转
移性同源标记在花生区组中的多态性分析表明, 69个 SSR在 10个野生种间检测出多态性, 仅 5个在 22个栽培品种
中具多态性。对引物 ES-105 在大豆和花生区组中的扩增产物测序结果显示, 两个大豆品种间仅 SSR 位点存在 3 个
AT 重复差异, 其余序列均一致, 而大豆与花生区组间的扩增产物在序列上存在较大差异, 花生区组除缺失 SSR位点
外, 侧翼序列也存在频密的插入/缺失和置换。研究结果表明, 通过大豆 EST开发花生属同源 SSR标记具可行性。作
为有功能的分子标记, 大豆 EST-SSR在花生区组内多态性丰富, 可直接用于大豆-花生比较基因组研究。
关键词: 大豆; 花生属(Arachis); EST; SSR
Development and Utilizaiton of Orthologous SSR Markers in Arachis through
Soybean (Glycine max) EST
HONG Yan-Bin, CHEN Xiao-Ping, LIU Hai-Yan, ZHOU Gui-Yuan, LI Shao-Xiong, WEN Shi-Jie, and
LIANG Xuan-Qiang*
Crops Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510640, China
Abstract: Lack of sufficient molecular markers hindered current genetic research in peanuts (Arachis hypogaea L.). It is neces-
sary to enrich molecular markers for potential use in peanut breeding programs. Recently, EST-SSRs have received much attention
with the higher level of transferability to closely related species and it can be rapidly developed from EST database by data mining
at low cost. In this study, we mined SSRs from the soybean EST and analyzed their transferability in peanuts (Arachis hypogaea
L.) and its wild species. A total of 394 370 soybean ESTs were clustered to generate 82 614 Uni-ESTs, 2 082 ESTs of which con-
tained 2 191 SSRs with 1 SSR in 22.96 kb EST. Di-nucleotide motif (63.5%), followed by tri-nucleotide (30.9%), were the most
abundant in soybean EST-SSR. The top two motif sequence types with high frequency were AG/CT (35.8%) and AT/AT (25.4%).
Based on the 2 082 SSR-ESTs, a total of 685 primer pairs were successfully designed and synthesized to test the amplification in
four soybean cultivars. There were 582 primer pairs amplified effectively in soybean cultivars, 98 of which exhibited polymor-
phism. The cross-transferability of soybean EST-SSR was different among nine sections in Arachis, ranging from 12.4% to 15.7%
with an average of 14.2%. Polymorphism analysis in Arachis section showed that 69 of the 79 orthologous SSR markers displayed
polymorphsim in ten wild species, while only five markers had polymorphism in 22 cultivars. The PCR bands amplified in
soybean and Arachis section by primer ES-105 were cloned and sequenced. The results revealed that the polymorphism among
two soybean cultivars was caused by little variation in SSR motif (AT)n, while the polymorphsim between soybean and Arachis
section was contributed not only by the indel in SSR loci, but also by the frequence of the indel and substitution in franking region.
The work indicated that the development of orthologous SSR markers for Arachis from soybean EST is feasible. There was a high
level of polymorphism in Arachis sections for soybean-derived EST-SSR, therefore, the research of comparative genomics of
Glycine and Arachis can be performed due to the high transferability of functional molecular markers.
Keywords: Soybean; Arachis; EST; SSR
第 3期 洪彦彬等: 源于大豆 EST的花生属(Arachis)同源 SSR标记的开发及利用 411


花生属(Arachis)隶属豆科(Legume), 蝶形花亚科
(Faboideae; Paplionoideae), 包含 9 大区组(section)、
50~70 个种(species), 其中花生栽培种(Arachis hy-
pogaea L.)是唯一在农业生产上种植的种。尽管
RFLP、RAPD、AFLP等 DNA标记在花生野生种间
存在丰富的多态性 [1-3], 但在栽培品种间多态性极
低[3-5], 导致花生重要性状基因定位、标记辅助选择
和比较基因组学等研究落后于其他作物。近年来系
列研究表明, SSR 在花生栽培种间存在相对丰富的
多态性[6-7], 使其成为当前检测栽培种分子多态性的
主要标记[8-9]。由于对花生基因组来源的 SSR的开发
投入较大且费时费力, 目前国际上已开发的花生栽
培种基因组 SSR 引物仅千余对, 难于满足花生分子
标记及相关研究的需求。开发花生 SSR被列为国际
花生基因组计划的重要内容。近年来, 大量快速增
长的 EST数据成为 SSR的重要来源, 并为 SSR标记
的开发提供了新的途径[10]。来自 EST的 SSR (EST-
SSR)除具有一般 SSR 标记特点外, 还有以下特殊优
势：(1) 开发简单、快捷、费用低。利用生物信息学
方法能在短时间内完成 EST数据的比对拼接和 SSR
位点的搜索[11-12]。(2) 是功能标记。EST本身就是表
达基因的一部分, 通过与已知功能基因比对可预测
SSR-EST 的功能[13]。(3) 通用性好。EST 来自转录
区 , 保守性较高 , 具有较好的通用性 , 适合作为近
缘物种的同源标记[14]。目前, 国内外学者已从水稻、
小麦、玉米、甘蔗等 20多种植物中开发了大量的 EST-
SSR[15-17], 并已在大麦、柑橘、咖啡等植物上证明 EST-
SSR 在种/属间具有较高的可转移性[18-20]。Varshney
等[21]分析了 165个大麦 EST-SSR在小麦、黑麦、水
稻上的具可转移性, 可转移率分别为 78.3%、75.0%
和 43.0%。Gutierrez 等[22]采用 209 对蒺藜苜蓿(Me-
dicago truncatula) EST-SSR和 33对 genomic-SSR引
物扩增蚕豆、鹰嘴豆和豌豆的基因组 DNA, 表明
EST-SSR (39%~43%)的可转移率几乎是 genomic-
SSR (21%~24%)的两倍。He 等[23]分析 432 个大豆
SSR 在花生栽培种中的可转移性 , 表明大豆
EST-SSR(34.0%)在花生栽培种中可转移性高于
genomic-SSR (24.4%)。至今 GenBank 收录的大豆
ESTs已达 1 386 618条(截至 2009年 4月 10日), 多
数序列仍未用于开发 SSR, 而用于发展同源标记的
更是寥寥无几。本文拟通过利用大豆 EST数据开发
SSR, 采用同源扩增方法 , 筛选在花生栽培种和野
生种上具有可转移性的同源 SSR标记。
1 材料与方法
1.1 试验材料
从 GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/)
下载 394 370条大豆 EST (截至 2007年 12月 30日)。
用于 EST-SSR检测的大豆品种华夏 1号、华夏 3号、
华春 1 号和华春 2 号, 由华南农业大学农学院提供;
花生野生种 20个, 花生栽培品种 22个, 均由广东省
旱地作物资源库提供(表 1)。
1.2 基因组 DNA提取
取每个品种苗期嫩叶, 采用 CTAB 法提取基因
组 DNA[24], 用 0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测 DNA质
量, 并根据对照DNA 的亮度估计花生基因组 DNA
浓度。
1.3 EST序列拼接
采用 TIGR基因指数聚类工具(TIGR Gene Indices
Clustering Tools, 简称 TGICL, http://compbio.dfci.
harvard.edu/tgi/software/)拼接大豆 EST。拼接标准是
EST 序列重叠碱基数≥50 bp, 序列相似度≥90%,
序列不匹配长度≤20 bp。
1.4 SSR位点搜索
采用 SSR搜索脚本 MIcroSAtellite (MISA, http:
//pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)在 Uni-EST 中搜索
SSR位点。搜索标准为 SSR长度≥20 bp, 二、三、
四、五、六核苷酸基序(motif)重复次数分别≥10、
≥7、≥6、≥5、≥5。将 MISA 配置文件(misa.ini)
中代表 SSR基序长度和最小重复次数的数据对设定
为 2-10、3-7、4-6、5-5、6-5 (不包含单核苷酸类型)。
1.5 SSR引物设计
根据 SSR 位点两端的保守区域, 采用 Primer
premier 5软件设计引物。设计引物基于下列原则: (1)
溶解温度(Tm) 50~60 , ℃ 最适复性温度 55 ; (2) ℃ 预
测扩增产物大小 100~500 bp; (3) 引物长度 18~24 bp,
预测扩增率≥80%; (4) 引物 GC 含量 40%~60%。在
PE9700热循环仪(美国 ABI公司)上进行 PCR。
1.6 PCR扩增
PCR体系 20 μL, 含 1×PCR buffer (50 mmol L–1
KCl, 10 mmol L–1 Tris-HCl, pH 8.3, 1.5 mmol L–1
MgCl2, 0.1%明胶), 1 U Taq DNA聚合酶, 50~100 ng
模板 DNA, 0.15 μmol L–1引物, 0.2 mmol L–1 dNTP。
反应程序为 94℃ 5 min; 94℃ 1 min, 55℃ 30 s, 72℃
1 min, 35个循环; 72℃ 5 min。扩增产物经 6.0%非变
性聚丙烯酰胺凝胶电泳(电泳缓冲液 1×TBE, 电压

412 作 物 学 报 第 36卷

表 1 用于大豆 EST-SSR可转移性分析的花生栽培种和野生种
Table 1 Cultivars and wild peanut species used in transferable analysis of soybean EST-SSR
区组
Section
种
Species
亚种
Subspecies
品种
Accession
来源
Origin
大根区组 Caulorrhizae section A. pintoi Krapov. & Gregory 巴西 Brazil
直立区组 Erectoides section A. paraguariensis Chodat & Hassl. 巴西 Brazil
围脉区组 Extranervosae section A. prostrate Benth. 巴西 Brazil
异形花区组 Heteranthae section A. pusilla Benth. 巴西 Brazil
匍匐区组 Procumbentes section A. rigonii Krapov. & Gregory 巴西 Brazil
根茎区组 Rhizomatosae section A. glabrata Benth 巴西 Brazil
三叶区组 Triseminatae section A. guaranitica Chodat & Hassl. 巴西 Brazil
三籽粒区组 Trierectoides section A. triseminata Krapov. & Gregory 巴西 Brazil
A. monticola Krapov. & Rigoni 阿根廷 Argentina
A. Stenosperma Krapov. & Gregory 巴西 Brazil
A. correntina Krapov. & Gregory 巴西 Brazil
A. cardenasii Krapov. & Gregory 巴西 Brazil
A. magna Krapov., Gregory & Simpson 巴西 Brazil
A. duranensis Krapov. & Gregory 阿根廷 Argentina
A. Trinitensis Krapov. & Gregory 巴西 Brazil
A. batizocoi Krapov. & Gregory 玻利维亚 Bolivia
A. helodes Mart. ex Krapov. & Rigoni 巴西 Brazil
A. villosa Benth. 巴西 Brazil
PI 393531 美国 America
PI 390693 美国 America
琼山花生 Qiongshanhuasheng 中国 China
辽宁四粒红 Liaoningsilihong 中国 China
德豆 Dedou 中国 China
广柳 Guangliu 中国 China
三月拧 Sanyuening 中国 China
粤油 20 Yueyou 20 中国 China
Spancross 美国 America
连续开花亚种
ssp. fastigiata
Tennessee Red 美国 America
小硫球 Xiaoliuqiu 中国 China
阳江铺地毡 Yangjiangpudizhan 中国 China
细花勾豆 Xihuagoudou 中国 China
耙豆 Padou 中国 China
Bo-50 中国 China
英德鸡豆仔 Yingdejidouzai 中国 China
河源半蔓 Heyuanbanman 中国 China
托克逊小花生
Toukexunxiaohuasheng
中国 China
Sunoleic 97R 美国 America
Tifrunner 美国 America
Georgia Green 美国 America
花生区组 Arachis section
A. hypogaea L.
交替开花亚种
ssp. hypogaea
NC0940-22 美国 America

75 V, 时间 2.5 h), 0.1% AgNO3染色, BIORAD凝胶
成像系统观察、照相、读带。
1.7 DNA回收测序
采用 Biospin聚丙烯酰胺 DNA回收试剂盒回收
扩增产物, 回收产物与克隆载体 pMD18-T连接后转
化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞, 重组子经鉴定后送
上海英骏生物技术有限公司测序。
2 结果与分析
2.1 EST序列拼接
为了减少冗余序列, 提高 EST 序列的质量, 避
免开发的 SSR 出现重叠, 采用 TGICL 工具对大豆
第 3期 洪彦彬等: 源于大豆 EST的花生属(Arachis)同源 SSR标记的开发及利用 413


EST序列进行拼接。394 370条 EST (163.5 Mb)经拼
接后共获得 82 614 条 Uni-EST (50.3 Mb), 其中
contigs 35 242条, singletons 47 372条。
2.2 EST-SSR分布特点
采用 MISA脚本从 82 614条大豆 Uni-EST中共
搜索到 2 191个 SSR, 分布在 2 082条 EST中, 其中
109 条 EST 含一个以上 SSR, 平均每 22.96 kb EST
出现 1 个 SSR。在搜索出的 SSR 中, 二至六核苷酸
重复均存在, 但出现的频率差异较大。二核苷酸重
复最高, 共 1 391 个, 占 63.5%, 其次是三核苷酸重
复, 676 个, 占 30.9%。四、五、六核苷酸重复出现
频率远低于二、三核苷酸重复, 只占 5.6% (表 2)。
SSR平均长度为 35.3 bp, 二、三、四、五、六核苷
酸重复长度分别为 40.9、25.0、25.9、27.3和 31.6 bp。
大豆 EST-SSR种类较为丰富, 包含 78种基序类
型(motif sequence type), 二、三、四、五、六核苷酸
重复分别含有 4、10、10、15和 39种基序类型。出
现频率最高的 6种基序类型为 AG/CT (35.8%)、AT/
AT (25.4%)、AAG/GTT (8.5%)、AAT/ATT (6.5%)、
AAC/GTT (4.5%)和 ACC/GGT (3.4%), 其余 72种只
占 15.9% (图 1)。
2.3 EST-SSR引物设计及可扩增性验证
采用 Primer premier 5软件对 2 082条 SSR-EST
设计引物, 结果 685条设计成功, 其余 1 397条由于
SSR 侧翼序列太短或者结构复杂而无法设计。已设
计引物的 SSR-EST 中, 分别含有二、三、四、五和
六核苷酸重复的 330、345、19、12和 26个。
为验证引物的可扩增性, 采用全部引物扩增 4
个大豆品种(华夏 1号、华夏 3号、华春 1号和华春
2号)。结果表明, 有 582对引物能在 4个品种中扩增
出清晰条带, 其余 103 对无扩增产物或扩增带型微
弱。在可扩增的引物中, 415 对扩增片段长度与预

表 2 大豆 EST中 SSR搜索结果
Table 2 Summary of mining SSR in soybean EST
序列类型
Type of sequence
叠连群
Contig (kb)
单序
Singleton (kb)
小计
Total (kb)
无冗余 ESTs数目 Number of Uni-ESTs 35242 (27031) 47372 (23279) 82614 (50310)
检测的 SSR数目 Number of identified SSRs 952 1239 2191
含 SSR的 ESTs数目 Number of ESTs containing SSR 877 1195 2082
含 1个以上 SSR的 ESTs数目 Number of ESTs containing more than 1 SSR 75 34 109
复合型 SSR的数目 Number of SSRs present in compound formation 29 42 71
二核苷酸 Di-nucleotide 516 875 1391 (63.5%)
三核苷酸 Tri-nucleotide 340 336 676 (30.9%)
四核苷酸 Tetra-nucleotide 27 17 44 (2.0%)
五核苷酸 Penta-nucleotide 13 11 24 (1.1%)
六核苷酸 Hexa-nucleotide 26 30 56 (2.5%)



图 1 大豆 EST-SSR基序类型分布图
Fig. 1 Frequency distribution of soybean EST-SSR based on motif sequence type
414 作 物 学 报 第 36卷

期相近, 156对大于预期, 11对小于预期。此外, 有
98对(16.9%)能在 4个品种间检测出多态性, 其中 88
对检测出 2个等位基因, 8对检测出 3个等位基因, 2
对检测出 4个等位基因。
2.4 大豆 EST-SSR在花生属中的可转移性
为研究大豆 EST-SSR 在花生属不同区组(section)
间的可转移性, 用 582 对可扩增引物分析 9 个来自
不同区组的野生种(表 3)。结果表明, 供试引物在不
同区组间扩增出 3种带型, I为特异带, 通常包含 1~2
条主带; II为 RAPD带; III为无扩增产物或者扩增带
型微弱。将带型 I和 II的 SSR作为可转移同源标记
进行统计, 共有 96个 SSR至少在一个区组具可转移
性, 其中 61个在 9个区组中均具有可转移性。不同
区组间的可转移率有所差异(12.4%~15.7%), 匍匐区
组最高, 大根区组最低, 平均 14.2%。
2.5 同源标记在花生区组中的多态性
采用 79 对在花生区组具可转移性的同源标记
引物扩增区组内 10 个野生种及 22 个栽培品种(表 4
和表5)。结果表明, 全部引物在供试材料中均得到有
效扩增, 其中 56 对扩增出带型 I, 23 对扩增出带型
II。具带型 I的 SSR引物中有 43对能在野生种间检
测出 48个多态性位点, 每个位点等位基因数 2~6个,
平均 3.1 个; 扩增出带型 II 的 SSR 引物在野生种间
均检测出多态性, 每对引物扩增出多态性带 3~9 条,
平均 6.2 条。与野生种相反, 同源 SSR 标记在花生
栽培品种间多态性偏低。79个 SSR仅 5个能检测出
多态性(图 1), 且均为带型 II, 多态性条带 2~5条, 平
均 3.2条。

表 3 大豆 EST-SSR在花生属 9大区组中的可转移性
Table 3 Transferability of soybean EST-SSR in 9 sections of Arachis
可转移 EST-SSR Transferable EST-SSR
区组
Section
物种
Species 带型 I
Band pattern I
带型 II
Band pattern II
可转移率
Transfer frequency
(%)
大根区组 Caulorrhizae section A. pintoi Krapov. & W.C. Gregory 56 16 12.4
直立区组 Erectoides section A. paraguariensis Chodat & Hassl. 52 30 14.1
围脉区组 Extranervosae section A. prostrate Benth. 53 25 13.4
异形花区组 Heteranthae section A. pusilla Benth. 56 30 14.8
匍匐区组 Procumbentes section A. rigonii Krapov. & W.C. Gregory 55 36 15.7
根茎区组 Rhizomatosae section A. glabrata Benth 55 31 14.8
三叶区组 Triseminatae section A. guaranitica Chodat & Hassl. 57 21 13.4
三籽粒区组 Trierectoides section A. triseminata Krapov. & Gregory 51 39 15.5
花生区组 Arachis section A. monticola Krapov. & Rigoni 56 23 13.6




图 1 引物 ES-291在 22个花生栽培品种中的扩增带型
Fig. 1 Amplification results of primer ES-291 in 22 peanut cultivars
M: marker; 1: PI393531; 2: PI390693; 3: 琼山花生; 4: 辽宁四粒红; 5: 德豆; 6: 广柳; 7: 三月拧; 8: 粤油 20; 9: Spancross; 10: Tennesse
Red; 11: 小硫球; 12: 阳江铺地毡; 13: 细花勾豆 ; 14: 耙豆; 15: Bo-50; 16: 英德鸡豆仔; 17: 河源半蔓; 18: 托克逊小花生; 19:
Sunoleic; 20: Tifrunner; 21: Georgia Green; 22: NC0940-22。
M: marker; 1: PI393531; 2: PI390693; 3: Qiongshanhuasheng; 4: Liaoningsilihong; 5: Dedou; 6: Guangliu; 7: Sanyuening; 8: Yueyou 20; 9:
Spancross; 10: Tennesse Red; 11: Xiaoliuqiu; 12: Yangjiangpudizhan; 13: Xihuagoudou; 14: Padou; 15: Bo-50; 16: Yingdejidouzai; 17:
Heyuanbanman; 18: Tuokexunxiaohuasheng; 19: Sunoleic; 20: Tifrunner; 21: Georgia Green; 22: NC0940-22.


表 4 花生区组同源 EST-SSR (带型 I)的基本特征
Table 4 Characteristics of orthologous EST-SSR (band pattern II) among Arachis section
标记
Marker
正向引物序列
F primer (5′3′)
反向引物序列
R primer (5′3′)
SSR基序
Motif
长度
Length
(bp)
扩增长度
Amplified length
(bp)
野生种等位基因数
Alleles No.
in wild species
ES-20 AGGGTATGTGAGGAGCGAGAC CGTGTTGCGAACGGTATGA (GA)36 263 120 3
ES-47 ATCGCCACCAACTATCACTTC TAACTTGCGGGCTTACAGGA (AT)11 306 110 3
ES-96 ATCAGAGCACAAGCCAACCTG CGAGTAAGGATAAGACGCTGAAGA (TAT)8 238 140 4
ES-97 GGCAAACTTTGGTCATTCACA CGGTCCAGGAGTATCAACAAG (AG)16 338 150 3
ES-102 AGACGAAACCTTCCTTTACAC TGCTGCCTCTTATTCATCCTA (AT)11 212 140 2
ES-105 CCCCTTTGCTTCTGATGCTTT GATTGGATGCTGGTGGGAGAT (AT)27 252 170 6
ES-112 TTCCTTATGTTCATTTCCTCCAC GTCAGTACGGACCAGCAGAAT (AT)24 326 250, 470 2, 2
ES-147 ATTGGAAACTTGAATTAAGGACCAC CTGGCAACGACTAATCAATCACA (AC)10 213 135
ES-165 TAATAACCAGCAGGGTCAGG TGTGGTGGTGATGGTGAGAC (CCG)7 227 280
ES-180 AGCGAAAGGTAGCACCCAAAT TATCGGGATGTCGTCTTCGTC (GAA)7 236 240 2
ES-186 ACTGGAAGGCGATGGAGTT AAACCGAACTGTTCCCAGA (AG)10 198 200
ES-189 TCATGCTCACCCTTCCCACT AGCACTCGGAATCTCGTCAA (GA)16,(AG)37 302 210
ES-214 CCTTCGCCATGCTCCAAT TAATGGTGGTTGCCTCCTCA (CT)61 313 100, 160 3, 2
ES-221 CTCCACGAATCCATATCCCTC CAGCATTACATGCCCTACGC (GGC)7 276 620
ES-224 GCTCCACCAACTAAGAACGG TAGCTGCACCAAGGGAAACA (TC)17 248 110 6
ES-235 TGGTTGGACTTGGTGGCATAG CTGGTGCCGCCCTAACAA (TGCGTT)5 141 90 4
ES-243 AAGTTTCTGGCAAACAACTACCC ATCATTCCCAATCACTGCATCAG (CT)37 292 500
ES-245 TGGAAAGACAACGGGAAGC AGTTGGCGAAATGGTGGGT (TCT)7 272 110 3
ES-254 GTTGTAAATTAAGGTGCAAGAAGC ACTCCACCACTCTGCTCTTCC (TA)15 183 350 5
ES-255 TCTCCTGTCGCCTTATTGAA CCTGAAGTACCAGCAAGCAC (TCA)7 272 185 2
ES-260 TAGTCGCAGCCGGGAAAG GGCACTGTGATATGGCAAGAG (GGT)9 331 210 3
ES-264 TCGCTGGCTTCGCAAGTTAT GAGGCATGGTTGAAATTAGGG (GA)52 330 140
ES-285 CCAAATGGTGACACGAGGAGA ACATACGAGGGTGAGCTACTGC (AT)24 294 150 3
ES-294 TCATCATTCTTTCTCGCACCA CTGGCTCTTCTTCTGCTTGCT (TTG)8 130 210 4
ES-296 GGCGTTTCACAAATGAGGTTC CTTCAACGGTCTCCAACTCCC (ATA)7 228 450
ES-299 TAGCGAGTATCAGCAGGTGGA GCGCAATATGTGCAGAGGC (TGC)8 197 140 4
ES-307 TGACGCCTCCACCAAAGC AAACCCATCACTGCCAAAGTC (TCT)7 170 175 2
ES-334 CACCTCTACATTGGCACGATT TGAGATTGAGCCATTGGTGTAA (TGC)7 235 500 2
ES-350 CCTTTGGGTTTGCGTCTCAG CGCCACCAAGTCTCCTTCATAT (TGC)8 234 330 2


(续表 4)
标记
Marker
正向引物序列
F primer (5′3′)
反向引物序列
R primer (5′3′)
SSR基序
Motif
长度
Length
(bp)
扩增长度
Amplified length
(bp)
野生种等位基因数
Alleles No.
in wild species
ES-354 ACTGCCACTTCCTTCCTCC ATAACACTATCATACCCACATTCC (GTT)9 151 200 3
ES-367 TGCCCTGACTTGAACCTTG ATGCCCAAGAAATCATAAGC (CTG)8 206 240
ES-377 GGAACCCAAATTATGACAACG CACCAGCACTCGCTCACTCTT (GA)13 272 290
ES-387 TCAACGCATCCAATTACCA ACCAGCCAAACTTCAACTCA (GA)19 195 130 2
ES-401 GAGTTCTCCGACCTCTTCTTG ATCAGATGTCCACCTCAAACG (CT)11 290 250 4
ES-403 GGCAAAGGAGGAGGGAGAA GTGGGAAATAAGAACAGCAACT (AAG)9 153 150, 320 2, 3
ES-405 GGCAAGGATAAGCGACCCA GTACCAGGCAACTGACTACA (ATT)13 205 140
ES-470 ACAACCGCCGCTACGACT TGATGAGGATGGAGTAGAGGAGC (CCT)7 267 270
ES-479 ACGACTACATTCCGAGCCTGAG ACAGCCCTGCCATCACCTTC (TCT)8 204 180 3
ES-500 TGTGGTTTGGTTGCGATGC TCAACATCCGAGCCACCATT (GAATCA)5 147 150 4
ES-510 GTCACGAACGAAAGGGATAAT CTTTGACCGATCTTCTGCTGT (AAAG)6 251 250 3
ES-515 GTAGCTGCTGTGCTAGGAGATG CACTTGGAGATTCTAGCTTTCG (TGA)7 202 400 3
ES-520 TACCCTTGTTTGATTGATTGG CTCTGGGTTGGTAGGAGTGG (TTG)12 189 180, 250 2, 3
ES-550 AGTCAAAGTTCTCACCCACCAT AACGAAAGGAACAGAAGGTGC (TTG)7 214 340 2
ES-551 CTTCCGTTTCCGATTATTCCA TTATGTACCCGATTCTCCTCCC (CGG)7 122 250 3
ES-566 GGACCCGCGAATGTCTCA AACCCAGAAACAGAATCAACGA (AG)16 222 160 3
ES-567 TTTGGAGCTTAGACTTGGTTAT CTCATCAGAAACCCGAACT (TA)20 229 170 3
ES-570 CAGCTACTCATCGGAGACACTCG CGGAGACTGGAGAAGCGAAGT (ACG)8 242 160 3
ES-576 GAAAGCGGTGTTGCAGAGGTA CAGAACCACCCTCATCCTCAA (AT)16 301 310 4
ES-577 AGGCACAGTCTCAGAGCAACA CGAAGCCGAAAGTGTAGAACC (CCTAAC)9 198 250 3
ES-579 GCTTTGATTTCCTGCTGCTTC ATTTGGAGCTGAGGCTTGGTC (AT)13,(AT)10 184 340
ES-593 TTCGCTATCCGCTGCCTCC CCTTGATGATGCTGCTTGTCTA (GGC)7 141 120 4
ES-618 TTTTCACCCTTTCGCACTCT CTCAGGGAGGTTCGGATTG (CCCAAG)5 211 260 3
ES-620 GGAAACTCAGTCCGAAACCA GCGTGGTGAAGAAGGAGGA (CCG)7 191 180 3
ES-625 GCTTCACTCATGCCACCACA CCTGCTTGATGCGTATGTAGAA (CCA)7 369 160, 410 3, 3
ES-637 CGCAATCTATCGTTGTGGC ACGACATCTCGGTTTGGCTC (TTA)22 244 250 4
ES-639 TTTCAACAATGGCAGTCTCAG TCAGAGGACCCATCTTCACC (GTGTG)5 232 160 3


第 3期 洪彦彬等: 源于大豆 EST的花生属(Arachis)同源 SSR标记的开发及利用 417


2.6 EST-SSR扩增产物的序列分析
图 2和图 3结果表明, 引物 ES-105在两个大豆
品种间只存在 3 个 AT 重复差异, 其余序列均一致,
而大豆与花生区组间存在较大差异(图 3)。华夏 1号、
华夏 3 号分别含有(AT)12和(AT)15重复序列, 但花生
栽培品种 Tifrunner 和野生种 A. duranensis、A.
trinitensis、A. batizocoi均缺失 AT重复序列。除 SSR
位点缺失外, 侧翼序列在花生区组中存在插入/缺失
和置换。例如在 BU544951 第 204 碱基和第 301 碱
基处花生区组分别缺失(AAT)2 和(CAA)3 序列, 第



图 2 引物 ES-105在大豆和花生区组中的扩增带型
Fig. 2 Amplification results of ES-105 in soybean and Arachis section
M: markers; 1: PI393531; 2: PI390693; 3: 琼山花生; 4: 辽宁四粒红; 5: 德豆; 6: 广柳; 7: 三月拧; 8: 粤油 20; 9: Spancross; 10: Tennesse Red; 11:
小硫球; 12: 阳江铺地毡; 13: 细花勾豆; 14: 耙豆; 15: Bo-50; 16: 英德鸡豆仔; 17: 河源半蔓; 18: 托克逊小花生; 19: Sunoleic; 20: Tifrunner;
21: Georgia Green; 22: NC0940-22; 23: A. monticola; 24: A. stenosperma; 25: A. correntina; 26: A. cardenasii; 27: A. magna; 28: A. duranensis; 29:
A. trinitensis; 30: A. batizocoi; 31: A. helodes; 32: A. villosa; 33: 华夏 1号; 34: 华夏 3号; 35: 华春 1号; 36: 华春 3号。
M: marker; 1: PI393531; 2: PI390693; 3: Qiongshanhuasheng; 4: Liaoningsilihong; 5: Dedou; 6: Guangliu; 7: Sanyuening; 8: Yueyou 20; 9:
Spancross; 10: Tennesse Red; 11: Xiaoliuqiu; 12: Yangjiangpudizhan; 13: Xihuagoudou; 14: Padou; 15: Bo-50; 16: Yingdejidouzai; 17:
Heyuanbanman; 18: Tuokexunxiaohuasheng; 19: Sunoleic; 20: Tifrunner; 21: Georgia Green; 22: NC0940-22; 23: A. monticola; 24: A.
stenosperma; 25: A. correntina; 26: A. cardenasii; 27: A. magna; 28: A. duranensis; 29: A. trinitensis; 30: A. batizocoi; 31: A. helodes; 32: A.
villosa; 33: Huaxia 1; 34: Huaxia 3; 35: Huachun 1; 36: Huachun 3.



图 3 ES-105在大豆和花生区组间扩增产物序列比对
Fig. 3 Alignment of sequences obtained from SSR bands amplified in soybean and Arachis section by ES-105 primers
BU544951为标记 ES-105的原始 EST序列 GenBank登录号(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucest/22927812); N=A, T, C, G。
BU544951 was the accession No. of original EST sequence of ES-105 in GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucest/22927812); N=A, T, C, G.




表 5 花生区组同源 EST-SSR(带型 II)的基本特征
Table 5 Characteristics of orthologous EST-SSR (band pattern II) among Arachis section
多态性条带 Polymorphic band 标记
Marker
正向引物序列
F primer (5′3′)
反向引物序列
R primer (5′3′)
SSR基序
Motif
长度
Length
(bp)
扩增长度
Amplified
length (bp)
野生种
Wild species
栽培种
Cultivar
ES-34 CCTGAAGAAACAACCCAACC GTGGAAGAAAGGGAAGGAAGT (CAT)7 252 80–450 5
ES-37 GTCATTGAAGCCTCCTCCTG CCACCACCTTAACTCCAACC (GTGCCC)6 179 90–600 6
ES-101 CAGTGAGAAGGGACAGCATC ATGATCCCTGCTTTCCTTTA (TA)11 248 100–500 8
ES-118 AGGCATGGTTGGTGGTAGTGT TCGGGATGATATTCAGAGGTG (GCT)8 138 100–370 7
ES-169 GGCATGAGTGGACGCTATAAGA ATCACAGGAAACAACGGAAAA (CACT)6 155 80–600 7 2
ES-170 GAGCATAGTAACGGCGGAATC GTGCCTCTTACTCGTCTCGTCTT (GAGAA)5 244 80–500 8 4
ES-187 GTGGTATCATCACAGCGAAGC ACTCTTCTCCTCCCTCGTCCT (CT)10 116 110–420 3
ES-200 GCTTCAGCGACGACTCCA ACCATTCCCTCCAACCTCT (GTT)7 292 160–400 3
ES-204 CATCTTCAGCACTGCCATCA CTCATCAGAACTTCTACCCAAAC (GA)24 206 80–600 6
ES-251 AAGGAACAGCCAATGAGGATA ATCATGTAATTCTTCTGCACCC (ATC)7 266 120–570 5
ES-256 GTAGGTATGAGGTGGTGAAGGC CTACTATAAAGGAGTAACCACGATGA (TC)57 228 180–1000 8
ES-291 GACAGCGAAGTTGGTAGAGCA TGCTTTGGCTTCACCCTCT (AGA)7 208 120–500 7 3
ES-293 CCTCGGTAGTCCCACTTCAC GTAGCCCATAAACGCATTCC (GA)10 252 130–700 9 5
ES-303 CTTCCATTGGCTGCCTTCA ACACGCAGCACCCAATGAC (TC)10 255 90–700 7 2
ES-331 CGTCGCAAAGAAGGTTCAG CTATCCACCGAGCCACCTC (TTC)7 292 100–400 8
ES-335 TGGGTCAGGTGGGAGCAGTA CAAGTCAAAGCCAGGGAAGG (CAA)7 229 140–530 5
ES-389 TTTCGGTGCCTCTTCCTTCA TCTAGCTGCTTCCCGTTTCC (TAT)7 288 100–800 5
ES-490 GCAAAGGCAGGCTTGGAGTA AAGAGGCGTGATGAAAGGATTA (TGT)8 221 100–800 6
ES-531 CTTTCACAGCCATCACAGTCC CCTCTTCCCTCCCTTCCTCT (AT)14(AG)15 299 100–450 5
ES-539 CCCTCCCTTTCCTCCACTG CGTGTTTGGCCTTGTTGCT (CAC)7,(CTC)8 337 100–800 6
ES-559 GATGACCTGACGCCGAAGA TTCTCGTTCATCTCCGCCAC (TCC)7 143 100–600 6
ES-592 GAAGGGACACCGTGGAAGA CACAGATTGTTGGTAAAGGAGGA (AAG)10 205 120–740 5
ES-597 AGCCTCATCCACCATAAACC AGTTTGGTTCATCTGGGTCAT (AAG)7 247 90–300 7


第 3期 洪彦彬等: 源于大豆 EST的花生属(Arachis)同源 SSR标记的开发及利用 419


320碱基处同时出现插入/缺失和置换[(TAC)2TAG→
(TAC)1~6]。引物 ES-105在花生区组内的多态主要是
由第 320 碱基处(TAC)n的插入/缺失造成。Tifrunner
两条主带的差异与野生种间的差异类似, 说明两主
带可能是 ES-105 在 A 和 B 基因组的扩展片段。由
此可知, ES-105 在大豆和花生区组间的长度多态除
与(AT)n 重复次数差异外, 还与侧翼序列的插入/缺
失有关。尽管单碱基置换无法通过聚丙烯酰胺凝胶
电泳检测出来, 但测序结果显示大豆与花生区组间
存在频密的单碱基置换, 依靠检测扩增片段长度不
足以反映大豆与花生区组间的 DNA多态性。
3 讨论
系列研究表明, 植物不同物种间甚至同一物种
内 EST-SSR的频率、核苷酸重复类型存在一定的差
异[25-27]。Varshney等[25]分析大麦(75.2 Mb)、玉米(54.7
Mb)、水稻(43.9 Mb)、黑麦(3.7 Mb)、高粱(41.6 Mb)
和小麦(37.5 Mb)的 EST, 发现 EST-SSR 频率为 1
SSR/1~6 kb, 其中三核苷酸重复占 54.0%~78.0%, 二
核苷酸重复占 17.1%~40.4%。Jayashree 等 [28]利用
SSR搜索软件 SSRIT扫描了 135.9 Mb大豆 EST序
列, 平均每 3.5 kb检测到 1个 SSR, 其中二、三、四、
五核苷酸重复比例为 10.3%、58.6%、24.1%和 6.9%。
本研究中大豆 SSR的频率为 1 SSR/22.4 kb, 二、三、
四、五核苷酸的比例为 63.5%、30.9%、2.0%和 1.1%,
与 Jayashree的研究结果存在很大差异。其原因除与
物种间基因组差异、EST 数据来源、SSR 搜索软件
有关外, 还受 SSR 搜索标准的影响。本研究中设置
的标准为 SSR≥20 bp, 如果按照 Jayashree 的标准
(SSR≥12 bp)进行搜索, SSR 的频率将变为 1 SSR/
2.9 kb, 二、三、四、五核苷酸重复比例为 21.4%、
48.8%、22.6%和 7.2%, 与 Jayashree的结果类似。
引物设计受诸多因素影响, 并非能够完全精确
无误, 与 genomic-SSR一样, EST-SSR引物常常存在
部分(10%~40%)无效扩增 [16,29-32], 本研究中有 20%
的 EST-SSR引物在大豆基因组 DNA中无扩增产物。
EST-SSR无效扩增的原因可能是 SSR一端或两端引
物刚好位于内含子 /外显子剪切位点 , 或基因组
DNA 序列中存在大内含子 , 或用于设计引物的
DNA序列存在问题。据统计, 大约 9%的禾本科植物
EST 序列存在质量问题[33]。除无效扩增外, 本研究
中有 167对引物扩增片段明显大于或小于预期长度,
原因可能与基因组序列存在内含子, 或者发生大的
插入/缺失有关。
ES-105在大豆和花生上的扩增产物序列分析表
明, SSR 序列在花生区组中存在缺失/缩短, 类似现
象也出现在大豆 [34]、拟南芥 [35]、番茄 [36]、小麦 [37]
等植物基因组 SSR上。Treuren等[35]等分析 10个拟
南芥 SSR位点在拟南芥属其他种上的同源序列, 9个
存在序列缩短现象。目前, 关于此现象存在多种解
释, 其中测量偏倚(ascertainment bias)理论[38-39]被学
术界普遍接受。该理论认为在开发 SSR 过程中, 通
常倾向于选择多态性高的 SSR, 其序列长度往往在
目标物种中已接近最大值, 显然, 近缘物种上对应
的序列长度必定较短。结合前人关于 SSR序列长度
影响多态性的研究结论[40], 初步判断大豆 EST-SSR
在花生栽培品种间多态性低的原因与 SSR重复序列
缩短有关。
多数研究表明, SSR 在属间的可转移性明显低
于种间, 而科间几乎没有转移性。且 EST-SSR 的可
转移性通常比 genomic-SSR 更高。本研究中大豆
EST-SSR 在花生属中的可转移率为 12.4%~15.7%,
与 Peakall 等[34]的研究结果相符, 但与 He 等[23]的研
究结果差异较大, 原因除供试引物不同外, 还可能
与本研究未将扩增带型较弱的引物列入统计范围有
关, 如将其列入, 可转移率将提高至 28.4%。另外,
根据 ES-105的测序结果可推测, 大豆 EST-SSR在花
生属可转移性较低可能与 SSR侧翼序列存在频密的
插入/缺失和置换有关。如果引物序列在花生区组基
因组对应的位置刚好存在插入/缺少或者置换, 将导
致扩增失败。尽管大豆 EST-SSR在花生上的可转移
率偏低, 但由于大豆 EST 数据庞大, 包含的 EST-
SSR 数量多, 利用生物信息学从大豆 EST 开发花生
属同源 SSR标记仍然较传统的方法省时省力。
4 结论
利用大豆 EST 开发花生同源 SSR 标记是可行
的。作为有功能的分子标记, 尽管大豆 EST-SSR 在
花生栽培品种间检测的多态性偏低, 但在花生区组
内存在丰富的多态性, 可直接用于大豆-花生比较基
因组研究。
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