全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2009, 35(11): 1973−1980 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由转基因生物新品种培育科技重大专项 (2009ZX08001-010B)和山东省农业科学院博士基金项目(2007YBS008)资助。
*
通讯作者(Corresponding author): 刘炜, E-mail: wheiliu@163.com; Tel: 0531-83179572
第一作者联系方式: E-mail: 200200139@163.com
Received(收稿日期): 2009-05-19; Accepted(接受日期): 2009-08-06.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2009.01973
花生中 DREB类转录因子 PNDREB1的克隆及鉴定
张 梅12,3 刘 炜1,2,* 毕玉平1,2,3 王自章4
1 山东省农业科学院高新技术研究中心 / 山东省作物与畜禽品种改良生物技术重点实验室, 山东济南 250100; 2 农业部黄淮海作物遗
传改良与生物技术重点开放实验室, 山东济南 250100; 3 山东师范大学生命科学学院, 山东济南 250014; 4 中国科学院植物研究所,
北京 100093
摘 要: 脱水响应元件结合因子(DREB)是一类对多个抗逆相关基因表达起调控作用的植物特有的转录因子, 在植物
抗逆能力综合改良方面具有重要作用。本研究通过筛选花生未成熟种子的 cDNA 文库, 分离到一个 DREB 类基因—
—PNDREB1 (FM955398)。该基因序列长度为 687 bp, 推测编码蛋白含有 229个氨基酸残基, 相对分子量为 24.7 kD,
理论等电点为 5.97, 与其他物种中该类转录因子序列同源性较高。利用酵母单杂交系统, 对花生 PNDREB1 与 DRE
元件的特异识别和结合能力及其 C-末端转录激活活性进行检测, 显示, 转入含有该基因及阳性对照基因的载体均可
使酵母菌株正常生长, 且具有显色反应, 而转入空载体的酵母菌株不能生长, 证明基因 PNDREB1中的 AP2结构域具
有和 DRE元件特异性结合的能力; 同时, 只有转入含有该基因 C-末端片段及阳性对照基因的载体可使酵母菌株正常
生长, 并具有显色反应, 而转入空载体的酵母菌株不能生长, 说明其 C-末端片段具有转录激活活性, 该基因为 DREB
类转录因子。基因表达模式分析显示, PNDREB1 为组成型表达, 且被低温强烈、迅速诱导表达, 并对干旱胁迫也有
一定程度的响应, 但对高盐和 ABA处理没有响应。
关键词: 花生; DREB类转录因子; PNDREB1; 酵母单杂交; 表达模式; 低温; 干旱
Isolation and Identification of PNDREB1: A New DREB Transcription
Factor from Peanut (Arachis hypogaea L.)
ZHANG Mei1,2,3, LIU Wei1,2,*, BI Yu-Ping1,2,3, and WANG Zi-Zhang4
1 Hi-Tech Research Center, Shandong Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory for Genetic Improvement of Crop, Animal and Poultry of
Shandong Province, Jinan 250100, China; 2 Key Laboratory of Crop Genetic Improvement and Biotechnology, Huanghuaihai, Ministry of Agriculture,
Jinan 250100, China; 3 College of Life Sciences, Shandong Normal University, Jinan 250014, China; 4 Institute of Botany, Chinese Academy of Sci-
ences, Beijing 100093, China
Abstract: The dehydration responsive element binding proteins (DREB) are important and specific plant transcription factors
responding to stress conditions including drought, salt and low temperature. It has been generally accepted that DREB can regu-
lates the expression of a number of abiotic stress-related genes in down stream of the stress signal transduction pathways. In this
paper, a DREB-like gene, named PNDREB1 (accession No. FM955398), was cloned by screening a peanut (Arachis hypogaea L.)
full-length cDNA library of immature seeds. The structure analysis showed that PNDREB1 contained a 687 bp ORF, encoding a
protein of 229 amino acids with predicted molecular weight of 24.7 kD and a isoelectric point of 5.97. The predicted protein se-
quence contained one conserved AP2 domain, which is the typical characteristic of DREB transcription factors. Based on the se-
quences similarity, PNDREB1 is classified into A-1 subgroup of DREB subfamily. Furthermore, the yeast hybrid system was car-
ried out, and the results confirmed that the AP2 domain of PNDREB1 could specifically interact with DRE cis-acting element. The
activation activity of the C-terminal end as a transcriptional activator was also been proved experimentally. The expression pattern
analysis carried out by semi-quantitative RT-PCR indicated that PNDREB1 was constitutively expressed in various tissues of
peanut, and was strongly upregulate by treatments with low temperature, also respond to dehydration. However, the expression of
PNDREB1 was not affected by high salinity and exogenous application of abscisic acid (ABA). In this study, we isolated and
characterized a novel peanut DREB-like transcription factor which was regulated by low temperature and osmotic stresses.
Keywords: Peanut; DREB transcription factor; PNDREB1; Yeast one-hybrid system; Expression pattern; Low temperature; Dehydration
1974 作 物 学 报 第 35卷

DREBs类转录因子属于AP2/EREBP(乙烯应答
元件结合蛋白)家族 , 特异存在于植物中 , 并对干
旱、高盐和低温等非生物胁迫产生响应。该类转录
因子的典型特征为含有高度保守的、约 70个氨基酸
残基组成的AP2 结构域, 其中包含可结合DNA和其
他蛋白的YRG和RAYD两个保守区[1]。同时, DREBs
类转录因子在序列中存在一段富含Ser/Thr的区域 ,
在基因互作中起重要的作用[2]。1994 年, Yamaguchi-
Shinozakiaib等[3]在拟南芥核抽提物中首次检测并分
离到能够与DRE顺式元件相互作用的DREBs类转录
因子, 命名为DRBF1。之后, Stockinger等[4]在拟南芥
中又分离到CBF1 等DREBs类基因。目前, 在油菜
(Brassica napus L.)、黑麦(Secale cereale L.)、小麦
(Triticum aestivumL.)、番茄(Lycopersicon esculentum
Mill.)、玉米(Zea mays L.)、辣椒(Capsicum annuum
L.)、大豆(Glycine max L.)等物种中都有DREBs类转
录因子的相关报道[5]。
近年来, 随着对DREBs类转录因子功能研究的
深入, 众多报道认为DREBs转录因子在多种胁迫适
应及抗性中具有重要作用。其中, Hsieh等[6]将拟南芥
中 35S:CBF1 基因转入番茄, 发现转基因番茄对低
温的耐性增加, 同时抗氧化能力和抗旱性也明显提
高, 且这种抗性可以稳定遗传。Dubouzet等[7]在研究
水稻OsDREB1A的抗逆功能时 , 发现它可以提高拟
南芥转基因植株的低温耐受性及耐盐能力。已知
DREB2A的中心区包含一转录激活的负调控区 , 删
除 该 区 可 得 到 DREB2A 的 组 成 型 活 性 形 式
DREB2A-CA, Sakuma等 [8]通过基因微阵列 , 对
DREB2A-CA过量表达的转基因拟南芥中上调基因
的分析发现, DREB2A-CA不仅对下游干旱和盐胁迫
响应基因具有调控作用, 还可诱导下游热激相关基
因的表达, 进而对胁迫信号产生响应。
花生(Arachis hypogaea L.)是世界上第四大油料
作物, 其产量和品质与人类生活密切相关。而干旱
作为花生产量和质量提高的主要限制因子, 是农业
生产中亟待攻克的重要问题。本文从花生未成熟种
子中分离到一个 DREB 类转录因子 PNDREB1(登录
号为 FM955398), 通过酵母单杂交实验对该基因的
DNA 结合活性和转录激活能力进行了验证; 并分析
了花生中该基因在低温、干旱、高盐以及 ABA处理
下的表达模式, 结合实验结果对 PNDREB1 可能的
功能进行了展望, 为进一步对该基因的深入研究打
下了基础。
1 材料与方法
1.1 试验设计
花生品种鲁花 14由本实验室保存。土培条件下
光照 16 h, 25℃, 黑暗 8 h, 20℃, 定期浇水至萌发。
种子在土中萌发生长约 3 周后, 对花生幼苗进行处
理, 其中整株材料置于 4℃冰箱中进行低温处理、采
用叶片喷施法进行干旱(20% PEG6000)、高盐(250
mmol L−1 NaCl)、和ABA (100 µmol L−1)处理, 处理时
间分别为 2 h, 以未经处理的花生幼苗作为对照, 剪
取叶片保存于–70℃冰箱中, 用于RNA的提取。
1.2 实验试剂
大肠杆菌(Escherichia coil) DH5α、酵母转化菌株
AH109为本实验室保存。含有 3次重复型DRE元件的
酵母双元报道子菌株为中国科学院植物研究所馈赠。
CTAB提取液(2% CTAB, 2% PVP, 0.1 mol L−1 Tris-Cl,
2.0 mol L−1 NaCl , 25 mmol L−1 EDTA, 2% β-巯基乙醇),
DNA提取液(0.1 mol L−1 Tris-Cl, 50 mmol L−1 EDTA,
0.5 mol L−1 NaCl, pH 8.0), TaKaRa公司反转录合成试
剂盒(TaKaRa Prime ScriptTM 1st Stran cDNA Sythesis
Kit), 限制性内切酶、T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合
酶、克隆载体pMD 18-T均购自TaKaRa公司, DNA片段
回收试剂盒购自博大泰克公司。酵母转化用培养基购
自Clontech公司。其他试剂为分析纯。特异引物由上海
生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.3 引物设计
用于克隆 PNDREB1全长的引物为 PNDREB1(F):
5′-ATGGACGTGGACCCGC-3′及 PNDREB1(R): 5′-AA
CTGCAGGTTAGTAGGGAACTGACTCC-3′; 其中下
游引物PNDREB1(R)引入Pst I位点以下划线表示; 用
于构建酵母表达载体的引物CPNDREB1(F): 5′-CGC
GGATCCCAGCCGCATTGGATTAC-3′, 其中下划线所
示为引入的BamH I位点。
花生内标引物为 Actin(F): 5′-GCCCAACTAGCGA
GTCGAAC-3′及 Actin(R): 5′-CAGAACCCAGAAGG
CTCTCC-3 ′; PNDREB1 半定量 RT-PCR 引物为
LH14DREB(F): 5′-GCAAAAACCCCTTGTCTCTC-3′
及 LH14DREB(R): 5′-GGAAAGTAATCCAATGC
GG-3′。
1.4 酵母表达载体
以花生未成熟种子 cDNA 文库中相应克隆为模
板, T3通用引物和 PNDREB(R)为引物, 经 PCR获得
858 bp左右的条带(该片段包含 PNDREB1的全长序
列 ) , 将该片段经酶切后连入酵母表达载体
第 11期 张 梅等: 花生中 DREB类转录因子 PNDREB1的克隆及鉴定 1975

pGAD424 , 得到酵母双元表达载体 pGAD424-
PNDREB1, 用于检测PNDREB1的结合活性。通过酶
切、连接的方式将已知DREB类基因DREB1A[2]连入
酵母表达载体 p G A D 4 2 4 , 得到 p G A D 4 2 4 -
DREB1A, 作为阳性对照。
以花生未成熟种子 cDNA 文库中相应克隆为模
板, CPNDREB1(F)和 PNDREB(R)为引物, 经 PCR获
得 329 bp左右的条带(该片段包含 PNDREB1的羧基
端 (C 端 )), 将该片段经酶切后连入酵母表达载体
p G B K T 7 , 得到酵母双元表达载体 p G B K T 7 -
CPNDREB1, 用于分析PNDREB1 羧基端的转录调
控活性。通过酶切、连接的方式将DREB1A[9]连入酵
母表达载体pGBKT7, 得到pGBKT7-DREB1A, 作为
阳性对照。
1.5 花生叶片总 RNA 的提取和单链 cDNA 的合
成
以CTAB法 [10]提取花生叶片总RNA。取花生叶
片约 0.2 g, 经研磨后放入 1.5 mL离心管中, 加入
65℃预热的CTAB提取液 600 µL, 经剧烈振荡后于
65℃水浴 2~5 min。冷却后加入等体积的氯仿/异戊
醇, 于 4℃下 10 000×g离心 15 min。吸取上清液于
1.5 mL离心管中, 加入 2 µL的DNase I, 37℃水浴 15
min。重复该步骤一次, 加入 1/3 体积的 8 mol L−1
LiCl, 4℃下沉淀过夜。经离心弃上清液, 沉淀即为叶
片总RNA。分别用 70%乙醇, 无水乙醇洗涤沉淀、
吹干, 溶于 30~50 µL DEPC-H2O中, 参照TaKaRa反
转录合成试剂盒说明书合成单链cDNA。
1.6 花生叶片基因组 DNA的提取
花生叶片基因组DNA参照陈由强 [11]等的方法
提取。取干净幼叶约 2 g, 加液氮研磨至粉末状, 放
入预冷的、含有 5 mL DNA提取液的 50 mL离心管中
并混匀, 之后加入 500 µL 20% SDS, 于 65℃水浴保
温 30 min, 取出后加入 5 mol L−1 KAc 1 500 µL置冰
上 25 min; 离心、取上清液, 再加入 0.7倍体积的异
丙醇 , 充分混匀 , –20℃沉淀过夜。经离心后回收
DNA沉淀 , 粗提物经溶解后 , 加入 5 mg mL−1的
RNase A 1 µL, 37℃消化 30 min; 经氯仿︰异戊醇抽
提 2次后, 吸取上清液, 加 1/10 倍体积的 3 mol L−1
NaAc (pH 5.2)与 2倍体积无水乙醇, 混匀, –20℃沉
淀 30 min甚至过夜; 经离心、洗涤、干燥后, 沉淀溶
于 10 µL无菌水中, 即为花生叶片基因组DNA。将产
物稀释 10 倍后取 1 µL上样, 经 0.8%琼脂糖凝胶电
泳对所提取的基因组DNA质量进行检测。
1.7 花生 PNDREB1基因的生物信息学分析
利用 http://au.expasy.org/tools/dna.html 网站分
析 PNDREB1 基因的氨基酸组成、理论分子量和等
电点; 利用 http://smart.embl-heidelberg.de/网站进行
基因编码蛋白质的结构功能域分析; 利用 ClustalW
软件进行基因氨基酸序列同源比较及进化树分析。
1.8 PNDREB1 基因的 DNA 结合区及转录激活
区鉴定
利用酵母单杂交系统对 PNDREB1基因的 DNA
结合区及转录激活区进行鉴定。按 One-Hybrid
System (Clontech公司)的说明书转化酵母。
1.9 基因表达模式的半定量 RT-PCR分析
用半定量RT-PCR分析PNDREB1 的组织表达模
式及在诱导条件下的表达情况。以未经处理的花生
叶片RNA、不同处理的叶片RNA, 经反转录后得到
的单链cDNA为模板, 根据基因cDNA序列设计特异
性引物LH14DREB(F)和LH14DREB(R), 扩增片段
长度为 381 bp。PCR体系的总体积为 25 µL, 其中包
含 1 µL第一链cDNA, 上、下游引物各 0.2 µmol L−1,
1×PCR反应缓冲液, 0.2 mmol L−1 dNTP及 1个单位的
Taq DNA聚合酶。反应程序为 94℃预变性 4 min;
94℃变性 45 s, 57℃退火 45 s, 72℃延伸 45 s, 30个循
环后; 72℃延伸 7 min。分别用Actin(F)、Actin(R)作
为上、下游引物来扩增花生, Tubulin作为内标。PCR
产物经 1%凝胶电泳后定量。
2 结果与分析
2.1 PNDREB1基因结构分析
通过随机挑取 10 000余个克隆并进行 5′端测序
分析, 结合对获得序列的功能分类和保守结构域的
预测, 在鲁花 14的不同发育时期未成熟种子的混合
cDNA 文库中, 挑取含有 DREB 基因的 cDNA 克隆
pBluescript SK(+)-O37。该克隆包含随机插入片段
1 136 bp, 该片段中含有一完整的开放阅读框(ORF),
起始密码子在插入位点之后第 99位, 终止密码子在
插入位点之后第 785 位, 推测该编码序列含有 229
个氨基酸残基, 相对分子量为 24.7 kD, 理论等电点
为 5.97。经 http://smart.embl-heidelberg.de/网站进行
蛋白质结构功能域分析 , 显示起始密码子后第
45~108区域含有 DREB类转录因子家族特有的保守
结构域 AP2 区, 故将该基因命名为 PNDREB1(登录
号为 FM955398)。序列分析结合软件预测显示, 该
蛋白序列的第 34~40区域的 N端为碱性氨基酸富集

1976 作 物 学 报 第 35卷

区 (KPRAKKR), 推测其为可能的核定位信号 , 第
125~229区域的 C端为丝氨酸和酸性氨基酸富集区,
推测其为可能的转录激活区, 在转录因子激活下游
基因表达中发挥作用(图 1)。
根据 PNDREB1 基因序列设计其全长特异性引
物 PNDREB1(F)和 PNDREB1(R), 以花生鲁花 14总
RNA反转录后得到的单链 cDNA为模板, 经 PCR扩
增得到 687 bp的特异性条带; 同时以基因组DNA为
模板进行 PCR 扩增也获得大小相同的特异性条带,
表明PNDREB1基因长 687 bp, 编码区内部不含有内
含子。
2.2 PNDREB1 与 AP2/EREBP 家族转录因子的
进化关系
将基因 PNDREB1序列中预测的 AP2区的氨基酸
序列与已知的拟南芥中 DREB1A (AB007787)、
DREB1B (AB007788), 大豆中 GmDREB6 (EF551166)、
GmDREBa (AY542886), 大麦中 HvCBF7 (AY785864),
水稻中 OsDREB1A (AF300970)以及油菜中 BnCBF5
(AF499031)的 AP2 区氨基酸序列进行比对, 结果显示
(图 2), 这些序列间氨基酸同源性较高 , 其中与
HvCBF7 (AY785864)和 GmDREB6 (EF551166)的 AP2
区氨基酸序列同源性可分别高达 83%和 75%。
DREB类转录因子为 AP2/EREBP家族中 4大亚
族之一, 该亚家族可进一步分为 6 个组(A1~A6), 利
用 ClustalW 软件进行系统谱系分析发现 , 花生
PNDREB1与 DREB亚族中 A1组基因的亲缘关系较
近(图 3)。进一步比对发现, 花生 PNDREB1 与大豆
GmDREB6 (EF551166)的同源性可达 57%, 而与大麦
HvCBF7 (AY785864)、拟南芥 DREB1A 和 DREB1B
的同源性分别 51%、42.1%和 44.4%。
2.3 酵母单杂交实验
2.3.1 酵母体内检验 PNDREB1 与 DNA 的结合活力
将 pGAD424-DREB1A(阳性对照)、GAD424-
PNDREB1和 pGAD424空载体(阴性对照)质粒分别转
化含有重复DRE元件的酵母报道子, 观察酵母转化子
在含有及不含有 3-氨基三唑(3-aminotriazole, 3-AT, 一



图 1 PNDREB1基因的核苷酸序列和氨基酸序列
Fig. 1 Nucleotide and amino acid sequences of gene PNDREB1
下画线: AP2/EREBP结构域; 下画双线:可能的核定位信号序列; 虚线：可能的转录激活区; 星号：终止密码子。
Underline: AP2/EREBP domain; Double underline: putative nuclear localization signal; Dot line: putative transcriptional activation
domain; Asterisk: stop codon.
第 11期 张 梅等: 花生中 DREB类转录因子 PNDREB1的克隆及鉴定 1977



图 2 PNDREB1与其他 AP2/EREBP转录因子 AP2保守区的氨基酸序列同源性比较
Fig. 2 Sequence and homology comparison of AP2 DNA binding domain in gene PNDREB1 with other genes of AP2/EREBP tran-
scription factors



图 3 花生 PNDREB1与 DREB亚族中其他基因成员的
系统谱系分析
Fig. 3 Phylogenetic tree analysis of PNDREB1and partical
AP2/EREBP transcription factors
ANT(NP_195489), ABI4(NM_129580), ZmABI4(AY125490),
TINY(NP_197953), TINY2(NM_121197), PNDREB1(FM955398),
RAP2.4(NM_106457), ZmDBF1(AF493800), EREBP1(D38123),
EREBP2(D38126), RAV1(AB013886), RAV2(AB013887), At-
DREB1A(B007787), AtDREB1B(AB007788), At DREB1C
(AB007789), AtDREB2A(AB007790), AtDREB2B
(AB007791), RAP2.1(NP_564496), Glossy15-1
(NM_001061034), and GhDBP1(AY174160).

种组氨酸合成抑制剂)的培养基中的生长情况并进行
显色反应。实验结果如图 4所示, 在不含 3-AT的培养
基中 , 所有酵母转化子都可以正常生长 , 说明
pGAD424-DREB1A、pGAD424-PNDREB1和 pGAD-
424 质粒都已经转入到酵母菌株中(图 4-A), 而在含有
50 mmol L−1 3-AT的SD/His−Ura−Leu−酵母三缺培养基中,
只有含有阳性对照质粒或转入p G A D 4 2 4 - P N D -
REB1 质粒并携有野生型 DRE 元件的酵母菌株才能正
常生长(图 4-B), 并且在 X-gal存在时呈现蓝色(图 4-C);
而仅转入 pGAD424空载体质粒(阴性对照)的酵母菌株,
在含有抑制剂 3-AT 的培养基及显色反应中, 则不能生
长及显色, 呈现阴性结果(图 4-B~C)。表明转入含有基
因 PNDREB1 的载体后, 该基因能够与酵母报道子中
DRE 元件特异性结合, 从而启动下游合成途径, 使酵
母能够正常生长并显色。
2.3.2 PNDREB1 的C-端转录激活功能分析 将
pGBKT7-CPNDREB1、pGBKT7-DREB1A(阳性对照)、
pGBKT7 空载体(阴性对照)分别转化入酵母AH109 菌
株, 结果发现在不含 3-AT的培养基中所有酵母转化子
都可以生长, 说明外源质粒都已转入酵母(图 5-A), 而
只有转入了阳性对照质粒和含有基因羧基端(125~229
氨基酸)可能激活片段的质粒pGBKT7-CPNDREB1 的
酵母报道菌株才能在含有 30 mmol L−1 3-AT的
SD/His−Ura−Trp三缺培养基中生长 (图 5-B), 并且在
X-gal存在时呈现蓝色(图 5-C)。表明PNDREB1的C-末
端片段确实具有转录激活活性。



图 4 酵母体内检验 PNDREB1与 DNA结合的能力
Fig. 4 Analysis of the DNA-binding property of PNDREB1 in vivo

1978 作 物 学 报 第 35卷



图 5 酵母体内检验 PNDREB1的 C-末端的转录激活能力
Fig. 5 Trans-activation activity analysis of PNDREB1 C-terminal in yeast cells

2.4 PNDREB1的表达模式分析
利用RT-PCR检测 PNDREB1在花生不同组织中
的表达情况表明, PNDREB1在花生的根、茎、叶、
花、种子中均有相似程度的表达(图 6)。



图6 利用RT-PCR对PNDREB1在花生不同组织中表达模
式分析
Fig. 6 Expression pattern analysis of PNDREB1 in different
tissues in peanut by RT-PCR

诱导表达模式分析显示, 经短时间(2 h)的胁迫
处理后, PNDREB1 受 4℃低温强烈诱导, 表现为基
因表达水平成倍、迅速增加, 且随循环数的增加而
增强; 该基因也对 PEG 处理引起的渗透胁迫产生响
应, 处理后基因表达水平改变, 并随循环数增加而
增强, 显示该基因同时也受干旱的诱导, 但被诱导
程度低于受低温诱导的程度; 结果还显示, 该基因
的表达不受 ABA的诱导, 且在高盐处理后其表达程
度略受抑制(图 7)。
3 讨论
1998 年, Liu等[2]利用酵母单杂交方法分别从低
温和干旱处理的拟南芥cDNA文库中克隆到 5 个
DREB类转录因子, 即DREB1A、DREB1B、DREB1C、
DREB2A和DREB2B, Northern杂交结果显示它们会
以某种方式参与胁迫信号的应答途径。王平荣等[12]
报道的含AP2 区的转录因子序列比较分析发现, 该
类转录因子的编码序列中都不存在内含子。本研究
克隆了一个包含DREBs家族特异的AP2/EREBP保守
区 的 、 可 能 的 DREBs 类 转 录 因 子 家 族 成 员
PNDREB1。它与已知DREBs类转录因子基因一样 ,
在植物抗逆过程中发挥作用。而含AP2 区的转录因
子序列中不存在内含子, 表明该类转录因子基因转
录后不存在剪辑过程, 推测他们在满足基因快速响
应胁迫刺激并做出反应, 进而调控下游相关基因表
达、调节细胞及植物个体适应外界环境变化方面 ,
具有一定优势。
Okamuro等[1]报道指出, 位于DREB类转录因子
基因内部的AP2/EREBP保守区第 14 位缬氨酸(V14)
和第l9 位谷氨酸(El9)在DREB亚族中非常保守, 尤
其是第 1 4 位缬氨酸 , 在决定D R E B转录因子



图 7 利用 RT-PCR分析 PNDREB1的诱导表达模式
Fig. 7 Expression pattern induced by PNDREB1 analyzed with RT-PCR

第 11期 张 梅等: 花生中 DREB类转录因子 PNDREB1的克隆及鉴定 1979

与DRE顺式作用元件特异性结合中起关键作用。本
文中 , 对所获得基因PNDREB1 内部的AP2/EREBP
保守区分析显示, 其第 14位和第l9位分别为缬氨酸
和谷氨酸 , 与已知AP2/EREBP保守区的特征相一
致。2002年, Sakuma等[13]对拟南芥AP2/EREBP家族
中所有 145 个转录因子进行了分析, 根据DNA结合
结构域的序列比对结果, 把这些转录因子分成了 4
个大的亚族 , 并进一步将DREB亚族分成 6 个组
(A1~A6), 在这 6组中除了对A1组和A2组的成员研
究的较多, 其功能也相对比较清楚外, 对其他组成
员研究较少。由于DREB转录因子能够识别并结合干
旱应答元件DRE, 从而对干旱、高盐、低温耐性相
关基因的表达进行调控, 故其功能通常被认为与植
物的耐逆性有关, 同时还推测它们还可能以某种方
式、通过某种途径参与植物分化和发育的其他过程。
进化树分析显示, PNDREB1与A1组的DREB转录因
子基因具有更近的亲缘关系。笔者初步认为
PNDREB1 为花生中新发现的一个DREB类转录因
子。PNDREB1 氨基酸序列与大豆中已知DREB类基
因GmDREB6 (EF551166)的相似性最高 , 认为这与
花生与大豆同属豆科植物, 亲缘关系较近有关。
作为在酵母双杂交的基础上衍生过来的酵母单
杂交系统 [14-15] , 可在酵母细胞内研究真核细胞的
DNA——蛋白质相互作用, 解决了体外实验代表性
差的问题, 具有更高的代表性及灵敏度。自 20世纪
90 年代以来, 已被广泛应用于各个领域的科学研究
中。而在植物研究方面, 自Liu等[2]1998 年在拟南芥
中利用酵母单杂交技术发现与脱水响应元件
DRE/CRT特异结合的转录因子DREB之后, 该系统
已成为分析并鉴定植物中转录因子种类及功能的有
效手段。本文利用酵母单杂交系统 , 表明在体内
PNDREB1 转录因子的AP2/EREBP结构域能够与
DRE元件特异性结合, 进而激活下游报道基因的表
达, 合成组氨酸, 使酵母转化子能够在含有组氨酸
合成酶抑制剂的情况下正常生长。也证明前文提到
的PNDREB1 序列中的两个特征氨基酸位点是与
DRE作用元件相互结合的关键位点。同时证明位于
PNDREB1 的 C-端酸性氨基酸和丝氨酸富集区为
PNDREB1激活区, 包含有该片段的质粒及已知具有
转录激活能力的阳性质粒转化入酵母菌株中均可激
活下游基因的表达进而产生显色反应, 而仅转入空
载体的酵母菌株则不能正常生长。也进一步证实了
基因 PNDREB1为 DREBs类转录因子。
基因的表达情况与基因行使的功能密切相关。
花生 PNDREB1 为组成型表达。推测该基因在植物
生长发育中具有重要作用。已知的 DREBs类转录因
子, 前人的研究证明其作为干旱、低温及盐害等非
生物胁迫下的主要响应因子, 在植物抗逆能力综合
改良中具有重要作用[5]。Jaglo等[16]在油菜中导入拟
南芥基因DREB1A/CBF3、DREB1B/CBF1、DREB1C/
CBF2后, 油菜的耐寒性明显提高; 2007年, Chen等
[17]用大豆转录因子GmDREB2 转化拟南芥, 干旱处
理(19 d不浇水)后野生型全部死亡, 而转基因植株的
成活率可高达 45.9%, 证明转基因植株抗旱能力有
明显提高。本文表明, PNDREB1受低温和干旱强烈
诱导, 表现与其他DREBs类转录因子相似的表达模
式, 推测它作为DREBs类转录因子家族成员, 也参
与低温及干旱的信号转导; 但该基因对高盐、ABA
处理后的响应较弱, 推测PNDREB1可能参与不依赖
于ABA的非生物胁迫应答过程。目前该基因的正义、
反义转基因烟草及水稻材料都已经获得, 我们将对
其生理功能等方面做进一步研究。
4 结论
从花生中分离到 DREB 类转录因子的基因
PNDREB1。它具有 DREB家族成员基因结构的特征,
可与DREB特异识别元件DRE相结合, 且其 C-末端
具有激活活力。该基因受低温诱导强烈迅速表达 ,
推测其在逆境信号传导及植物抗逆过程中起重要
作用。

致谢: 清华大学生物系刘强教授所提供的用于鉴定
DREB 类转录因子的酵母单杂交系统, 使得本研究
工作得以顺利进行。
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