全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(9): 15921596 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家公益性行业(农业)专项(201103005), 福建省省长基金项目(Sbxd0903)和福建省公益类专项(2009R10035-10)科技经费资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 林新坚, E-mail: xinjianlin@163.net
第一作者联系方式: E-mail: cjfrom2005@yahoo.com.cn, Tel: 13950213337, 0591-87836147
Received(收稿日期): 2011-01-11; Accepted(接受日期): 2011-04-27; Published online(网络出版日期): 2011-06-13.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20110613.1450.003.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.01592
紫云英 SSR分子标记的开发及在品种鉴别中的应用
陈 坚 1 张 辉 2 朱炳耀 1 林新坚 2,*
1 福建省农业科学院生物技术研究所, 福建福州 350003; 2 福建省农业科学院土壤肥料研究所, 福建福州 350013
摘 要: 利用生物素标记的(AG)15、(CT)15、(AC)15、(GT)15 探针及链霉素亲和磁珠, 从紫云英的基因组中富集微卫
星(SSR)序列。在用富集片段构建插入文库的 950 个转化子中, 经 PCR 检测及测序共得到 127 个 SSR 序列, 微卫星
序列的富集效率达 15.8%。除去重复或无效的序列, 得到 33个序列用于引物设计。对征集的 9个紫云英品种进行多
态性分析, 有 6对引物扩增出明显且稳定的多态性位点 18个。在紫云英的品种水平上, 这些 SSR位点产生的多态率
为 50%~100%, 有效等位基因数为 1.19~1.64, Nei氏遗传多样性为 0.13~0.38, Shannon多态信息指数为 0.22~0.56; 利
用这 6对引物可将参试品种完全区分开, 证明这些 SSR位点可用于紫云英品种的指纹鉴别。根据 SSR位点的相似性
系数,将 9个紫云英品种主要聚成两个类群, 与传统按生育期的紫云英品种划分结果无必然的联系。
关键词: 紫云英; 微卫星序列(SSR); 遗传多样性; 链霉素亲和磁珠; 品种鉴别
Development of Microsatellite Markers for Astragalus sinicus L. and Its Appli-
cation for Variety Identification
CHEN Jian1, ZHANG Hui2, ZHU Bin-Yao1, and LIN Xin-Jian2,*
1 Institute of Biotechnology, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350003, China; 2 Institute of Soil and Fertilizer, Fujian Academy of
Agricultural Sciences, Fuzhou 350013, China
Abstract: Astragalus sinicus L. is a traditional green manure used in rice field in China. To identify Astragalus sinicus L. varieties
in agricultural production, we developed SSR molecular markers by using biotinylated (AG)15, (CT)15, (AC)15, (GT)15 probes and
streptavidin coated magnetic beads, the SSR sequences were enriched from A. sinicus genome. Of the 950 transformants selected
from the library constructed by obtained fragments, 127 clones were confirmed as SSR insert by PCR identification and final se-
quencing, with a SSR enrichment efficiency of 15.8%. By deleting the duplicated and unavailable sequences, 33 SSR loci were
used for primer design. After nine A. sinicus varieties were sampled for analysis of the genetic diversity based on these SSR prim-
ers, only six SSR primer pairs amplified a total of 18 stable and repeatable polymorphic bands within tested plant samples. At the
level of variety population of A. sinicus, based on these SSR loci we calculated the percentage of polymorphic band ranging from
50% to 100%, effective number of alleles ranging from 1.19 to 1.64, Nei’s gene diversity ranging from 0.13 to 0.38, and Shan-
non’s information index ranging from 0.22 to 0.56; the selected six primer pairs could completely distinguish the tested plant
samples, and the application of these SSR loci for fingerprinting identification of variety was proved to be feasible to A. sinicus.
Based on similar coefficient generated from six SSR loci, we clustered nine tested varieties of A. sinicus mainly into two groups,
which had no certain linkage to the traditional classification of variety according to its growth period. The study opened up a
prospect of using SSR molecular marker for genetic analysis, variety identification, and protection of intelligent property in com-
mercial breeding of A. sinicus.
Keywords: Astragalus sinicus L.; Simple sequence repeat (SSR); Genetic diversity; Streptavidin coated magnetic bead; Variety
identification
紫云英 (Astragalus sinicus L.)是豆科 (Legumi-
noseae)黄芪属(Astragalinae)越年生草本植物。作为
我国稻区传统的绿肥作物, 其种植面积在 20 世纪
60~70 年代达稻区面积的 60%~70%, 对粮食增产起
第 9期 陈 坚等: 紫云英 SSR分子标记的开发及在品种鉴别中的应用 1593


过重要作用[1]。然而, 进入 80~90年代, 紫云英生产
规模迅速萎缩, 研究工作一度处于停滞或半停滞状
态。紫云英生产上主要存在品种陈旧、退化、混杂,
生产管理技术失传等诸多问题[2]。近年来, 随着国家
对粮食安全、食品安全以及农业生态环境改善的重
视, 紫云英在稻区的恢复利用也上升到一个新的高
度。为阻止紫云英品种濒临灭绝、混杂、退化的趋
势, 研究人员开展了一系列针对紫云英种质资源的
抢救性保护, 发掘利用及区试对比工作[2-4]。长期以
来紫云英的品种鉴别以生育特性与形态特性为主 ,
由于紫云英异花受粉 , 异交率较高 [5], 以形态与生
长特性的观察描述已难准确地鉴别品种基因型, 所
以快速有效的分子标记技术即成为首选方法。但迄
今为止 , 国内外对紫云英分子标记的研究鲜见报
道。SSR 是一种成熟的分子标记技术, 已广泛应用
到遗传多样性检测、遗传种质鉴定、遗传连锁图谱
构建、基因定位与标记辅助育种等多个领域。但 SSR
标记应用的前提是根据物种已知 DNA 序列设计特
异引物, 才能进行 PCR 扩增。为此研究人员不断设
计出各种策略以开发尽可能多的 SSR引物[6-7]。目前,
有 2个主要途径开发 SSR引物, 一是基于DNA序列
数据设计和发展 SSR 引物, 这对于全基因组序列已
经测序的或者已经拥有丰富 DNA 数据的物种是非
常快捷的途径, 尤其是基于 EST序列的 SSR分子标
记的开发已在多种经济作物展开[8-9]。而对于像紫云
英这样遗传背景复杂或知之甚少或基因组数据有限,
甚至比较缺乏的物种, 利用生物素包被的磁珠富集
法分离微卫星分子标记是另一条效率较高的途径[10],
并已在多种作物上进行了尝试[11-14]。本研究拟通过
后一途经对紫云英现有主要推广品种进行多态性分
析, 证实利用 SSR 标记对紫云英种质资源鉴别的可
行性及有效性。
1 材料与方法
1.1 植物材料
9 个品种均由福建省农业科学院土壤肥料研究所
提供, 分别为闽紫 1号、信阳种、8324411、宁波大桥、
闽紫 6号、8410441、8487711、弋江籽和余江大叶。
1.2 紫云英微卫星序列的生物素亲和磁珠富集
紫云英基因组中 SSR 序列的富集参照文献[11]
中的具体步骤进行, 其中主要改进如下。
1.2.1 紫云英总 DNA 的限制性内切酶的双酶切及
其与黏性接头的连接扩增 以紫云英播种后生长
至 3~4 cm高的幼苗为材料, 采用 CTAB法提取基因
组 DNA, 进行限制性内切酶双酶切处理。将 10 μg
提取的紫云英 DNA, 在 100 μL反应体系中用 10 U
的 EcoR I和 20 U的Mse I (均购自 NEB公司)酶切消
化 3 h, 取 5 μL酶切产物电泳检测酶切效果, 确定消
化完全。消化产物同时分别与针对 EcoR I及 Mse I
末端的单链寡核苷酸制备的接头连接, 对连接产物
进行抽提、扩增及浓缩。EcoR I末端单链寡核苷酸
Primer 1为 5′-CTCGTAGACTGCGTACC-3′, Primer
2为 5′-AATTGGTACGCAGTCTAC-3′; Mse I末端单
链寡核苷酸 Primer 1为 5′-GACGATGAGTCCTGAG-
3′, Primer 2为 5′-TACTCAGGACTCAT-3′。
1.2.2 用亲和磁珠富集紫云英基因组中特定的 SSR
序列 按文献步骤分别采用生物素标记的微卫星
探针(CT)15、(AG)15、(GT)15、(AC)15 与紫云英基因
组 DNA酶切连接片段杂交。而后应用 Invitrogen公
司的Dynal链霉素亲和磁珠M-280捕获 300~1 500 bp
含有微卫星序列的 DNA 片段, 连接到 pMD18-T 载
体中, 构建富集微卫星序列小片段的插入文库。利
用接头引物和根据微卫星核心序列设计的引物使用
PCR 直接对文库筛选 , 从转化子中获得阳性克隆 ,
对其测序分析, 确认获得含有微卫星序列的片段。
1.3 SSR 引物的设计及其对基因组中微卫星序
列的 PCR扩增
分析得到的 SSR 序列, 筛出序列两翼均存在较
长碱基段(>20 bp)的 SSR位点。用 Premier Primer 5.0
软件结合人工设计特异引物对, 使它们的退火温度
基本一致。用引物对 9 个紫云英品种的 DNA 进行
PCR 扩增, 以筛选在参试品种中可形成多态性的引
物序列。25 μL的 PCR反应体系中包括提取的 DNA
溶液 1 μL, 10 nmol L−1引物 2 μL, 2.5 mmol L−1 dNTP
2 μL, 10×PCR buffer 2.5 μL, Taq DNA聚合酶 1 U。
PCR反应程序为, 94℃预变性 7 min; 随后 30个循环,
每个循环 94℃变性 30 s, 55℃退火 30 s, 72℃延伸 30 s;
最后 72℃延伸 7 min。扩增产物在 6.0%非变性聚丙
烯酰胺凝胶中电泳(电泳缓冲液 1×TBE, 电压 150 V,
时间 2 h), 电泳结束后对凝胶进行固定、 0.1%
AgNO3染色、显色, 再观察、照相、读带。
1.4 筛选 SSR位点的多态性分析
根据条带的有无分别记为“1”和“0”, 构建二元
数据矩阵, 将 SSR 的二元数据等同看待为同一位点
上的不同等位基因形式。应用 Popgene32 软件在假
定种群处于 Hardy-Weinberg 平衡状态下 , 对每个
1594 作 物 学 报 第 37卷

SSR序列分别计算多态位点百分率 PPB (percentage
of polymorphic band); 观察等位基因数 Na (observed
number of alleles), 有效等位基因 Ne (effective
number of alleles), Nei氏基因多样性指数 H (Nei’s
gene diversity, 1973), Shannon 氏多态信息指数 I
(Shannon’s information index, Lewontin, 1972)。
1.5 参试紫云英品种的聚类分析
用 DPS 统计学软件程序计算 Jaccard 氏遗传距
离, 再以 PGMA (unweighted pair group method with
arithmetic mean, 类平均法)进行聚类分析。
2 结果与分析
2.1 亲和磁珠对紫云英微卫星序列的富集
从 950个用富集片段构建的文库的转化子中, 通
过 PCR反应总共筛选出了 252个可能含有 SSR序列
的阳性克隆, 筛出阳性率为 26.5%。选择其中 212个
阳性克隆测序, 有 127 个测出了 SSR 序列, 检出率
达 60.0%, 总体的微卫星序列的富集效率为 15.8%。
如果考虑生物素标记的不同探针对紫云英基因组
SSR 位点的富集效率, 以测序得到的 SSR 克隆数占
被检测的菌落数为指标, 分别计算出(AC)15 探针效
率为 21.5%、(AG)15为 14.7%、(CT)15为 15.0%、(GT)15
为 15.2%。但如果只考虑最终可用的单一序列 SSR
位点的富集效率, (AC)15 探针的效率仅为 2.8%、而
(AG)15为 7.4%、(CT)15为 3.7%、(GT)15为 3.4%。原
因在于(AC)15富集的 SSR 位点两翼序列的重复率较
高。经过序列比对, 除去这些重复的 SSR 序列以及
由于一端或两端侧翼序列均太短(<20 bp), 而不能
用于引物设计的无效 SSR 序列, 最后仅选出 33个
SSR 位点用于引物设计。占整个 SSR 检出序列的
26%。
2.2 SSR引物对紫云英扩增的多态性
用设计的 33对引物, 对 9个品种的紫云英全基
因组进行筛选。其中 23对引物可以扩增出条带, 但
大多数引物扩增结果没有明显的差异或重复性差。
尤其以 AG为重复单元的 SSR位点在品种间没有多
态性。经筛选确定有 6 对引物条带型清晰、稳定性
强、多态性高。其中的 2个位点的扩增图谱见图 1。
在 Locus 1中参试品种扩增条带≥3条, 扩增的带型
复杂; 而 Locus 2的带型虽然最为简单, 但不似二倍
体植物一样可以直接确定出个体基因型。尽管如此,
经过这 6对引物的扩增, SSR位点在紫云英参试品种
间形成的多态性可将 9个品种完全区分开来, PCR的
电泳结果可用于构建品种间的鉴定指纹图谱。
将扩增出的条带作为显性标记来处理, 我们运
用 Popgene32软件分别计算了所得到的 6个 SSR位
点在参试的 9 个紫云英品种中所形成的多态性指标
(表 1)。这些 SSR位点在所选择的紫云英参试品种间
形成了较高的多态性指数。说明在现有的紫云英推
广品种中, SSR 位点可以从分子水平揭示其基因型
的不同。这将为紫云英的品种鉴定和保护提供可靠
的工具。
2.3 参试的紫云英品种的聚类分析
根据 6 个 SSR 位点所形成的带型的多样性, 对
9 个参试的紫云英品种进行了聚类分析(图 2)。其中
8410441、8487711、8324411 为福建省农业科学院
土壤肥料研究所近年重新挖掘的特色品种, 其余都
是往年曾在全国各地推广的优良地方种。除 8487711
明显不同外, 参试品种主要聚为 2 类。一类包括闽
紫 1号、信阳种和 8410441。8410441的特点是高产,



图 1 2个 SSR位点分别在 9个参试的紫云英品种中扩增的带型
Fig. 1 Band patterns of two SSR loci amplified with PCR among nine tested varieties of A. sinicus
M: 分子量标准; 0: 空白对照; 1~9: 参试的品种。
M: marker; 0: blank control; 1–9: A. sinicus varieties listed in plant material.
第 9期 陈 坚等: 紫云英 SSR分子标记的开发及在品种鉴别中的应用 1595


表 1 SSR位点在参试的紫云英品种中扩增的多态性指标
Table 1 Polymorphic index of SSR loci amplified with PCR among tested varieties of A. sinicus
位点
Locus
重复单元
Repeat
多态位点数 NPL
(多态位点百分数
PPL)
观测等位基因
数 Na
有效等位基因
数 Ne
基因多样性指
数 H
多态性信息指
数 I
1 (CT)4GA(TC)5(CCCTCT)5 5(100.00%) 2.0000±0.0000 1.6488±0.2898 0.3770±0.1182 0.5588±0.1343
2 (CAAAAT)5 2(66.67%) 1.6667±0.5774 1.3715±0.5421 0.2021±0.2622 0.3036±0.3534
3 (CTCTT)3CATATG(CTCTT)3(CTT)2 3(75.00%) 1.7500±0.5000 1.5169±0.5296 0.2736±0.2574 0.3980±0.3448
4 (CA)7CAAA(CA)2 2(50.00%) 1.5000±0.5774 1.3070±0.3856 0.1860±0.2228 0.2780±0.3279
5 (AC)8(AAAC)2 2(66.67%) 1.6667±0.5774 1.3466±0.3139 0.2264±0.2001 0.3480±0.3048
6 (AC)11(GT)106 4(66.67%) 1.6667±0.5164 1.1938±0.3028 0.1280±0.1638 0.2157±0.2325
NPL: number of polymorphic loci; PPL: percentage of polymorphic loci; Na: observed number of alleles; Ne: effective number of
alleles; H: Nei’s gene diversity; I: Shannon’s information index.

但来源不详。信阳种来自河南信阳地区, 闽紫 1号是
福建省农业科学院土壤肥料研究所从四川南充地区
农业科学研究所育成的品系 74(3)104-1 中系统选育
的。另一类的 5个品种中, 浙江种宁波大桥和江西种
余江大叶基因型最近。此外, 闽紫 6号是福建种, 弋
江籽原产安徽芜湖, 而 8324411 是以广西种萍宁 72
为父本, 浙江种 78-1543(80)4-2-2为母本杂交后代中
选育的。可见这个类群的品种均来自长江以南的地区。
传统的紫云英的品种划分是以生育特性为
基础的, 按成熟期可分为早、中、晚 3 个类型。在
参试的推广品种中, 早熟品种有信阳种、闽紫 1号;
中熟品种有余江大叶、闽紫 6 号、弋江籽; 晚熟品
种有宁波大桥 [5]。而品种 8410441、 8487711、
8324411 经田间观测均被认定为中熟种。SSR 位点
揭示了紫云英品种的基因型多样性, 但聚类分析结
果与熟期分类的生态型不完全一致, 这说明紫云英
品种的基因型与其生育期的表现型之间不是简单的
对应关系。



图 2 基于 6个 SSR位点的多态性构建的 9个参试的紫云英品
种的聚类图
Fig. 2 Dendrogram of nine tested varieties of A. sinicus based
on the polymorphic patterns of six SSR loci amplified with PCR
3 讨论
尽管磁珠富集法是一种高效而简单筛选微卫星
的方法, 但也存在两方面问题, 一是要提高磁珠对
SSR 序列吸附的特异性; 二是要尽量避免得到不适
合进行引物设计的 SSR序列, 它包括 SSR序列过于
靠近一端或两端以及出现高度相似序列重复[11-14]。对
前者的解决方法是提高杂交与磁珠洗涤的温度[11-12];
对于后者 , 可采用不同限制性内切酶酶切基因组
DNA, 得到混合型文库。这一设计即可得到富含较
多所需信息的小片段文库, 又可避免因单一酶切造
成的文库中部分片段所含有的微卫星序列距离内切
酶识别位点过近而难以设计引物的情况[14]。但对于
序列重复问题, 一般认为理论上难以避免 [12], 或进
行多次筛选及选择不同克隆以减少重复[11]。我们采
用了高温杂交与洗涤的程序, 并比较单酶切和双酶
切的效果。发现双酶切大幅提高了紫云英基因组富
集效率, 使得在筛选的全部白色菌落中 , 富集到的
SSR位点达 15.8%, 接近文献报道的在 20%左右[11,13]。
但其中仅有 4.1%可进行引物设计 , 低于亚麻的
10.9%[11]以及马尾松的 13.8%[13], 主要由于有的探
针如(AC)15难以避免地得到大量重复的微卫星序列。
在利用 SSR引物对紫云英不同品种分析过程中
发现, 每对 SSR 引物针对参试样品均扩增出较多的
条带(总条带数>3), 产生较为复杂的带型(图 1)。由
于紫云英在植物学方面缺乏研究, 对其染色体的倍
性等问题所知甚少。一般来说, 由于 SSR 标记是一
种共显性标记, 在单倍体与二倍体的植物中, 它的
带型的表现型即可反映等位基因的基因型。但在多
倍体的植物中, 复杂的带型与基因型关系正在探讨
之中[15]。根据现有 SSR位点所产生的带型, 我们推断
紫云英是多倍体。但对于紫云英的品种鉴别而言, 复
1596 作 物 学 报 第 37卷

杂的带型形成的指纹图谱却是品种识别的有力依据。
对紫云英品种进行聚类分析时, 我们采用显性
标记的方法来处理 SSR带型。利用显性标记的 1, 0
二元数据, 可以将 9 个参试品种聚为主要的 2 个群
体。但这 2 个聚类群与目前生产上利用生育期对品
种划分的结果之间无必然联系。长期以来, 由于全
国范围内不同地域来源种质间的相互交流; 加上研
究工作的时续时断, 使得现有紫云英品种及其育种
谱系记载资料缺乏, 这一切均给品种亲缘关系的分
析工作造成了困难。但我们在开发紫云英 SSR标记
方面却打开了一个崭新的局面。以此为基础, 我们
可利用不断得到的 SSR标记对国内的品种资源进行
更大规模的分析溯源, 并用以指导紫云英种质资源
的保护及品种的开发创新工作。
4 结论
选择生物素标记的、2个碱基为重复单位的寡聚
核苷酸探针与紫云英基因组酶切片段杂交, 再用链
霉素亲和磁珠富集杂交片段, 得到了紫云英的 SSR
序列片段。利用得到的 33个 SSR位点, 设计引物对
紫云英不同地域来源的品种进行了多态性分析。其
中有 6 对引物在不同的品种间扩增出了明显的多态
性条带。
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