全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2010, 36(2): 249−255 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2006AA10A104)资助。
*
通讯作者(Corresponding authors): 曲志才, E-mail:zcqu@mail.qfnu.edu.cn; 孔秀英, E-mail: xykong@mail.caas.net.cn
第一作者联系方式: E-mail: dawei-2009@163.com
Received(收稿日期): 2009-05-06; Accepted(接受日期): 2009-07-11.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2010.00249
小麦白粉病菌诱导的 TaWRKY34基因的鉴定与分析
秦 伟 1,2 赵光耀 2 曲志才 1,* 张立超 2 段佳磊 2 李爱丽 2 贾继增 2
孔秀英 2,*
1曲阜师范大学生命科学学院, 山东曲阜 273165; 2中国农业科学院作物科学研究所 / 农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程 /
农业部作物种质资源利用重点开放实验室, 北京 100081
摘 要: WRKY转录因子在植物抗病防卫反应中发挥重要作用。利用 cDNA宏阵列(macroarray)和 RT-PCR相结合的
方法, 从小麦全长 cDNA文库的WRKY转录因子中筛选出一个应答小麦白粉病菌胁迫的 TaWRKY34转录因子, 该基
因编码 464个氨基酸。染色体定位分析表明, 该转录因子位于小麦第一同源群染色体的短臂上, 并且只在细胞核中表
达。其蛋白序列与拟南芥、大麦和葡萄抗病相关 WRKY 转录因子的亲缘关系较近, 与其中的 3 个 WRKY 基因具有
相似的表达模式。TaWRKY34 在 Pm16/北京 8377抗白粉病近等基因系中, 对小麦白粉病菌、水杨酸和茉莉酸诱导的
表达模式存在差异。TaWRKY34可能与小麦对白粉菌的抗性有关。
关键词: 小麦; 白粉病菌; WRKY转录因子; 染色体定位; 表达模式
Identification and Analysis of TaWRKY34 Gene Induced by Wheat Powdery
Mildew (Blumeria graminis f. sp. tritici)
QIN Wei1,2, ZHAO Guang-Yao2, QU Zhi-Cai1,*, ZHANG Li-Chao2, DUAN Jia-Lei2, LI Ai-Li2, JIA Ji-Zeng2,
and KONG Xiu-Ying2,*
1 College of Life Science, Qufu Normal University, Qufu 273165, China; 2 Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement / Key
Laboratory of Crop Germplasm Resources and Utilization, Ministry of Agriculture / Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sci-
ences, Beijing 100081, China
Abstract: WRKY transcription factors play important roles in plant defense signaling network. However, little is known about the
biological roles of WRKY proteins in wheat (Triticum aestivum L.). The objectives of this study were to screen WRKY transcrip-
tion factor genes conferring resistance to powdery mildew (Blumeria graminis f. sp. tritici, Bgt) and disclose their function in
wheat defense reaction. A WRKY transcription factor gene, TaWRKY34, was identified in response to Bgt by cDNA macroarray
and semiquantitative RT-PCR from the wheat full-length cDNA libraries that were constructed in the authors’ earlier studies. This
gene encodes 464 amino acid residues. TaWRKY34 was mapped onto short arms of chromosome 1B and 1D through blast search
GrainGenes database and homemade full length cDNA library database of Aegilops tauschii. A further experiment indicated that
TaWRKY34 also exists on chromosome 1AS through amplifying in Langdon D-genome disomic substitution lines and Chinese
Spring nulli-tetrasomic lines with gene specific primers. Examining the subcellular localization of TaWARKY34, its coding region
was fused to the 3′ end of green fluorescent protein (GFP). The GFP signal was detected only in the nucleus of onion epidermal
cells to transiently express TaWRKY34-GFP, and the control-GFP protein distributed ubiquitously in both nuclei and cytoplasm.
This suggests that TaWRKY34 is a nucleus-localized protein. Multiple sequence alignments of 57 WRKY domains from various
species indicated that TaWRKY34 is closely related to WRKY transcription factors in response to pathogens in Arabidopsis
thaliana (AtWRKY3, AtWRKY4, and AtWRKY33), Hordeum vulgare (HvWRKY42 and HvWRKY46), and Vitis vinifera
(VvWRKY2) with identities ranging from 81.8% to 94.5%. Furthermore, TaWRKY34 has similar expression pattern with three
sequences from A. thaliana, which was up-regulated at first and then down-regulated when inoculated with pathogens. The ex-
pression profiles of TaWRKY34 induced by powdery mildew fungus, salicylic acid, and jasmonic acid were different between
Pm16/Beijing 8377 near-isogenic lines (resistant to Bgt) and Beijing 837 (susceptible to Bgt). The results imply that TaWRKY34 is
probably related to the resistance to powdery mildew in wheat.
Keywords: Wheat; Blumeria graminis f. sp. tritici; WRKY transcription factor; Chromosome location; Expression pattern
250 作 物 学 报 第 36卷
WRKY转录因子是近年来在植物中发现的一类
锌指型转录因子基因家族, 因在其序列的 N 端含有
高度保守的 WRKYGQK氨基酸序列而得名。WRKY
转录因子能够与 C/TTGACC/T 序列(W-box)发生特
异性结合, 从而调节基因的表达[1-2]。研究表明, 在
拟南芥中约有 68%(49/72)的WRKY转录因子参与抗
病防卫反应, 它们中既有正调控因子, 也有负调控
因子, 形成一个复杂的抗病调控网络[3-4]; 在水稻中,
OsWRKY3、OsWRKY4、OsWRKY7、OsWRKY13、
OsWRKY31、OsWRKY45、OsWRKY71和 OsWRKY89
分别参与了白叶枯和稻瘟病等的抗病防卫反应[5-12];
在大麦中, 有 10 个 WRKY 转录因子基因在受到白
粉菌诱导后发生表达量的变化, 其中 HvWRKY1 和
HvWRKY2调控大麦对白粉菌的抗病反应[13-14]。由此
可见, WRKY 转录因子在植物对病原菌的抗病防卫
反应中具有重要的作用。
小麦白粉病是危害小麦生产的主要病害之一。
虽然人们已对小麦白粉病菌(Blumeria graminis f. sp.
tritici, Bgt)的侵染过程及抗病机制进行了一些研
究[15-17], 但目前尚未见小麦WRKY转录因子与小麦
白粉病菌相互作用关系的报道。本研究对本实验室
小麦全长 cDNA文库中的WRKY转录因子基因进行
小麦白粉病菌侵染条件下的表达分析, 筛选可能参
与小麦抗白粉病反应的WRKY转录因子基因, 以期
为深入研究 WRKY 转录因子在小麦抗病防卫反应
中的作用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
本实验室在前期试验中, 以感白粉病品种北京
837 为轮回亲本培育了抗白粉病近等基因系 Pm16/
北京 8377。本试验中, 将北京 837和 Pm16/北京 8377
播于营养钵中, 在 22℃光照培养箱中长至三叶一心
期, 用北京地区流行的白粉病菌生理小种 E15 喷施
法接种足量的白粉菌并保湿。于 0 h和处理后 2、4、
12、24、32和 48 h取叶片用于生物胁迫实验。
水杨酸和茉莉酸分别介导活体营养型病原菌和
死体营养型病原菌抗性的应答途径。为探明
TaWRKY34 在抗病和感病近等基因系中的表达模式,
将北京 837和 Pm16/北京 8377用MS培养液培养, 在
22℃光照培养箱中生长至三叶一心期 , 分别用 2
mmol L−1水杨酸(Sigma公司)和 100 mmol L−1茉莉酸
甲酯(Sigma 公司)喷洒小麦幼苗的叶片至形成液滴
滴下为止, 于 0 h和处理后 0.5、2、4、6、12和 24 h
取叶片用于非生物胁迫实验。
用于染色体定位分析的材料 Langdon 及其 1A
和 1B的代换系 LDN1D(1A)和 LDN1D(1B)由 Steven
S. XU 博士 (USDA-ARS, Northern Crop Science
Laboratory)提供 ; 中国春及其缺体 -四体材料
CSN1AT1B、CSN1BT1A和 CSN1DT1A由本室保存。
1.2 cDNA宏阵列膜的制备
从本实验室小麦全长 cDNA 数据库中搜索得到
WRKY 转录因子基因序列 76 条 , 将其命名为
TaWRKY1至 TaWRKY76。然后从全长 cDNA文库中
挑选相应的 cDNA克隆并提取质粒,将质粒浓度调整
至约为 100 ng µL−1, 保存于 384孔板中。利用 Q-Pix
(GENETIX) 将 质 粒 转 移 到 Hybond-N+ 尼 龙 膜
(Amersham Biosciences公司)上, 每个克隆点 4个重
复, 形成边长为 1.75 mm 的正方形, 不同克隆间距
离为 2.25 mm。以小麦 Tubulin 基因作为阳性对照,
水作为阴性对照, 与WRKY转录因子的质粒同时点
到尼龙膜上。自然风干后, 放在变性液(0.4 mol L−1
NaOH, 1 mol L−1 NaCl)中变性 15 min, 再在中和液
0.5 mol L−1 Tris-HCl (pH 7.2), 1 mol L−1 NaCl中浸泡
15 min, 最后用蒸馏水漂洗 3 min。将膜放到滤纸上
晾干, 4℃保存备用。
1.3 cDNA宏阵列杂交和扫描
取接种白粉病菌后不同时间段的 Pm16/北京
8377小麦幼苗叶片提取总 RNA, 利用反转录法标记
探针。采用 20 µL反应体系, 在 0.2 mL离心管中加
入 1 µg总RNA和 1 µL Oligo(dT)18 (500 µg mL−1), 再
加 DEPC-ddH2O至 8 µL。将上述混合物混匀, 65℃
水浴 5 min, 冰水浴中速冷。然后依次加入 4 µL
5×First-Strand buffer、2 µL DTT (0.1 mol L−1)、1 µL
dNTP混合物(含 dATP、dTTP和 dGTP, 均为 10 mmol
L−1)、1 µL RNasin (40 U µL−1)、3 µL α-[32P] dCTP (10
µCi µL−1, 北京福瑞生物工程公司), 1 µL Supper-
Script II Reverse Transcriptase (200 U µL−1, Invitrogen
公司), 用枪头吹吸混匀, 短暂离心后, 42℃温浴 1 h。
在上述混合物中加入 30 µL 1×TE, 然后加入 5
µL NaOH (3 mol L−1)变性 5 min, 将点有WRKY转录
因子的尼龙膜放到杂交管中 , 加入 10 mL Church
buffer预杂交液[1%BSA, 10 mmol L−1 EDTA (pH 7.0),
0.5 mol L−1 Na2HPO4 buffer (pH 7.2), 7% SDS]和变
性鲑精 DNA(终浓度为 100 µg mL−1)。在杂交炉中
65℃预杂交 6 h。然后加入变性的探针, 65℃杂交 16
第 2期 秦 伟等: 小麦白粉病菌诱导的 TaWRKY34基因的鉴定与分析 251
h。将杂交后的尼龙膜分别放在 2×SSC和 0.5%SDS、
1×SSC和 0.5%SDS、0.5×SSC和 0.5%SDS洗膜液中
65℃各洗涤两次, 每次 5 min, 洗完后放入暗盒中覆
盖磷屏曝光 2~3 d, 用 Molecular Imager FX (Bio-
Rad)扫描磷屏。
1.4 TaWRKY34的表达分析
分别取生物和非生物胁迫的小麦幼苗叶片提取
总 RNA。采用 SuperScript II反转录酶(Invitrogen公
司)合成 cDNA第一链。采用 25 µL半定量 RT-PCR体
系, 取 1 µL cDNA作模板, 所用引物为 TaWRKY34F:
5′-GCTGCCGGCGACATCTTCCT-3′, TaWRKY34R:
5′-GTCCCGGGGCTCGTCCTTGGTG-3′, 扩增条件
为 94 5 min; 95 30 s, 55 30 s, 72 40 s, 32℃ ℃ ℃ ℃ 个
循环; 72 5 min℃ 。设 2次重复。以小麦 Tubulin基因
作为内参, 反应程序运行 30个循环, 其他条件同上。
1.5 不同物种 WRKY 转录因子的聚类分析及
TaWRKY34表达模式分析
从NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载
文献中已经报道的病原菌胁迫应答的其他物种
WRKY 转录因子的全长蛋白质序列 , 包括来自大
麦[13-14]、水稻[5-12]、拟南芥[3-4,18]、辣椒[19]、葡萄[20]、
马铃薯[21]、烟草[22]的共 57 条序列。将上述 WRKY
转录因子的氨基酸序列用 ClustalX 2.0.9软件进行序
列比对[23], 利用 Jalview 2.0 软件[24]调整比对结果,
各自取包含 WRKY 保守结构域的大约 50 个氨基酸
的区段再次进行序列比对, 最后利用 MEGA 4.0 软
件[25]进行系统进化树构建; 将与 TaWRKY34 处于同
一个进化分支的 WRKY 转录因子进行表达模式比
较分析。
1.6 TaWRKY34 的染色体定位分析
通过搜索GrainGenes (http://wheat.pw.usda.gov/)
中已经定位的 EST序列, 对 TaWRKY34 进行初步的
电子定位; 然后再根据本室小麦全长 cDNA 序列的
比对分析 , 设计 TaWRKY34 基因组特异的引物
W34F: 5′-GAGCAACAACAAGAAGAAGTGGTTC-
3′, W34R: 5′-GTTGTCACCATGCTCCTTCC-3′, 利
用 Langdon及其 1A和 1B的代换系、中国春及其缺
体-四体材料进行染色体定位。PCR扩增条件为 94 ℃
5 min; 95 45 s, 61 45 s, 72 1.5 min, 34℃ ℃ ℃ 个循环;
72 10 min℃ 。用 1%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR扩增
产物。
1.7 TaWRKY34的亚细胞定位
亚细胞定位所用表达载体为 pJIT163-PEG, 该
载体通过 35S 启动子驱动目标基因与绿色荧光蛋白
(GFP)基因融合表达, 实现目标基因的亚细胞定位。
设计引物 34-GFPF：5′-AAGCTTATGTCCTCCTCCA
CGGG-3′ (前 6 个碱基为 Hind III 酶切位点), 34-
GFPR： 5′-GGATCCGCAGAGGAGCGACTCGAC-3′
(前 6 个碱基为 BamH I 酶切位点), 扩增 TaWRKY34
基因的编码区序列, 经测序验证后, 进行 Hind III和
BamH I 的双酶切, 回收产物与同样进行双酶切的
pJIT163-PEG 载体连接, 并转化大肠杆菌感受态细
胞, 挑单克隆进行质粒提取, 经酶切、测序验证后用
于后续转化试验。将含有目标基因的融合表达载体
和空载体 pJIT163-PEG 通过基因枪(Bio-Rad)轰击转
化洋葱表皮细胞, 转化后的洋葱表皮细胞避光培养
24 h, 用激光共聚焦显微镜观察照相(Leica)。
2 结果与分析
2.1 白粉病菌诱导的小麦WRKY转录因子的鉴定
以白粉病菌侵染后不同时间段的 Pm16/北京
8377小麦幼苗叶片的总RNA反转录后所得 cDNA作
探针, 与点有小麦WRKY转录因子的尼龙膜进行杂
交(图 1), 可以看出 TaWRKY34 (B3位置, 该 WRKY
转录因子为 TaWRKY34)受白粉病菌诱导后表达量显
著上调, 在 32 h时表达量达到最高。用 Quantity one
(Bio-Rad)软件进行表达量变化分析, TaWRKY34 在
32 h相对于 0 h表达量上调超过 5倍, 其他 WRKY
转录因子表达量变化都不如 TaWRKY34显著。
半定量 RT-PCR结果显示, TaWRKY34在白粉病
菌诱导后表达量上调, 在诱导后 32 h表达量达到最
高, 随后表达量开始下调(图 2), 这与 cDNA 宏列阵
杂交结果一致。同时发现 TaWRKY34 在白粉病近等
基因系中本底表达水平存在明显差异, 在抗病系中
的本底表达量很低, 而在感病系中则很高; 抗感近
等基因系在受到白粉病菌诱导后, TaWRKY34 的表
达量变化趋势也完全不同, 在抗病系中表现为受诱
导后上调表达, 而在感病系中表现为受诱导后表达
受到抑制。
2.2 水杨酸和茉莉酸诱导的 TaWRKY34 的表达
分析
水杨酸和茉莉酸处理后, TaWRKY34 在抗病和
感病近等基因系中表现出不同的表达模式(图 3)。在
Pm16/北京 8377(抗病)中 TaWRKY34受水杨酸和茉莉
酸诱导后表达量变化趋势基本相同, 均表现为先上
调, 6 h和 4 h后下调, 24 h再上调; 而在北京 837(感
病)中诱导前后的表达量没有明显变化。
252 作 物 学 报 第 36卷
图 1 以小麦白粉病菌 E15诱导 Pm16/北京 8377不同时间段的叶片 RNA反转录产物为探针的 cDNA宏阵列杂交
Fig. 1 cDNA macroarray hybridization with probes prepared from total RNAs isolated from time course leaves of Pm16/Beijing 8377
induced by wheat powdery mildew strain E15
小麦 Tubulin基因(N5)作为内对照, 阴性对照为水(P5)。
Wheat Tubulin gene (N5) was used as internal control. Distilled water was used as the negative control (P5).
图 2 小麦白粉病菌 E15诱导的 TaWRKY34在小麦抗白粉病近
等基因系中的半定量 RT-PCR分析
Fig. 2 Expression analysis of TaWRKY34 by semiquantitative
RT-PCR in near isogenic lines under wheat powdery mildew
strain E15 infection
2.3 TaWRKY34 基因与其他物种抗病相关
WRKY转录因子的聚类和表达模式分析
TaWRKY34 在本实验室小麦全长 cDNA 数据库
中序列长度为 1 579 bp, 其中 ORF为 1 395 bp, 编码
464个氨基酸。其编码产物 TaWRKY34与多个拟南
芥、水稻、大麦、辣椒、葡萄和烟草中参与病害胁
迫的 WRKY 转录因子序列同源性较高(图 4)。与同
一进化分树分支的 AtWRKY3、 AtWRKY4、
AtWRKY33、VvWRKY2、HvWRKY42和 HvWRKY46
保守结构域的同源性分别为 81.8%、83.6%、94.5%、
83.6%、87.3%和 89.1%。根据文献中的芯片杂交和
半定量 RT-PCR数据[13,26-27], 将 TaWRKY34与它们受
病原菌诱导后的表达模式进行比较, 发现 TaWRKY34
的表达模式与病原菌诱导后的 AtWRKY3、AtWRKY4
和 AtWRKY33 表达模式相似, 但与 HvWRKY42 和
HvWRKY46不同(图 5)。
2.4 TaWRKY34的染色体定位
将 TaWRKY34的全长 cDNA序列与 GrainGenes
上已经定位的 7 104 条 EST 序列进行比对分析, 得
到一条与 TaWRKY34基因序列同源性为 96%的 EST
图 3 水杨酸和茉莉酸胁迫下 TaWRKY34在小麦抗白粉病近等基因系中的半定量 RT-PCR分析
Fig. 3 Expression analysis of TaWRKY34 by semiquantitative RT-PCR in the near isogenic lines under salicylic acid and methyl
jasmonate stresses
第 2期 秦 伟等: 小麦白粉病菌诱导的 TaWRKY34基因的鉴定与分析 253
图 4 TaWRKY34与其他物种中参与病原菌胁迫应答WRKY转
录因子蛋白序列的聚类分析
Fig. 4 Phylogenetic analysis of TaWRKY34 with WRKY pro-
teins involved in pathogen stress from other species
Ta: 小麦; Hv: 大麦; Os: 水稻; At: 拟南芥; Vv: 葡萄; St: 马铃
薯; Ca: 辣椒; Nt: 烟草。
Ta: Triticum aestivum; Hv: Hordeum vulgare; Os: Oryza sativa; At:
Arabidopsis thaliana; Vv: Vitis vinifera; St: Solanum tuberosum; Ca:
Capsicum frutescens; Nt: Nicotiana tabacum.
序列(登录号为 BG607042), 该 EST 被定位在小麦
1B 染色体的短臂上。进一步对该 EST (BG607042)
的 Southern 杂交图进行分析, 发现其中有一条杂交
带未被定位 , 而且杂交信号的强度是已被定位到
1BS 染色体的那条杂交带的 2 倍, 这表明 1AS 和
1DS染色体上可能存在 TaWRKY34的拷贝。通过对
本室小麦全长 cDNA 文库的检索比对, 获得了来自
六倍体小麦祖先种Aegilops tauschii (DD)的序列, 说
明小麦 D基因组中也存在 TaWRKY34的拷贝。为了
确定 TaWRKY34 是否在小麦的 1A 染色体上也有拷
贝, 利用 TaWRKY34 基因组特异引物 W34F/R, 在
Langdon及其 1A和 1B的代换系、中国春及其缺体-
四体材料中进行 PCR扩增(图 6), TaWRKY34也被定位
在小麦 1A染色体上。综合上述结果, 推断 TaWRKY34
存在于小麦第一同源群染色体的短臂上。
2.5 TaWRKY34的亚细胞定位
通过基因枪轰击, 在洋葱表皮中瞬时表达融合
GFP 基因的 TaWRKY34。结果显示, TaWRKY34 和
GFP 的融合蛋白定位于细胞核中(图 7-A), 而空载
体对照 GFP 则分布于整个细胞中 (图 7-B), 表明
TaWRKY34 只在细胞核中表达, 这与转录因子的功
能是一致的。
3 讨论
植物在受到外界伤害以后, 会迅速启动自身的
生化防卫系统, 通过水杨酸和茉莉酸等防卫反应信
号途径激活植物防卫基因的表达, 使植物表现出对
生物和非生物胁迫的抗性反应。水杨酸和茉莉酸分
别介导活体营养型病原菌和死体营养型病原菌两条
不同的防卫应答信号途径, 这两条信号途径在多数
情况下是相互拮抗的[28-29], 但在有些情况下是协同
作用的。Schenk等[30]在拟南芥中发现了大量受水杨
酸和茉莉酸诱导协同表达的基因。Peng等[31]发现棉
铃虫取食番茄后, 在启动茉莉酸防卫信号途径的同
时 , 也使水杨酸信号防卫途径的标志基因 PR1、
BGL2 表达上调, 两条信号转导途径表现为协同表
达。本研究的 TaWRKY34 在小麦抗白粉病近等基因
系 Pm16/北京 8377(抗病)中受白粉病菌、水杨酸和茉
莉酸诱导后均表现为上调表达,说明 TaWRKY34有可
能参与了这两种信号转导途径介导的防卫应答反
应。Mangelsen 等[13]发现, 处于同一个进化分支的
WRKY转录因子的表达模式在单子叶和双子叶植物
中具有高度的相似性, 预示着它们在功能上具有一
定的保守性。拟南芥的 AtWRKY3、AtWRKY4、
AtWRKY33 与 TaWRKY34 处于同一个进化分支, 且
表达模式相似(图 4), 这些基因在不同的病原菌抗性
应答途径中都起重要作用, 其中, AtWRKY33在活体
和死体营养型细菌的抗性应答过程中都起重要的调
节作用[27]; AtWRKY3 正调控死体营养型病原菌的抗
性应答反应; AtWRKY4 对活体营养型病原菌起负调
控作用, 对死体营养型病原菌具有正调控作用[32]。
小麦白粉病菌是活体营养型病原菌, TaWRKY34 在
小麦白粉菌、水杨酸和茉莉酸的胁迫下的表达模式
及其与来自其他物种抗病相关 WRKY 转录因子的
254 作 物 学 报 第 36卷
图 5 病原菌诱导的不同物种 WRKY基因表达模式
Fig. 5 Expression patterns of different WRKY genes induced by pathogens
图 6 TaWRKY34基因组特异引物 W34F/R在 Langdon代换系
和中国春缺体-四体材料中的 PCR扩增
Fig. 6 PCR products amplified from Langdon D-genome
disomic substitution lines and CS nulli-tetrasomic lines with
primer W34F/R
1: CS; 2: CSN1AT1B; 3: CSN1BT1A; 4: CSN1DT1A; 5: LDN;
6: LDN1D(1A); 7: LDN1D(1B); 8: H2O; M: 100 bp DNA ladder.
图 7 TaWRKY34的亚细胞定位
Fig. 7 Subcellular location of TaWRKY34
A: TaWRKY34与 GFP融合蛋白在洋葱表皮细胞中的分布;
B: GFP在洋葱表皮细胞中的分布。
A: distribution of fusion protein between TaWRKY34 and GFP in on-
ion epidermal cell; B: distribution of GFP in onion epidermal cell.
聚类分析结果表明, TaWRKY34 很可能参与了活体
营养型细菌和死体营养型细菌的抗病反应。
小麦抗白粉病近等基因系是进行小麦白粉病抗
性遗传机制研究的宝贵材料。本试验用小麦白粉菌
同时胁迫处理 Pm16/北京 8377(抗病)和北京 837(感
病), 发现 TaWRKY34在抗病近等基因系中的本底表
达水平明显低于感病近等基因系中的表达水平(图 2
和图 3中的 0 h), 说明 Pm16基因对 TaWRKY34具有
负调控作用。由于 Pm16/北京 8377近等基因系与北
京 837 材料的遗传背景相似, 在 Pm16/北京 8377中
所含有的 Pm16 基因可能通过某种直接或间接的作
用, 抑制了 TaWRKY34 的表达, 导致 TaWRKY34 在
抗病近等基因系中的本底表达水平较低。在受病原
菌诱导后, Pm16基因对 TaWRKY34的抑制作用被解
除, 从而使 TaWRKY34在 0~32 h上调表达; 而在感
病近等基因系北京 837(S)中不存在Pm16基因, 因此
本底表达水平较高。此外, 在白粉病菌侵染、水杨
酸和茉莉酸处理后 , 抗病近等基因系 Pm16/北京
8377中 TaWRKY34 的表达量均在外界刺激下上升直
至某个程度后开始下降。这与拟南芥中 AtWRKY6的
自身反馈调节类似 , AtWRKY6 抑制了其自身和
AtWRKY42 的表达 [33]。但在感病的北京 837 中 ,
TaWRKY34 的表达模式却与抗病近等基因系不相同,
表明 Pm16 影响了 TaWRKY34 在白粉病菌侵染、水
杨酸和茉莉酸处理后的表达模式 , Pm16 对于
TaWRKY34 的调控机制以及该调控对于小麦白粉病
抗性的影响还需要进行深入研究。
4 结论
在小麦中鉴定了一个受小麦白粉病菌、水杨酸
和茉莉酸胁迫诱导表达的基因 TaWRKY34, 该基因
编码 464 个氨基酸。TaWRKY34 被定位于小麦第一
同源群染色体的短臂上, 是一个仅在细胞核中表达
的基因。TaWRKY34 在抗白粉病近等基因系 Pm16/
北京 8377(抗病)和北京 837(感病)中的本底表达水平
不同, 抗白粉病基因 Pm16对其具有负调控作用。抗
白粉病近等基因系受白粉病菌、水杨酸和茉莉酸诱
导后的表达模式不同, TaWRKY34 可能同时参与了
后二者诱导的防卫信号途径。
致谢：潘磊、张素霞和郑伶俐协助小麦转录因子质
粒DNA的提取等工作, 张俊成在序列的分析等方面
提供了帮助, 在此表示衷心感谢。
References
[1] Eulgem T, Rushton P J, Robatzek S, Somssich I E. The WRKY
superfamily of plant transcription factors. Trends Plant Sci, 2000,
第 2期 秦 伟等: 小麦白粉病菌诱导的 TaWRKY34基因的鉴定与分析 255
5: 199–206
[2] Zhang Y J, Wang L J. The WRKY transcription factor super-
family: Its origin in eukaryotes and expansion in plants. BMC
Evol Biol, 2005, 5: 1
[3] Eulgem T, Somssich I E. Networks of WRKY transcription fac-
tors in defense signaling. Curr Opin Plant Biol, 2007, 10:
366–371
[4] Kim K C, Lai Z B, Fan B F, Chen Z X. Arabidopsis WRKY38
and WRKY62 transcription factors interact with histone deacety-
lase 19 in basal defense. Plant Cell, 2008, 20: 2357–2371
[5] Liu X Q, Bai X Q, Qian Q, Wang X J, Chen M S, Chu C C. Os-
WRKY03, a rice transcriptional activator that functions in defense
signaling pathway upstream of OsNPR1. Cell Res, 2005, 15:
593–603
[6] Ryu H S, Han M, Lee S K, Cho J I, Ryoo N, Heu S, Lee Y H,
Bhoo S H, Wang G L, Hahn T R, Jeon J S. A comprehensive ex-
pression analysis of the WRKY gene superfamily in rice plants
during defense response. Plant Cell Rep, 2006, 25: 836–847
[7] Cai M, Qiu D Y, Yuan T, Ding X H, Li H J, Duan L, Xu C G, Li X
H, Wang S P. Identification of novel pathogen-responsive cis-
elements and their binding proteins in the promoter of Os-
WRKY13, a gene regulating rice disease resistance. Plant Cell
Environ, 2008, 31: 86–96
[8] Qiu D Y, Xiao J, Ding X H, Xiong M, Cai M, Cao Y, Li X H, Xu
C G, Wang S P. OsWRKY13 mediates rice disease resistance by
regulating defense-related genes in salicylate- and jasmonate-
dependent signaling. Mol Plant Microbe Interact, 2007, 20:
492–499
[9] Zhang J, Peng Y L, Guo Z J. Constitutive expression of patho-
gen-inducible OsWRKY31 enhances disease resistance and affects
root growth and auxin response in transgenic rice plants. Cell Res,
2008, 18: 508–521
[10] Shimono M, Sugano S, Nakayama A, Jiang C J, Ono K, Toki S,
Takatsuji H. Rice WRKY45 plays a crucial role in benzothiadia-
zole-inducible blast resistance. Plant Cell, 2007, 19: 2064–2076
[11] Liu X Q, Bai X Q, Wang X J, Chu C C. OsWRKY71, a rice tran-
scription factor, is involved in rice defense response. J Plant
Physiol, 2007, 164: 969–979
[12] Wang H, Hao J, Chen X, Hao Z, Wang X, Lou Y, Peng Y, Guo Z.
Overexpression of rice WRKY89 enhances ultraviolet B tolerance
and disease resistance in rice plants. Plant Mol Biol, 2007, 65:
799–815
[13] Mangelsen E, Kilian J, Berendzen K W, Kolukisaoglu U H,
Harter K, Jansson C, Wanke D. Phylogenetic and comparative
gene expression analysis of barley (Hordeum vulgare) WRKY
transcription factor family reveals putatively retained functions
between monocots and dicots. BMC Genomics, 2008, 9: 194
[14] Shen Q H, Saijo Y, Mauch S, Biskup C, Bieri S, Keller B, Seki H,
Ulker B, Somssich I E, Schulze-Lefert P. Nuclear activity of
MLA immune receptors links isolate-specific and basal disease
resistance responses. Science, 2007, 315: 1098–1103
[15] Bélanger R R, Benhamou N, Menzies J G. Cytological evidence
of an active role of silicon in wheat resistance to powdery mildew
(Blumeria graminis f. sp. tritici). Phytopathogy, 2003, 93:
402–412
[16] Bhuiyan N H, Liu W, Liu G S, Selvaraj G, Wei Y, King J. Tran-
scriptional regulation of genes involved in the pathways of bio-
synthesis and supply of methyl units in response to powdery mil-
dew attack and abiotic stresses in wheat. Plant Mol Biol, 2007,
64: 305–318
[17] Li A L, Wang M L, Zhou R H, Kong X Y, Hou N X, Wang W S,
Jia J Z. Comparative analysis of early H2O2 accumulation in
compatible and incompatible wheat-powdery mildew interactions.
Plant Pathol, 2005, 54: 308–316
[18] AbuQamar S, Chen X, Dhawan R, Bluhm B, Salmeron J, Lam S,
Dietrich R A, Mengiste T. Expression profiling and mutant
analysis reveals complex regulatory networks involved in Arabi-
dopsis response to Botrytis infection. Plant J, 2006, 48: 28–44
[19] Oh S K, Baek K H, Park J M, Yi S Y, Yu S H, Kamoun S, Choi
D. Capsicum annuum WRKY protein CaWRKY1 is a negative
regulator of pathogen defense. New Phytol, 2008, 177: 977–989
[20] Mzid R, Marchive C, Blancard D, Deluc L, Barrieua F, Corio-
Costet M F, Drira N, Hamdi S, Lauvergeat V. Overexpression of
VvWRKY2 in tobacco enhances broad resistance to necrotrophic
fungal pathogens. Physiol Plant, 2007, 131: 434–447
[21] Dellagi A, Heilbronn J, Avrova A O, Montesano M, Palva E T,
Stewart H E, Toth I K, Cooke D E L, Lyon G D, Birch P R J. A
potato gene encoding a WRKY-like transcription factor is in-
duced in interactions with Erwinia carotovora subsp. atroseptica
and Phytophthora infestans and is coregulated with class I endo-
chitinase expression. Mol Plant Microbe Interact, 2000, 13:
1092–1101
[22] Chen C H, Chen Z X. Isolation and characterization of two patho-
gen- and salicylic acid-induced genes encoding WRKY DNA-
binding proteins from tobacco. Plant Mol Biol, 2000, 42: 387–
396
[23] Larkin M A, Blackshields G, Brown N P, Chenna R, McGettigan
P A, McWilliam H, Valentin F, Wallace I M, Wilm A, Lopez R,
Thompson J D, Gibson T G, Higgins D G. Clustal W and Clustal
X version 2.0. Bioinformatics, 2007, 23: 2947–2948
[24] Clamp M, Cuff J, Searle S M, Barton G J. The Jalview Java
alignment editor. Bioinformatics, 2004, 20: 426–427
[25] Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S. MEGA4: Molecular evo-
lutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0. Mol
Biol Evol, 2007, 24: 1596–1599
[26] Dong J X, Chen C H, Chen Z X. Expression profiles of the
Arabidopsis WRKY gene superfamily during plant defense re-
sponse. Plant Mol Biol, 2003, 51: 21–37
[27] Zheng Z Y, Qamar S A, Chen Z X, Mengiste T. Arabidopsis
WRKY33 transcription factor is required for resistance to necro-
trophic fungal pathogens. Plant J, 2006, 48: 592–605
[28] Loake G, Grant M. Salicylic acid in plant defense: The players
and protagonists. Curr Opin Plant Biol, 2007, 10: 466–472
[29] Panstruga R, Parker J E, Schulze-Lefert P. SnapShot: Plant im-
mune response pathways. Cell, 2009, 136: 978.e1–3
[30] Schenk P M, Kazan K, Wilson I. Coordinated plant defense re-
sponses in Arabidopsis revealed by microarray analysis. Proc
Natl Acad Sci USA, 2000, 97: 11655–11660
[31] Peng J Y, Deng X J, Huang J H, Jia S H, Miao X X, Huang Y P.
Role of salicylic acid in tomato (Lycopersicon esculentum) plant
defense against cotton bollworm, Helicoverpa armigera Hubner.
Z Naturforsch C, 2004, 59: 856–862
[32] Lai Z H, Vinod K M, Zheng Z W, Fan B F, Chen Z X. Roles of
Arabidopsis WRKY3 and WRKY4 transcription factors in plant
responses to pathogens. BMC Plant Biol, 2008, 8: 68
[33] Robatzek S, Somssich I E. Targets of AtWRKY6 regulation during
plant senescence and pathogen defense. Genes Dev, 2002, 16:
1139–1149