全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2009, 35(4): 640−646 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家转基因生物新品种培育科技重大专项(2008ZX08002-001)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 张增艳, E-mail: zhangzy@mail.caas.net.cn; 井金学, E-mail: jingjinxue@163.com
Received(收稿日期): 2008-10-16; Accepted(接受日期): 2008-12-04.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2009.00640
转 Rs-AFP2基因小麦的分子分析及其纹枯病抗性
路 妍 1,2 张增艳 1,* 任丽娟 3 刘宝业 1 廖 勇 1,4 徐惠君 1 杜丽璞 1
马鸿翔 3 任正隆 4 井金学 2,* 辛志勇 1
1 中国农业科学院作物科学研究所 / 农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程, 北京 100081; 2西北农林科技大学植物保护学院,
陕西杨凌 712100; 3 江苏农业科学院生物技术研究所, 江苏南京 210014; 4四川农业大学农学院, 四川雅安 625000
摘 要: Rs-AFP2属于 r-硫堇类抗菌肽, 主要通过形成离子通道直接破坏细胞来杀灭病原菌。本研究通过基因枪介导
法结合对目标基因的分子检测, 证明已将外源 Rs-AFP2基因转入小麦推广品种扬麦 12中。通过逐株抗纹枯病接种鉴
定、PCR、PCR-Southern blot、Southern blot和 RT-PCR/荧光定量 RT-PCR(Q-RT-PCR)分析, 对转 Rs-AFP2基因小麦
T1至 T4代植株跟踪检测。结果表明, Rs-AFP2在转基因小麦中能够稳定遗传, 以单拷贝整合到小麦基因组中, 遗传方
式符合孟德尔遗传规律, 并能在转录水平上表达。对转 Rs-AFP2基因小麦的抗病性、主要农艺性状以及 Rs-AFP2表
达活性分析结果表明, 与受体扬麦 12相比, Rs-AFP2表达活性高的转基因小麦植株对纹枯病抗性有明显提高, 其抗病
性可以遗传, 而主要农艺性状没有明显差异, 证明可以利用 Rs-AFP2基因和基因工程途径创制抗纹枯病小麦新种质。
关键词: 抗菌肽; Rs-AFP2; 转基因小麦; 基因表达; 纹枯病抗性
Molecular Analyses on Rs-AFP2 Transgenic Wheat Plants and Their Resistance
to Rhizoctonia cerealis
LU Yan1,2, ZHANG Zeng-Yan1,*, REN Li-Juan3, LIU Bao-Ye1, LIAO Yong1,4, XU Hui-Jun1, DU Li-Pu1, MA
Hong-Xiang3, REN Zheng-Long4, JING Jin-Xue2,*, and XIN Zhi-Yong1
1 National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement / Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences,
Beijing 100081, China; 2 College of Plant Protection, Northwest A&F University, Yangling 712100, China; 3 Biotechnology Research Institute,
Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China; 4 College of Agronomy, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625000, China
Abstract: In this study, the gene encoding Rs-AFP2, a small cyteine-rich antifungal protein from radish, was evidenced to be
transformed into a wheat (Triticum aestivum L.) cultivar Yangmai 12 via bombardment of biolistic particle and PCR detection. To
evaluate if expression of Rs-AFP2 enhances the transgenic wheat resistance to Rhizoctonia cerealis, a major pathogen of wheat
sharp eyespot, the transgenic wheat plants from T1 to T4 generations were subjected to R. cerealis inoculation and the disease re-
sistance rating, and PCR, PCR-Southern, Southern blotting, and RT-PCR/Q-RT-PCR analyses for the Rs-AFP2 transgene. Results
showed that Rs-AFP2 gene was integrated as a single copy into the susceptible receptor wheat cultivar Yangmai 12, inherited from
T1 to T4, and expressed in the wheat background. The transgenic wheat plants expressing Rs-AFP2 showed enhanced resistance to
R. cerealis and unchanged agronomic traits compared with nontransgenic Yangmai 12. In the transgenic wheat plants, the express
level of Rs-AFP2 was associated with the disease resistance degree. These results suggested that Rs-AFP2 gene can be useful for
improving wheat resistance to R. cerealis.
Keywords: Antimicrobial peptides; Rs-AFP2; Transgenic wheat; Gene expression; Resistance to Rhizoctonia cerealis
小麦纹枯病(wheat sharp eyespot), 是由禾谷丝
核菌(Rhizoctonia cerealis Vander Hoeven)或立枯丝
核菌(Rhizoctonia solani Kuhn)引起的一种土传真菌
病害[1], 一般麦田小麦产量损失 10%~15%, 严重地
块损失 34%~40%, 甚至颗粒无收。近年来, 随着小
麦生产水平不断提高, 氮肥大量施用, 以及耕作制
度的改变、全球气候变暖等因素的影响, 导致土壤
中纹枯病菌大量累积 , 加之大面积种植感病品种 ,
第 4期 路 妍等: 转 Rs-AFP2基因小麦的分子分析及其纹枯病抗性 641


小麦纹枯病逐年扩展,呈加重的趋势[2], 几乎遍及世
界各地温带小麦种植区。自 20世纪 80年代以来, 小
麦纹枯病已成为我国长江流域麦区、黄淮麦区的主
要病害。据全国农业技术推广总站报道, 2005—2008
年 , 我国每年遭受纹枯病危害的麦田面积约
670~800万公顷, 经济损失在数十亿元以上[3]。由于
小麦纹枯病菌的寄主范围非常广泛, 难以根治。况
且小麦种质中纹枯病抗性资源极少 [4], 抗病性的遗
传力低, 常规抗病育种难以奏效。植物基因工程的
发展和一些抗真菌蛋白基因的克隆, 为抗真菌病育
种开辟了一条新途径[5-10]。
抗菌肽(antimicrobial peptide, AMP)具有抗菌谱
广、分子量小、基因操作容易等特点。这类蛋白主
要通过形成离子通道直接破坏细胞膜以杀灭病原真
菌, 病原真菌很难对其产生抗性。更为重要的是抗
菌肽仅作用于原核细胞和发生病变的真核细胞[5-7]。
Nordeen 等 [11]研究发现 , 将昆虫抗菌肽基因
Cecropin 导入烟草, 可降低烟草青枯病导致的植株
死亡率, 贾士荣等[12]将 Cecropin B和 Shiva A导入马
铃薯, 增强了转基因马铃薯植株对青枯病的抗性。
黄大年等[13]将 Cecropin B和 Cecropin D基因通过基
因枪法导入水稻幼胚, 获得转基因植株, 明显提高
了对水稻白叶枯病菌抗性, 同时也获得了兼抗水稻
细菌性条斑病和水稻白叶枯病的株系。Almasia等[14]
获得了转抗菌肽 SN1 基因马铃薯, 可提高对立枯丝
核菌、软腐菌的抗性。Terras 等[15]从萝卜(Raphanus
sativus)种子中克隆了 4 种 Rs-AFPs 的 cDNA 序列,
属于 r-硫堇类抗菌肽, 发现其中 Rs-AFP2 在体外能
抑制禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、粉色面包
霉 菌 (Neurospora crassa) 、 麦 类 德 氏 霉 菌
(Pyrenophora tritici-repentis)、稻瘟菌 (Pyricularia
oryzae)的菌丝生长[16], 并将 Rs-AFP2 的 cDNA 导入
烟草, 获得高水平表达的转基因烟草植株, 对赤星
病菌(Alternaria brassicola)抗性得到显著增强[17]。然
而, Rs-AFP2 基因在小麦抗病基因工程应用潜力的
研究还未见报道。
本课题组把人工合成的 Rs-AFP2 基因构建到单
子叶高效组成性表达载体上, 通过基因枪介导法转
化到小麦幼胚中 , 获得了 PCR 检测阳性的转
Rs-AFP2基因小麦 T1代植株[18]。本文进一步分析转
基因小麦 Rs-AFP2 基因在 T2至 T4代中的遗传以及
整合的拷贝数、表达水平和纹枯病抗性, 以期明确
转 Rs-AFP2 基因小麦的纹枯病抗性功能及其应用前
景。
1 材料与方法
1.1 转基因植株获得及其 DNA提取
转基因受体为小麦推广品种扬麦 12, 由江苏里
下河农业科学研究所程顺和课题组提供。从转
Rs-AFP2基因 PCR呈阳性的 T1代抗病小麦植株上收
获 T2代种子, 并单株播种(共 207株); 接着播种抗病
的 T3代转基因植株(共 10个株系 117株), 单株收获
T3 代阳性株; 再单株播种抗病的 T4 代转基因植株
(共 8个株系 184株)。于中国农业科学院作物科学研
究所可控温室完成转基因植株的生长、发育和抗病
性鉴定。
采用改良酚-氯仿抽提法[19], 从 T2至 T4代植株
幼苗的 3~4 cm长叶片中提取基因组 DNA。
1.2 PCR与 PCR-Southern
对 T2至 T4代转基因植株进行目标基因的 PCR
检测和遗传分析。根据 Rs-AFP2 基因序列设计 1 对
Rs-AFP2基因特异引物 RsA-76U: 5-ATGGTGGAAG
CACAGAAG-3, RsA-239L: 5-CAAGGGAAATAAC
AGATACA-3, 以转 Rs-AFP2基因小麦 DNA为模板
进行 PCR扩增检测, 扩增条件为 94℃预变性 3 min;
然后进入 94 30 s℃ , 55℃ 45 s, 72℃ 45 s, 共 35个循
环; 最后 72℃延伸 5 min。扩增产物经 1%琼脂糖+EB
凝胶电泳分离、分析。
PCR-Southern 扩增的目的基因片段经凝胶电泳
分离后, 转至Hybond-N+尼龙膜上, 再用 α-32P-dCTP
标记的 Rs-AFP2 基因序列为探针, 参照 Southern 杂
交方法[19-20], 与膜上的 PCR-DNA 印迹进行杂交并
检测。
1.3 Southern杂交
用限制性内切酶 Bgl I酶切 20 μg基因组 DNA,
1%琼脂糖凝胶电泳后 , 将其转移到尼龙膜上 , 用
α-32P-dCTP 标记的 Rs-AFP2 基因序列为探针进行杂
交[19-20]。
1.4 Rs-AFP2基因的转录水平
用 TRIZOL 试剂(道普公司)提取叶片总 RNA,
按 RNA kit ver.3.0 cDNA合成试剂盒(TaKaRa)说明
书进行第一链 cDNA合成。以第一链 cDNA为模板,
首先用Actin基因特异引物(ACT-A: 5-CACTGGAAT
GGTCA AGGCTG-3; ACT-B: 5-CTCCATGTCATCC
CAGTTG-3)对各样本 cDNA 扩增, 使各样本 cDNA
模板量均一化。然后用 Rs-AFP2 基因的特异引物
(AFP2-R: 5-TTGCCCAAGATGAGAGGAGTT-3; AFP
642 作 物 学 报 第 35卷

2-F: 5-GAGCCCACCGTTGATGATGTTAGT-3) 进
行半定量 RT-PCR表达分析。扩增条件为 94℃预变
性 3 min; 然后进入 94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 30 s,
共 35 个循环; 最后 72℃延伸 5 min。3 次独立的重
复。在 ABI PRISMR7000 实时荧光定量 PCR 仪(美
国 ABI 公司)上进行实时荧光定量 RT-PCR(Q-RT-
PCR)分析。反应体系 25 μL, 按照 SYBR Premix Ex
Taq (TaKaRa)反应系统, 通过检测结合双链 DNA的
SYBR GREEN I 强度达到检测基因表达量的目的,
Rs-AFP2 基因的特异引物为 AFP2-R 和 AFP2-F, 以
Actin 为内参照(引物为 ACT-A 和 ACT-B)。反应条
件为 94℃预变性 1 min; 进入 94℃变性 15 s, 60℃退
火 31 s, 45个循环。每个反应均有 3次独立的重复验
证。
1.5 小麦纹枯病抗性鉴定
采用蔡士宾等[21]的牙签培养法接种, 在小麦分蘖
盛期, 用消毒镊子夹取长满菌丝的牙签段, 轻轻地嵌
入麦苗叶鞘内, 每个叶鞘嵌入一个有菌牙签段, 至少
保湿 3 d, 于小麦蜡熟期对单株进行抗病调查, 小麦植
株的反应型分为 9 级[22], 抗病程度以病情指数为基础
评价, 病情指数 0 为免疫; 病情指数<20.00%为高抗
(HR); 病情指数 20.01%~40.00%为抗(R); 病情指数
40.01%~50.00%为中抗 (MR); 病情指数 50.01%~
60.00%为中感(MS); 病情指数 60.01%~80.00%为感(S);
病情指数 80.01%~100.00%为高感(HS)。
其中病情指数=∑(各级病株数×病级)/(调查总
株数×最高级值)×100%
1.6 农艺性状调查
将 PCR呈阳性的 T3代抗病小麦 8个 T4株系 184
株的种子单株播种, 生长期间调查抗病性, 收获后
每个株系随机取 10株调查 T4代植株的株高、穗长、
分蘖数和千粒重。
2 结果与分析
2.1 转基因植株的 PCR检测与遗传分析
对成活的 207个 T2代转基因植株进行目标基因
PCR 检测和遗传分析。在 T1代纯合株系的 34 株 T2
代植株中均可检测到 Rs-AFP2基因(图 1-A), T2代转
基因植株中, Rs-AFP2基因阳性 148株, 阴性 59株,
符合 3∶1 的分离比(χ2=1.258, χ20.05,1=3.84), 说明
Rs-AFP2 基因已经从转基因小麦 T1代传递到 T2代,
可能以单拷贝形式存在。对转基因 T3 代植株中
Rs-AFP2 基因的 PCR、PCR-Southern 检测表明, 二
者结果一致(图 1-B), 说明 PCR 扩增结果的可信性,
而且 Rs-AFP2基因在 T3代中能稳定遗传, 遗传规律
与 T2代吻合。进一步对 T4代 8个株系的 184株转基

图 1 转 Rs-AFP2基因小麦 T2(A)、T3(B)和 T4代(C)植株的 PCR检测
Fig. 1 PCR analyses on T2 (A), T3 (B), and T4 (C) plants of RS-AFP2 transgenic wheat
在各照片中, M为 100 bp DNA ladder; P为转基因载体质粒 pUAFP2; WT为未转基因扬麦 12; 标数字的各泳道为转基因植株。照片 B
中, B1和 B2分别为 PCR和 PCR-Southern blot检测结果。
Lane “M” is 100 bp DNA ladder; lane “P” is Rs-AFP2 transformed vector plasmid pUAFP2 as positive control; lane “WT” is wild-type
Yangmai 12; other lanes marked with numbers are transgenic plants. In picture B, B1 and B2 denote PCR and PCR-Southern blot results,
respectively.
第 4期 路 妍等: 转 Rs-AFP2基因小麦的分子分析及其纹枯病抗性 643


因小麦中 Rs-AFP2 基因进行跟踪检测。结果发现,
在 6 个株系 115 株中可检测到 Rs-AFP2 基因的为
109 株, 其他 2 个株系共 69 株均检测到 Rs-AFP2
基因(图 1-C), 说明 Rs-AFP2 在转基因小麦中能够
稳定遗传, 8个 T4代小麦株系中 Rs-AFP2基因已基
本纯合。
2.2 转基因植株的 Southern blot分析
以 Rs-AFP2 基因的全长序列为探针, 对限制性
内切酶 Bgl I消化的转 Rs-AFP2小麦的 T3代植株的
基因组 DNA进行 Southern杂交结果显示, Rs-AFP2
基因以单拷贝的形式整合到转 Rs-AFP2 基因小麦株
系 406-2 和 406-4 的基因组中(图 2), 验证了上述遗

图 2 部分 T3代植株 Rs-AFP2目的基因 Southern blot(A)和 T4代植株的荧光定量 RT-PCR(B)分析
Fig. 2 Southern blot (A) assay on Rs-AFP2 gene in T3 plants and Q-RT-PCR (B) assay in T4 plants
M: λDNA/Hind III marker; 1: 转基因株系 406-2; 2: 转基因株系 406-4; 3: 非转基因扬麦 12 (阴性对照); 4: pUAFP2质粒(阳性对照)。
M: λDNA/Hind III marker; 1: transgenic line 406-2; 2: transgenic line 406-4; 3: wild-type Yangmai 12 (negative control); 4: Rs-AFP2 trans-
formed vector (positive control).

传分析结果。
2.3 转基因植株中目标基因的转录水平
以半定量 RT-PCR 分析 T3 和 T4 代植株中
Rs-AFP2 的转录水平 , 结果表明抗病植株中
Rs-AFP2基因的转录水平高于未转基因扬麦 12和感
病株。进一步利用 Q-RT-PCR定量分析 PCR检测呈
阳性的 T4代单株中 Rs-AFP2 表达量, 结果表明, 抗
病植株 360-2、406-3、406-4、406-1、407-2、320-1、
406-2和 361-5-1中 Rs-AFP2转录水平明显高于未转
基因扬麦 12 和感病植株 361-5-2, 不同植株中的表
达量存在差异(图 2-B)。
2.4 转基因植株的小麦纹枯病抗性鉴定
对 PCR 检测阳性的转 Rs-AFP2 基因小麦 T2
至 T4 代植株的接种鉴定结果表明 , 大多数阳性植
株表现高抗 , 而未转基因扬麦 12 表现高感(图 3)。
在 T4代群体中 , 未转基因扬麦 12群体材料的病情
指数为 90.45%, 转基因阳性群体材料的病情指数
在 20%~43%之间(表 1), 阳性转基因植株的病情指
数总体上低于未转基因植株。说明外源 Rs-AFP2
基因在转化小麦内的有效表达 , 提高了转基因植
株对小麦纹枯病的抗性。此外 , 不同株系的
Rs-AFP2 表达量高低与其抗性程度成正比。其中
360-2、406-3、406-4 株系对纹枯病的平均抗病级
别为 1 级 ; 406-1、320-1 和 407-2 株系对纹枯病的
平均抗病级别为 1 级或 2 级 ; 406-2 株系对纹枯病

图 3 转 Rs-AFP2基因 T4代植株的小麦纹枯病抗性
Fig. 3 Resistance of Rs-AFP2 transgenic plants to wheat sharp
eyespot in T4 generation
1: 406-4; 2: 406-2; Control: 未转基因扬麦12。
1: 406-4; 2: 406-2; Control: wild-type Yangmai 12.
644 作 物 学 报 第 35卷

表 1 T4代植株小麦纹枯病抗性鉴定
Table 1 Identification of resistance to wheat sharp eyespot in T4 plants
株系
Line
平均反应型
Average infection type
病情指数
Disease index (%)
抗性
Resistance
320-1 1.82 23.33 R
360-2 1.00 20.00 HR
361-5 3.13 32.55 R
406-1 1.27 27.27 R
406-2 2.31 43.71 MR
406-3 1.00 20.00 HR
406-4 1.09 25.46 R
407-2 1.33 28.21 R
扬麦 12 Yangmai 12 5.00 90.45 HS
HR: highly resistant; R: resistant; MR: moderately resistant; HS: highly susceptible.

的抗病级别为 2 级; 361-5 株系对纹枯病的抗病级
别为 3 级 , Rs-AFP2 表达活性低的极个别植株感染
纹枯病, 如361-5-2是Rs-AFP2表达活性低的植株对纹
枯病的反应型为 5 级, 说明转 Rs-AFP2 基因小麦中
Rs-AFP2的表达活性是抗纹枯病的关键因素。
2.5 T4代转基因株系的农艺性状
调查转 Rs-AFP2基因 T4代小麦植株的株高、穗
长、分蘖数、千粒重、成熟期等农艺性状, 结果显
示, 转 Rs-AFP2 基因小麦的农艺性状与未转基因小
麦亲本的基本相同(表 2)。

表 2 T4代转基因植株主要农艺性状
Table 2 Major agronomic traits of T4 generation
株系
Line
株高
Plant height (cm)
穗长
Spike length (cm)
分蘖数
Number of tillers
千粒重
1000-grain weight (g)
扬麦 12 Yangmai 12 59.14 6.69 9 35.36
320-1 65.15 6.14 7 32.32
360-2 62.17 7.25 8 36.72
361-5 65.52 7.23 9 37.23
406-1 56.24 6.36 8 31.35
406-2 59.46 6.73 10 37.51
406-3 56.67 6.32 9 33.35
406-4 59.55 6.73 10 36.33
407-2 60.11 6.71 8 36.21
表中数据为 10株平均值。
Values in the table are the average of 10 plants in each line.

3 讨论
随着寄主—微生物互作研究的深入, 抗病有效
基因的克隆以及基因转化技术的发展, 植物抗病基
因工程育种正在成为植物育种的重要途径之一。近
年来, 抗菌肽因具抗菌谱广等优点受到广泛关注[23],
关于高表达抗菌肽 /蛋白的转基因植物的抗病性提
高的报道日益增多[7,14,24-27]。针对小麦纹枯病危害日
趋严重, 小麦中缺乏抗病基因资源、抗纹枯病小麦
常规育种进展缓慢等问题 , 利用基因工程方法将
Rs-AFP2 基因转入小麦, 对小麦抗纹枯病育种有重
要作用和实践意义。
尽管 Terras 等[16]发现, Rs-AFP2 在体外能抑制
禾谷镰刀菌、粉色面包霉菌、麦类德氏霉菌、稻瘟
菌的菌丝生长。但是对 R. cerealis 是否有抑制作用
目前未见报道。笔者通过 Rs-AFP2 原核表达和体外
抑菌实验, 证实 Rs-AFP2 蛋白可以通过抑制菌丝生
长和菌核萌发、破坏菌丝形态结构, 阻止该病菌的
侵染和扩展(待发表)。本文对转 Rs-AFP2 基因小麦
T1 至 T4 代植株的纹枯病抗性鉴定结果也表明, 转
Rs-AFP2基因小麦植株对纹枯病的抗性得到提高。
外源 Rs-AFP2基因在小麦中能够从 T1代传递到
第 4期 路 妍等: 转 Rs-AFP2基因小麦的分子分析及其纹枯病抗性 645


T4代, 并转录表达。转 Rs-AFP2 基因小麦阳性植株
的抗性程度与 Rs-AFP2 表达量成正比。转入的
Rs-AFP2 基因不仅可提高转基因小麦对纹枯病菌的
抗性, 而且对赤霉病抗性也有所提高。同时转基因
小麦 T4代植株的农艺性状与未转基因小麦品种间没
有明显差异, 这在生产中有重要的意义。
外源基因导入到植物基因组后, 由于植物自身防
御体系的作用, 以及外源基因插入位置、拷贝数等因
素的影响, 很容易发生基因丢失和基因沉默现象。王
守才等[28]、华志华等[29]认为转基因植物中外源基因的
遗传效应多种多样, 遗传行为也比较复杂[28-29]。本研
究发现, 一些转 Rs-AFP2 基因的小麦植株(406-2、
361-5 株系部分植株)中, 虽然 PCR 为阳性, 但其抗
病性并没有提高, 可能与这些植株中 Rs-AFP2 基因
的转录表达量低、转录后沉默或基因产物 Rs-AFP2
被小麦内源蛋白酶降解有关。尽管存在上述种种不
利的未知因素, 通过对较大群体的转基因株系以及
T1至 T4代的逐株分子检测、表达分析和抗病性选择,
仍可以选育出抗病性稳定的转基因小麦新种质。当
然, Rs-AFP2 基因在植物抗病基因工程应用方面仍
然存在一些问题, 如赋予转基因植株的抗病性水平
还未达到免疫程度, 需要今后通过与其他有效抗病
基因共转化、协同作用来加以解决。
4 结论
通过基因工程、分子检测和抗病性鉴定, 选育
出抗纹枯病的转 Rs-AFP2基因小麦新种质。Rs-AFP2
能从转基因小麦 T0代传递到 T4代, 并能转录、表达。
转 Rs-AFP2 基因小麦阳性植株对纹枯病抗性程度与
Rs-AFP2表达量成正比。

致谢: 衷心感谢中国农业科学院作物科学研究所严
以萍、王小田的大力支持。
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