全 文 ：Vol. 30 , No. 5
pp. 475～480 May , 2004
作 物 学 报
ACTA AGRONOMICA SINICA
第 30 卷 第 5 期
2004 年 5 月 475～480 页
转基因抗虫小麦中 sgna 基因的遗传分析及抗虫性鉴定
徐琼芳 田 芳 陈 孝 侯文胜 李连城 杜丽璞 徐惠君 辛志勇 Ξ
(中国农业科学院作物育种栽培研究所 ,农业部作物遗传育种重点实验室 ,北京 100081)
摘 要 利用基因枪介导将抗蚜虫的 sgna 基因导入了长江中下游地区小麦栽培品种扬麦 158 ,得到了 6 棵转基因植株。
PCR和 RT2PCR 检测分别证实了 sgna 基因的整合和表达。通过分析转基因植株的 T1 代和 T2 代 ,发现 sgna 基因的遗传
并不符合孟德尔的遗传规律。抗蚜虫鉴定试验证明含有 sgna 基因的植株对蚜虫有明显的抗性 ,转基因植株可以显著降
低蚜虫的繁殖率。转基因植株的农艺性状与对照相比 ,有较显著的变化。
关键词 sgna 基因 ;转基因小麦 ;蚜虫抗性 ;农艺性状
中图分类号 :S512
Inheritance of sgna Gene and Insect2resistant Activity in Transgenic Wheat
XU Qiong2Fang , TIAN Fang , CHEN Xiao , HOU Wen2Sheng , LI Lian2Cheng , DU Li2Pu , XU Hui2Jun , XIN Zhi2Yong
( Institute of Crop Breeding and Cultivation , Chinese Academy of Agricultural Sciences , Key Laboratory of Crop Genetics and Breeding of Ministry of Agricul2
ture , Beijing 100081 , China)
Abstract The sgna gene was transferred into a wheat cultivar , Yangmai 158 , mediated by particle bombardment . Six
transgenic wheat plants were generated. The integration and transcription of the sgna gene were confirmed by PCR and RT2
PCR analysis respectively. Transmission of the sgna gene was investigated in the following generations. The results indicat2
ed that the inheritance of the gene was not consistent with Mendel’s Law. Through insect resistance test , it was found that
transgenic wheat plants could significantly reduce the reproduction of aphids. Analyzing the agronomic characteristics of the
transgenic plants indicated that great changes occurred in these plants due to some possible reasons.
Key words sgna gene ; Transgenic wheat ; Insect resistance ; Agronomic characteristics
蚜虫是危害小麦生产的重要害虫 ,它不仅直接
取食和损害作物 ,而且传播多种病毒病 ,大麦黄矮病
毒 (Barley Yellow Dwarf Virus , BYDV) 就是其中之一。
流行年份因蚜虫引起的病毒病 (BYDV) 可使小麦减
产 20 %～30 % ,严重时可达 50 %。现在主要依靠化
学杀虫剂来控制虫害的大面积发生。但是由于害虫
能不断衍生出对杀虫剂有较高抗性的种类 ,所以最
终害虫的繁殖并不能得到有效的抑制 ,反而增加了
生产的成本 ,同时田间残留的农药又成为环境污染
的来源。利用转基因技术把抗蚜虫的外源基因导入
小麦中 ,就可以减少或避免使用杀虫剂 ,有利于解决
上述问题。雪花莲凝集素 ( Galanthus nivalis aggluti2
nin ,GNA)最初是由石蒜科植物雪花莲的鳞茎中提
取得到的[1 ] 。由于它对害虫 ,尤其是对于蚜虫这样
具有刺吸式口器的同翅目害虫有明显的抗性 ,所以
被广泛应用于抗虫转基因工程。gna 基因已被转入
小麦[2 ] 、水稻[3 ] 、马铃薯[4 ,5 ] 、烟草[6 ] 等植物中 ,表现
出了良好的抗虫效果。到目前为止 ,还没有发现
GNA 对哺乳动物以及人类有害的报道[7 ] 。sgna 基
因是由天然的 gna 基因序列 ,根据植物中的常用密
码子改造后人工合成的。用带有此基因的质粒载体
p GU4AGBar (ubi2GNA2ubi2Bar) 转化小麦栽培品种扬
麦 158 ,得到了转化植株。同时对转化植株的后代
进行了遗传分析和抗蚜虫性能鉴定。这些资料的积
累为今后转基因小麦的选育提供了依据。
1 材料和方法
1. 1 质粒材料
带有 sgna 基因的 p GU4AGBar (ubi2GNA2ubi2Bar)
质粒载体 (图 1)由中国农业科学院生物技术研究所Ξ基金项目 :国家转基因植物研究与产业化专项 (J002B2015) 。
作者简介 :徐琼芳 (1949 - ) ,女 ,副研究员 ,本科 ,从事转基因小麦的研究。
Received(收稿日期) :2002211228 ,Accepted(接受日期) :2003202211.
郭三堆实验组提供。sgna 基因受玉米泛素基因 Ubi
启动子的调控 ,选择性标记基因为 bar 基因。供试
小麦品种扬麦 158 由本实验室提供 ,该品种为长江
中下游地区栽培品种。
图 1 携带 sgna 基因的质粒载体 pGU4AGBar
Fig. 1 Plasmid vector pGU4AGBar carrying sgna gene
1. 2 转化植株的获得、再生和选择
取授粉后 12～14 d 的幼胚 ,接种在诱导愈伤组
织的培养基上 ,培养 7～9 d 后 ,即可作为基因枪转
化的受体。基因枪介导的转化以及植株的再生和筛
选过程参见文献[8 ]。
1. 3 PCR检测鉴定
取新鲜叶片 ,用酚2氯仿抽提法提取总的基因组
DNA。PCR 反应所用引物由上海生工公司合成 , 上
游引物序列为 5′2CTCTGGAGACTCTTTCTACTGG23′,
下游引物序列为 5′2TTATCCAGTAGCCCATCATC23′。
PCR 反应的条件为 :首先 94 ℃变性 3 min ;然后 94 ℃
变性 30 s , 55 ℃复性 30 s , 72 ℃延伸 1 min 共 35 个循
环 ,最后 72 ℃延伸 10 min。反应产物在 1. 2 % 的琼脂
糖凝胶上进行检测 ,扩增出的目标 DNA 带为 333 bp。
1. 4 RT2PCR检测鉴定
用 Trizol 试剂提取总 RNA , RT2PCR 反应使用
Promega 公司的试剂盒 ,检测 sgna 在转录水平上的
表达情况。
1. 5 抗蚜虫性能鉴定
收获 T1 代的种子 ,播种于温室。待长出幼苗
后 ,接种适龄蚜虫 ,观察蚜虫的生长繁殖情况 ,以鉴
定转基因植株的抗蚜虫性能。收获阳性植株的 T2
代种子 ,春播于大田。
图 2 转基因植株 T0 代的 PCR检测
Fig. 2 PCR analysis of T0 plants
M:100 bp DNA 分子量标准 ;1～6 :转基因植株的 PCR 产物
M:100 bp DNA ladder :lane 1～6 :PCR
products of transgenic plants.
2 结果与分析
2. 1 转基因植株 T0 代
2. 1. 1 转化频率 经过筛选 ,从 540 块经过基因
枪转化的愈伤组织中再生得到 6 株具有 biolaphos 抗
性的植株。PCR 分析结果说明 6 株都含有 sgna 基
因 (图 2) 。转化频率为 1. 1 %。
674 作 物 学 报 30 卷
2. 1. 2 T0 代植株的 RT2PCR 鉴定 RT2PCR 鉴定
证明了 sgna 基因在转录水平上的表达 (图 3) 。
图 3 转基因植株 T0 代的 RT2PCR检测
Fig. 3 PT2PCR analysis of T0 plants
M:λDNAΠEcoR Ⅰ+ Hind Ⅲ
分子量标准 ;1～6 :转基因植株的 RT2PCR 产物
M:λDNAΠEcoR Ⅰ+ Hind ⅢMaker ;Lane 1～6 :
RT2PCR products of transgenic plants
2. 1. 3 T0 代植株农艺性状的变异 T0 代植株生
长至成熟后 ,按单株、单穗收获 ,进行考种。结果如
表 1 所示。
由表 1 看出 , T021、T022、T023 和 T024、T025、T026
分别是来自于不同批的基因枪轰击处理的。这两批
不同的处理间的差异显著大于每批次间的差异。这
可能是由于两批处理间的受体情况不同造成的。在
表 1 T0 代植株农艺性状考查结果
Table 1 Agronomic characteristics of T0 plants
株号
Line No.
株高
Plant height
(cm)
穗数
Number of spikes
单株粒数
Seeds per plant
T021
T022
T023
T024
T025
T026 505364484247 347622 819875712235x ±s
CV %
扬麦 158(CK)
50. 7 ±7. 5
14. 8
73. 3
4. 0 ±2. 1
52. 5
3. 6
63. 7 ±29
45. 5
94. 2
6 株 T0 代植株中 ,第一株 3 穗全结粒 ,第二株 4 穗全
结粒 ,第三株全结粒 ,第四株 4 穗中 2 穗不育 ,第五
株 2 穗中 1 穗不育 ,第六株 2 穗中 1 穗不育 ,这可能
与植株生长的温室条件有关。
2. 2 转基因植株 T1 代
2. 2. 1 转基因植株 T1 代的 PCR 检测 将 T1 代种
子全部播种后 ,得到 202 株 T1 代植株 ,提取单株叶
片的 DNA 进行 PCR 检测后 ,得到 43 株阳性植株 ,如
图 4。由出苗以后的结果可以看出 ,同一株的不同
穗子的后代中 , sgna 基因的遗传情况有很大差异 ,
而且在后代中不能稳定遗传 ,丢失严重。如表 2 所
示。
图 4 转基因植株 T1 代部分植株的 PCR检测结果
Fig. 4 PCR analysis of T1 transgenic plants
M:100 bp DNA 分子量标准 ;1 :阳性对照 ;2 :阴性对照 ;3～18 :待测植株的 PCR 产物。
M:100 bp DNA ladder ;Lane 1 :Positive control ;Lane 2 :PCR products of genomic DNA from untransformed wheat plants ;Lane 3～18 :
PCR products of genomic DNA from transformed wheat plants.
774 5 期 徐琼芳等 :转基因抗虫小麦中 sgna 基因的遗传分析及抗虫性鉴定
表 2 转基因植株 T1 代的 PCR检测情况
Table 2 PCR analysis of T1 transgenic plants
T1 代株系号
T1 line No.
检测植株数
Number of total
plants analyzed
PCR + 植株数
Number of PCR +
plants
频率
Frequency
( %)
备注
Note
T021 △a ∀
T021c
T022a
T022b
T023a
T023b
T023e
T023f
T023g
T024a
T024b
T024cΠ鲁麦 23
(T024cΠLumai23)
T024d
T024e
T024f
T025a
T025bΠ扬麦 158
(T025bΠYangmai158)
T026a
T026bΠpm97035
总数 Sum
16
14
14
22
5
7
19
9
10
10
5
7
8
8
9
7
5
23
4
202
14
7
0
0
2
1
12
2
0
0
0
2
2
0
1
0
0
0
0
43
87. 5
20. 0
0
0
40. 0
14. 3
63. 2
22. 0
0
0
0
28. 6
25. 0
0
11. 1
0
0
0
0
21. 3
G3
G
G
G
F ●
F
G
G
F
G
G
F
F
F
F
G
F
G
F
-
注 : △1 , 2 , 3 ⋯⋯代表不同的植株 ; ∀a , b , c ⋯⋯代表同一植株上
不同的穗子 ; 3 G: 温室 ; ●F : 大田。
Notes : △ 1 , 2 , 3 ⋯⋯ means different plants ; ∀ a , b , c ⋯⋯ means
different spikes on each plant ; 3 G: Greenhouse ; ●F : Field
2. 2. 2 转基因植株 T1 代的抗蚜虫性能鉴定 转
基因植株 T1 代的蚜虫接种试验在本所温室进行。
每一株系选 6 株 ,在小麦生长的二叶期接上带毒的
麦二叉蚜的幼虫 ,每株接 2 头 ,两星期后统计蚜虫数
目 (表 3) 。结果说明 T021 和 T023 两个株系中的植
株对蚜虫有明显抗性 ,与对照相比 ,虫口密度分别降
低了 88. 3 %和 91. 7 % ,已达显著水平 (50 %以上即
达显著水平) 。与 PCR 检测的结果对照 ,说明对蚜
虫有显著抗性的植株都含有 sgna 基因。但是株系
T021 和 T023 的变异系数都接近了 70 % ,说明单株之
间的差异较大 ,性状不稳定 ,在后代中产生分离的可
能性较大。
2. 2. 3 转基因植株 T1 代的农艺性状 按单株收
获 T1 代植株 ,挑选 18 株生长良好的 PCR + 植株进行
室内考种。由变异系数可以看出株高、穗长、主穗小
穗数、主穗粒数这些农艺性状已趋于稳定。为了说
明转基因过程是否对小麦植株的农艺性状有影响 ,
将转基因植株与对照植株进行比较 ,结果表明 ,两者
在株高、单株穗数、主穗长、主穗小穗数和主穗粒数
这些性状上的差异达到了显著水平 (表 4) 。这可能
是由于转基因的过程以及外源基因在受体基因组中
的整合而导致的。而且除植株变矮是较好的变异性
状以外 ,其余与产量有关的性状 ,单株穗数、穗长、小
穗数和主穗粒数等都是遗传负效应。
表 3 T1 代抗蚜鉴定结果
Table 3 Aphids resistance test of T1 progeny
T021 T022 T023 T024 T025 T026 CKx ±s
CV ( %)
10. 5 ±7. 1
68
45. 8 ±11. 5
26
7. 5 ±4. 9
65
55. 5 ±14. 9
27
47. 2 ±29. 3
62
45. 8 ±11. 5
25
90. 0 ±20. 7
23
表 4 转基因植株 T1 代 PCR+ 植株与对照植株比较情况
Table 4 Comparison of the agronomic characteristics of T1 PCR+ plants with nontransgenic plants
项目
Items
株高
Plant height
(cm)
单株穗数
Spikes per plant
主穗长
Main spike length
(cm)
主穗小穗数
Florets on main spike
主穗粒数
Grains on main spike
T1 代变异情况
Variation rangex ±s
CV %
未转基因的扬麦 158(CK)
Nontransformed Yangmai 158 (CK)∂ CK株数
Number of plants ∂ CK
< CK株数
Number of plants < CK( %)
44～80
65. 1 ±9. 8 3
15. 1
70. 8
4
14(77. 8)
1～7
3. 0 ±1. 8 3
60. 0
3. 9
5
13(72. 2)
5～9
7. 1 ±0. 9 3
12. 7
7. 3
6
12(66. 7)
10～19
15. 1 ±2. 4 3
15. 9
19. 6
0
18(100)
17～37
26. 5 ±5. 5 3
20. 8
36. 9
1
17(94. 4)
注 : 3 表示与对照植株的性状相比差异达到显著水平
Notes : 3 Indicates that difference between PCR + plants and CK plants is significant .
874 作 物 学 报 30 卷
2. 3 转基因植株 T2 代
收获从温室筛选得到的阳性植株的种子 ,春天
播种于大田进行跟踪检测。从 33 株 T1 代阳性株
(温室)中 ,仅在 11 株的后代中检测到了阳性植株 ,
共 46 株 (图 5 ,表 5 和表 6) ,其余的 22 株 ,有 8 株是
不育的 ,另外 14 株在其后代中未检测到阳性植株。
由表 6 还可以看出 46 株 T2 代阳性植株全部为同一
株 T0 代苗的后代。
表 5 转基因植株 T2 代的 PCR检测情况
Table 5 PCR analysis of T2 transgenic plants
T2 代株系号
T2 line No.
检测株数
Number of total
plants analyzed
阳性数
Number of PCR +
plants
阳性率
Frequency
( %)
T2 代株系号
T2 line No.
检测株数
Number of total
plants analyzed
阳性数
Number of PCR +
plants
阳性率
Frequency
( %)
T021a24G
T021a25G
T021a26G
T021a27G
T021a28G
T021a212G 63804815598112 2118210 3. 21. 32. 15. 22. 08. 9 T021a214GT021a215GT021c21GT021c22GT021c23G 5212284419 69241 11. 57. 425. 09. 15. 2
图 5 转基因植株 T2 代部分植株的 PCR检测结果
Fig. 5 PCR analysis of T2 transgenic plants
M:100 bp DNA 分子量标准 ;1 :阳性对照 ;2 :阴性对照 ;3～18 :待测植株的 PCR 产物
M:100 bp DNA ladder ;Lane 1 :Positive control ;Lane 2 :PCR products of genomic DNA from untransformed wheat plants ;Lane 3～18 :PCR
products of genomic DNA from transformed wheat plants
表 6 T1～T2 代的转基因植株 PCR阳性检测频率
Table 6 PCR+ frequency of transgenic plants from T1 generation to T2 generation
T1 代
T1 generation
T2 代株系 T2 Lines T2 代植株 T2 Plants
检测株系数
Lines detected
PCR + 株系数
PCR + lines
阳性率
Frequency( %)
检测植株数
Plants detected
PCR + 植株数
PCR + plants
阳性率
Frequency( %)
T021a 11 8 72. 7 817 39 4. 8
T021c 5 3 60. 0 107 7 6. 5
T023e 9 0 0 373 0 0
总数 Sum 25 11 44 1297 46 3. 5
3 讨论
本实验利用基因枪技术将 sgna 基因导入了长
江中下游推广品种扬麦 158 中 ,获得了 6 株 T0 代阳
性植株。分单株、单穗收获后 ,在 202 株 T1 代植株
中得到了 43 株 PCR + 的植株。其中有 14 株来自 T0
代植株第一株的第一个穗子 ,7 株来自 T0 代植株第
一株的第 3 个穗子 ,12 株来自 T0 代植株第三株的第
5 个穗子。而第二代的 46 株阳性植株全都为同一
株 T0 代苗的后代 ,其中 39 株来自 T0 代第一株苗的
974 5 期 徐琼芳等 :转基因抗虫小麦中 sgna 基因的遗传分析及抗虫性鉴定
第一个穗子 ,7 株来自它的第三个穗子。这说明 sg2
na 基因的遗传在单株和单穗间都存在很大差异。
因此在转基因植株的 T0 代应该按照单株、单穗进行
收获。
转基因植株 T0 代的 6 个株系 ,是来源于不同批
次基因枪转化的产物 ,在批次之间存在显著差异。
由于整个转基因过程的技术参数都比较稳定 ,所以
这种差异可能是由于受体材料本身的差异造成的。
因为我们是将胚性愈伤组织作为基因枪轰击的受
体 ,在取幼胚的过程中 ,由于没有严格区分是来自于
哪个小穗的幼胚 ,所以在成熟程度上必然存在一定
的差异。在今后的工作中 ,可以考虑把不同小穗的
幼胚区分开 ,进行遗传转化分析 ,可能得到更好的
结果。
对 T1 代进行的抗蚜试验表明 ,含有 sgna 基因
的植株对蚜虫的繁殖有显著的抑制作用 ,蚜虫数目
与对照相比减少了将近 90 %。但是抗蚜虫的植株
间变异系数较大 ,说明这些株系还不够稳定 ,在后代
中可能发生分离。
考种结果发现 ,转基因植株 T1 代与对照植株在
株高、单株穗数、主穗长、主穗小穗数和主穗粒数这
些农艺性状上的差异达到了显著水平。这种差异来
源于两个方面 ,一方面是无性系变异[9 ,10 ] ,这是由于
在遗传转化前期 ,进行幼胚愈伤组织的诱导时产生
的 ;另一方面是由于外源基因整合到植株的基因组
中后 ,导致原有的基因序列发生了改变[11 ] 。这些原
因就导致了转基因植株的农艺性状大部分发生了不
利的变异。这启示我们今后要想获得既抗虫 ,又具
有优良农艺性状的转基因植株 ,必须扩大 T0 代
群体。
在转基因植株 T1 代和 T2 代跟踪检测中发现同
株后代之间的抗虫性和 PCR 检测结果各不相同 ,
sgna 基因的遗传也不符合孟德尔式分离定律。推
测可能是 sgna 基因在基因组上的不正常整合 ,导致
导入基因的严重丢失造成的。这与 Stoger 等人观察
到的现象不一致[12 ] ,我们认为不同的受体小麦品
种 ,不同的转化体系以及不同的目的基因都可能导
致这种差异。关于类似的情况在别的文章中也有报
道 ,外源基因在转基因植株的 T2 代后才趋于稳
定[13 ] 。这说明要得到农艺性状良好、基因稳定遗传
的转基因植株不仅要扩大 T0 代群体 ,而且要注重其
后代的筛选。
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084 作 物 学 报 30 卷