全 文 :作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(10): 17431751 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(2009CB118305)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 夏兰琴, E-mail: xialq@mail.caas.net.cn, Tel: 010-82105804
第一作者联系方式: E-mail: suenyw@yahoo.cn, Tel: 010-82105921
Received(收稿日期): 2011-05-09; Accepted(接受日期): 2011-06-25; Published online(网络出版日期): 2011-07-28.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20110728.1000.004.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.01743
小麦穗发芽抗性相关 Vp1 基因启动子的分离及功能验证
孙永伟 聂丽娜 马有志 徐兆师 夏兰琴*
中国农业科学院作物科学研究所, 北京 100081
摘 要: 成熟期穗发芽严重影响小麦产量和品质。Vp1是调节胚发育, 促进胚成熟和休眠的重要转录因子, 对小麦种
子休眠和穗发芽抗性具有重要作用。本研究分离了普通小麦 B基因组 Vp1基因的启动子, 生物信息学预测结果表明,
其含有 9个脱落酸响应元件 ABRE、2个 DREB和 6个 MYB干旱响应元件、3个赤霉素响应元件 GARE、1个水杨
酸响应元件 TCA-E、2个茉莉酸甲酯响应元件 TGACG-motif、4个 SKn-1和 1个 RYREPE胚乳特异表达元件。采用
5′端缺失的方法, 构建了系列含 Vp1 启动子不同区段融合 GUS 报告基因的瞬时表达载体和植物表达载体。通过基因
枪转化小麦愈伤组织, 瞬时表达结果显示, Vp1 启动子在无诱导的情况下不能启动 GUS 基因表达, 在低温、ABA、
GA、PEG和 NaCl诱导后可以启动 GUS基因表达, 表现诱导表达特性, 且其诱导表达强度随启动子缺失片段长度变
短而减弱。利用 Gateway 方法成功构建了 6 个启动子各缺失片段类型的植物表达载体, 并通过农杆菌介导转化四倍
体小麦 Stewart, 获得转基因植株。该启动子可有效启动 GUS基因在转基因植株的花药、糊粉层、穗轴及根中表达, 其
他组织中没有表达。当启动子片段大于 660 bp时, 外源 ABA可诱导启动子启动 GUS基因在转基因植株茎节中的表达。
关键词: 穗发芽; Vp1启动子; 功能分析; 转基因小麦
Cloning and Functional Analysis of Viviparous-1 Promoter in Wheat
SUN Yong-Wei, NIE Li-Na, MA You-Zhi, XU Zhao-Shi, and XIA Lan-Qin*
Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China
Abstract: Viviparous1 (Vp1) plays an important role in regulating embryo development, seed dormancy, and germination in
higher plants. Although we previously demonstrated a close correlation between Vp1B allelic variation and the different levels of
tolerance to pre-harvest sprouting (PHS) in common wheat, little is known about the potential cis-elements in Vp1B promoter
region, which may be involved in the control of PHS by Vp1B. In this study, a 2 232 bp Vp1B upstream sequence was isolated. In
silico analysis revealed the presence of nine ABRE, two DREB, six MYB, three GARE, one TCA-E, two TGACG-motif, four
SKn-1, and one RYREPE cis-elements in the isolated sequence. Based on this, we constructed various plasmid vectors with
5′-truncated Vp1B promoters fused with the GUS (encoding β-glucuronidase) reporter gene. Transient expression assay in wheat
callus indicated that Vp1B promoter activity was inducible by low-temperature, ABA, or GA treatment. However, the level of
induced GUS activity declined as promoter length decreased. Subsequently, six truncated promoter reporter fusions were intro-
duced into the genome of durum wheat by Agrobacterium-mediated transformation and stable transgenic lines were obtained.
Analysis of the transgenic lines indicated that Vp1B promoter could drive GUS expression in the anther, axis, aleurone and root,
but not in the leaves, stems and nodes. However, in the plants with the transgenic Vp1B promoter fragment longer than 660 bp,
GUS expression could be induced in the nodes by ABA treatment.
Keywords: Pre-harvest Sprouting; Vp1 promoter; Functional analysis; Transgenic wheat
小麦穗发芽(pre-harvest sprouting, PHS)是指收
获前籽粒在麦穗上发芽的现象, 影响小麦产量和品
质, 是世界性的自然灾害[1]。小麦穗发芽与多种因素
有关, 是由多基因控制的复杂性状, 而且不同品种
的穗发芽抗性机制也可能不同[2]。在影响小麦穗发
芽的众多基因中, Vp1是调节胚发育, 促进胚成熟和
休眠的主要转录调节因子, 该基因位于小麦第 3 同
源群染色体的长臂上[3]。以成熟期的小麦胚为材料,
1744 作 物 学 报 第 37卷
分析 Vp1 的转录本结构, 发现每个同源基因都会产
生一套大小不同的转录本 , 原因是转录后前体
mRNA 发生了选择性的剪接 , 导致无法编码全长
Vp1蛋白, 从而表现对穗发芽敏感[4]。根据 Vp1基因
序列中跨越 5 个内含子的 B3 区段设计特异性引物,
对 2个 CIMMYT人工合成六倍体小麦进行 RT-PCR,
发现这 2个合成小麦之间存在不同的剪切模式, 进一
步证明 Vp1 在转录时不同的剪切方式是导致品种间
穗发芽抗性差异的重要因素之一[5]。然而, Nakamura
等 [4]研究了强休眠品种 Minamino 和非休眠品种
Tozan 成熟胚中 Vp1 基因的表达, 发现在 Minamino
中 Vp1的表达量大于在 Tozan中。燕麦 Vp1只形成
一种转录本, 把燕麦 Vp1 cDNA 转入小麦时, 转基
因小麦穗发芽程度明显降低[6]。小麦的 3 个 Vp1 同
源基因中, 位于 3B染色体上的 Vp1B对穗发芽抗性
起关键作用, 并且存在广泛的多态性[7-11]。Yang 等[7-8]
在小麦 3B染色体上发现了 2个与穗发芽抗性相关的
Vp1B 的新型等位变异 Vp1Bb 和 Vp1Bc, 由 Vp1B 编
码区第 3 内含子中反转座子的插入和转座子的缺失
引起, 尽管存在错误剪切现象, 但 Vp1B 各等位基
因正常转录本的表达量与种子的 ABA 敏感性和
穗发芽抗性呈正相关。对中国和欧洲小麦品种 Vp1
变异类型检测, 共发现 5种基因型, 分别是 Vp1Ba、
Vp1Bb、Vp1Bc、Vp1Bd 和 Vp1Be[9-10]。Utsugi 等[11]
同样发现具有较高休眠性的品种对 ABA 敏感性要
高于非休眠性品种, 3B 染色体上 Vp1B 表达起主导
作用, 并与种子休眠性呈正相关; ABA 处理后胚中
TaVp1B mRNA含量明显提高, 其编码蛋白 Vp1B可
以激活 Em 基因表达和抑制 α-淀粉酶的活性, 从而
影响种子休眠性。但小麦 Vp1 启动子在穗发芽抗性
中的作用和其所介导的 ABA 应答机制目前尚未见
报道。
玉米Vp1启动子和拟南芥的同源基因ABI3启动
子均为组织特异性启动子, 主要在胚中表达。但当
受到 ABA和干旱、高盐等逆境诱导时, 其表达程度
均有提高 , 并在茎等组织中表现出不同量的表达 ,
呈现出非组织特异性特征[12-13]。深入研究小麦 Vp1
启动子, 对了解不同逆境条件下 Vp1 的表达调控及
其在小麦穗发芽抗性中的作用具有重要的意义, 同
时也可为进一步利用此启动子进行抗逆基因工程操
作提供依据。本研究克隆了小麦 B基因组 Vp1启动
子, 并构建了系列缺失载体。通过瞬时表达和在转
基因小麦中的稳定表达, 明确了启动子及所含元件
的特性和功能, 为进一步解析小麦 Vp1 基因介导的
穗发芽抗性机制奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
采用小麦品种万县白麦进行 Vp1 启动子分离,
兰考 906 成熟胚诱导愈伤进行瞬时表达研究, 四倍
体小麦 Stewart 用于农杆菌转化。植物表达载体
pBI121 由本实验室保存。Gateway pENTR Direc-
tional TOPO Cloning Kits和 Gateway LR Clonase II
Enzyme Mix购自 Invitrogen公司。农杆菌菌株AGL1,
pAL154和 pGII-UB载体由英国 John Innes Centre的
Mark Smedley博士提供。
1.2 Vp1启动子的分离及功能预测
以穗发芽抗性品种万县白麦 Vp1B 基因序列为
模板在 GenBank 中 Blast, 获得含有 Vp1B 基因及其
上游序列的 BAC序列(GenBank登录号为 FN564428),
并以此序列为模板设计引物 Bi-TF 和 Bi-TR (表 1),
分离小麦 Vp1基因上游 2 232 bp的启动子。
利用启动子顺式作用元件在线分析网站 PLACE
(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalup.htm)和
PlantCARE(http://www.bioinformatics.psb.ugent.be/
webtools/plantcare/html)对 Vp1 启动子所含功能元件
生物信息学预测。
1.3 小麦Vp1启动子瞬时表达和植物表达载体构建
1.3.1 瞬时表达载体构建 根据生物信息学预测
结果, 采用 5′缺失的方法构建瞬时表达载体, 5′上游
引物分别为 Bi-1822F、Bi-1129F、Bi-852F、Bi-660F
和 Bi-319F, 下游引物 Bi-TR (表 1), PCR扩增长度分
别为 1 822、1 129、852、660和 319 bp的启动子缺
失片段。将分离的缺失片段用 Hind III和 BamH I酶
切后, 与相同酶切后的 pBI121 载体片段连接, 用于
构建 GUS报告基因植物表达载体。以 2 232 bp的启
动子为例, 其瞬时表达载体构建方法如图 1。
1.3.2 植物表达载体的构建 采用 Gateway 方法
构建农杆菌介导的植物表达载体, 其方法如图 2 (以
2 232 bp的启动子为例)。首先以瞬时表达载体为模
板利用 PCR 扩增方法获得启动子融合 GUS 基因及
终止子的表达盒, 上游引物分别为 Ag-TF、Ag-1822F、
Ag-1129F、Ag-852F、Ag-660F 和 Ag-319F, 下游引
物为 Ag-TR (表 1)。参照 Gateway pENTR Directional
TOPO Cloning Kits说明书(Invitrogen), 将 PCR纯化
产物分别与 pENTR 载体按照摩尔比 1∶1 混合, 室
第 10期 孙永伟等: 小麦穗发芽抗性相关 Vp1基因启动子的分离及功能验证 1745
表 1 本实验中所用引物序列
Table 1 Primer sets used in this study
引物名称
Primer name
引物序列
Primer sequence (5′–3′)
退火温度
Annealing temperature (°C)
Bi-TF ACGAAGCTTCCGTGCTATCATTCGTAAAGTCGG 63
Bi-TR CTAGGATCCGAGAAGGAGATGTGATGTGTGTGTGC 62
Bi-1822F AATAAGCTTGACGCAAATGTAATACTCCCTCTGTTCAC 61
Bi-1129F ATAAAGCTTGAATTGAGGGAGTACAAGGCGACC 63
Bi-852F CAACGCCCACACCAGGTACATG 58
Bi-660F CTAGTTCCGAGACAGCCCCTGG 62
Bi-319F GTCGAAGCCCTCTCGCTGAAG 58
Ag-TF CACCCCGTGCTATCATTCGTAAAGTCGG 61
Ag-TR GGATGTGCTGCAAGGCGATTA 60
Ag-1822F CACCGACGCAAATGTAATACTCCCTCTGTTCAC 59
Ag-1129F CACCGAATTGAGGGAGTACAAGGCGACC 61
Ag-852F CACCCAACGCCCACACCAGGTACATG 56
Ag-660F CACCCTAGTTCCGAGACAGCCCCTGG 60
Ag-319F CACCGTCGAAGCCCTCTCGCTGAAG 56
GUSF AGTGTACGTATCACCGTTTGTGTGAAC 60
GUSR ATCGCCGCTTTGGACATACCATCCGTA 60
图 1 瞬时表达载体构建过程
Fig. 1 Construction of transient expression vector
温下连接 5 min, 将连接产物热激转化大肠杆菌
DH5α后涂布在含有 50 mg L1 kanamycin 的平板上
筛选, 挑取单菌落进行 PCR 鉴定, 阳性克隆提取质
粒后测序正确的即为构建成功的 Entry 载体。参照
Gateway LR Clonase II Enzyme Mix 说 明 书
(Invitrogen), 在 0.5 mL EP管中加入 Entry clone质粒
(50~150 ng) 3 μL, pGII-UB质粒(150 ng) 1 μL, TE
buffer (pH 8.0) 4 μL, LR Clonase II Enzyme Mix 2 μL,
短暂混匀后 25℃孵育 1 h, 待反应完全后加入 1 μL
蛋白酶 K于 37 10 min℃ 终止反应。取 2 μL反应液
热激转化大肠杆菌 DH5α 后涂布在含有 50 mg L1
ampicillin的平板上筛选, 挑取单菌落进行 PCR鉴定,
阳性克隆提取质粒后测序正确的即为构建成功的表
达载体。
1.4 小麦成熟胚愈伤组织的瞬时表达及逆境诱导
将培养 2~3 周的兰考 906 小麦成熟胚愈伤组织
转移到高渗培养基(SD2培养基添加 0.2 mol L−1甘露
醇和 0.2 mol L−1山梨醇)中央区域, 处理 4~8 h后采
用基因枪方法轰击小麦愈伤组织, 将转化后的小麦
愈伤组织转移到普通 SD2 培养基上 , 或分别含有
100 μmol L−1 ABA、2% PEG、200 mmol L−1 NaCl、
50 μmol L−1 SA和 50 μmol L−1 GA的 SD2培养基上。
将接种在 SD2 培养基上的转基因愈伤组织置 4℃冰
箱中, 其他愈伤组织置 25℃培养箱内, 处理后恢复
培养 4 d。
1.5 农杆菌介导方法转化四倍体小麦
将表达载体分别与辅助载体 pAL154按 1∶1比
例均匀混合后, 采用电击法转入农杆菌AGL1, 参照
He等[14]的方法转化四倍体小麦 Stewart。
1.6 转基因小麦的分子检测
采用 CTAB的方法提取转基因小麦基因组 DNA,
并利用 GUS基因特异性引物 GUSF/GUSR检测阳性
植株(表 1), 预期产物长 1 051 bp, 扩增程序为, 94℃
预变性 5 min; 94℃变性 30 s, 62℃退火 45 s, 72℃延
伸 1 min, 35个循环; 72℃延伸 10 min, 扩增产物经
1%琼脂糖凝胶电泳后检测特异条带。
1746 作 物 学 报 第 37卷
图 2 植物表达载体构建过程
Fig. 2 Flow chart for construction of the wheat expression vector
1.7 转基因小麦组织器官外源 ABA诱导方法
随机挑选 3 株 T2代转基因株系材料, 将各组织
分别置于含有 50 µmol L−1 ABA的MS液体培养基中,
12 h后进行组织化学染色。
1.8 GUS组织化学染色方法
X-Gluc染色反应液成分为 50 mmol L1 Na3PO4、
0.1% Trition-100、20%甲醇和 0.5 mg mL1 X-Gluc (pH
7.0)。待测组织与该反应液在 37℃保温 3~5 h后, 用
95%乙醇将叶片等绿色组织脱色, 最后用电镜拍照。
2 结果与分析
2.1 Vp1启动子的分离及所含功能元件预测
利用生物信息学结合 PCR的方法从穗发芽抗性
品种万县白麦中克隆了 2 232 bp的 B基因组 Vp1启
动子。该启动子无典型的TATA-box和CAAT-box, 含
有 9 个脱落酸响应元件 ABRE、2 个 DREB 和 6 个
MYB干旱响应元件、3个赤霉素响应元件 GARE、1
个水杨酸响应元件 TCA-E、2 个茉莉酸甲酯响应元
件 TGACG-motif、4个 SKn-1和 1个 RYREPE胚乳
特异表达元件以及其他一些与光、热、离子等应答
有关的顺式作用元件(表 2和图 3)。
2.2 启动子缺失系列驱动 GUS 在小麦愈伤组织
中的表达
为了分析 Vp1 启动子不同区段的功能, 构建了
系列缺失片段类型瞬时表达载体。各种缺失类型所
含元件见图 4。Vp1P2232::GUS 转化的愈伤组织在
不受逆境诱导时, 没有启动 GUS基因的表达。低温、
ABA 和 GA 诱导后, 愈伤组织中 GUS 表达明显增
加。其中, 低温诱导 660 bp 以上启动子片段驱动
GUS表达增强; 在 ABA处理条件下, 852 bp以上启
动子驱使 GUS 表达明显增强; 而 GA 处理则只能促
进 Vp1p2232::GUS、Vp1p1822::GUS 和 Vp1p1129::
GUS转化愈伤组织中 GUS的表达。随着缺失片段长
度的增加, 不同诱导条件下的愈伤组织颜色逐渐变
淡。PEG和 NaCl处理未明显诱导 GUS表达(图 5)。
2.3 转基因小麦中的 Vp1启动子表达特性分析
PCR 检测获得 56 个转启动子各缺失片段类型
基因阳性株系(图 6), 其中 Vp1p2232::GUS 2 株,
Vp1p1822::GUS 11株, Vp1p1129::GUS 15株, Vp1p852::
GUS 15株, Vp1p660::GUS 3株, Vp1p319:: GUS 10
第 10期 孙永伟等: 小麦穗发芽抗性相关 Vp1基因启动子的分离及功能验证 1747
表 2 Vp1B 启动子所含顺式调控元件
Table 2 cis-elements in the isolated Vp1B promoter region
元件
Element
功能
Function
数量
Number
核心序列
Core sequence (5′–3′)
位置
Site (bp)
ABRE 脱落酸响应元件
cis-acting element involved in the abscisic
acid responsiveness
9 GCCACGTGGG
CGGCCCC
CACGCGCC
ACGGGCCACGGG
TACGAGGCGG
GCCTCGGCG
CCGTGTAG
TCCAC
TCGGCA
192 to 201
402 to 408
467 to 474
489 to 500
553 to 562
717 to 725
727 to 734
749 to 753
784 to 789
DREB 干旱响应元件
cis-acting element involved in dehydration
responsiveness
2 GTCGGC
GTCGGT
584 to 589
2242 to 2247
GARE 赤霉素响应元件
Gibberellin-responsive element
3 AAACAGA
TAACAAA
CCTTTT
1012 to 1018
1619 to 1625
2137 to 2142
MYB 干旱响应元件
cis-acting element involved in the
dehydration responsiveness
6 TAACTGC
TAACTG
TAAACCA
TAACGG
TAAACCA
TAACGG
128 to 134
427 to 432
1890 to 1896
1944 to 1949
2122 to 2128
2176 to 2181
RYREPEATBNN 胚乳特异表达元件
cis-acting regulatory element required for
endosperm expression
1 CCATGCAG 375 to 382
Skn-1_motif 胚乳特异表达元件
cis-acting regulatory element required for
endosperm expression
4 GTCATC
GTCATC
CATGAC
TGACTG
391 to 396
774 to 779
2036 to 2041
2150 to 2155
TCA-E: 水杨酸响应元件
cis-acting element involved in salicylic acid
responsiveness
1 TCAGTAGAGG 2004 to 2013
TC-rich repeats 逆境相关响应元件
cis-acting element involved in defense and
stress responsiveness
1 ATTTTTTTCA 1861 to 1870
TGACG-motif 茉莉酸甲酯响应元件
cis-acting regulatory element involved in the
MeJA-responsiveness
2 CACGCGGC
CGTCA
402 to 409
1039 to 1043
TGA-E 激素响应元件
Auxin-responsive element
1 AACGAC 1760 to 1765
图 3 Vp1B 启动子所含顺式作用元件结构图
Fig. 3 Synopsis of regulatory elements in Vp1B promoter
DREB: 干旱响应元件; MYB: 干旱响应元件; SKn-1: 胚乳特异表达元件; RYREPEATBNN: 胚乳特异表达元件; GARE: 赤霉素响应元
件; TCA-E: 水杨酸响应元件; TGACG-motif: 茉莉酸甲酯响应元件; TC-rich: 逆境相关响应元件; TGA-E: 激素响应元件; ABRE: 脱落
酸响应元件。
DREB: cis-acting element involved in dehydration responsiveness; MYB: cis-acting element involved in dehydration responsiveness;
Skn-1_motif: cis-acting regulatory element required for endosperm expression; RYREPEATBNN: cis-acting regulatory element required for
endosperm expression; GARE: gibberellin-responsive element; TCA-E: cis-acting element involved in salicylic acid responsiveness;
TGACG-motif: cis-acting regulatory element involved in the MeJA-responsiveness; TC-rich: cis-acting element involved in defense and
stress responsiveness; TGA-E: auxin-responsive element; ABRE: cis-acting element involved in the abscisic acid responsiveness.
株。选取 T2代不同生长时期的各组织器官进行小麦
Vp1B基因启动子组织特异性表达分析(表 3和图 7),
结果表明, 6种 Vp1B基因启动子缺失片段类型均可
以启动 GUS基因在花药、穗轴、根中表达, 同时表
现出元件特异性。例如在糊粉层中, 只有 319 bp的
启动子片段不能驱动 GUS 基因表达, 当启动子大
1748 作 物 学 报 第 37卷
图 4 VP1 启动子缺失系列融合载体示意图
Fig. 4 Schematic show of 5′-truncated Vp1 promoter-reporter fusion vector series
图 5 不同处理条件下小麦成熟胚愈伤组织转化 VP1 启动子 5′端连续片段表达载体的 GUS 组织染色结果
Fig. 5 Histochemical GUS staining of wheat mature embryo induced calli transformed by various Vp1 promoter reporter fusion
constructs under different treatments
ABA、PEG、GA和 NaCl的处理浓度分别为 100 μmol L1, 2%, 50 μmol L1和 200 μmol L1。
Contentrations were 100 μmol L1 for ABA; 2% for PEG, 50 μmol L1 for GA, and 200 μmol L1 for NaCl.
图 6 T0 代转基因小麦的 PCR 检测
Fig. 6 PCR analysis of T0 generation transgenic wheat lines
M: DL2000; 1: CK+; 2: CK; 3~6和 10: 阳性植株;
7~9: 非转基因植株。
M: DL2000; 1: CK+; 2: CK; 3–6 and 10: transgenic lines;
7–9: non-transgenic lines.
于 660 bp时能有效驱动 GUS基因表达; 但是在颖壳
中大于 1 129 bp的启动子不能启动 GUS基因表达, 而
小于 852 bp的启动子片段可以启动 GUS基因表达。
另外, 在茎和叶中, 6种表达载体均不能启动GUS表
达, 然而当有外源 ABA 存在时, 在茎节中表现出诱
导表达特性, 当启动子片段大于 660 bp 时, 诱导表
达结果很明显。但在叶中, 在有或无外源 ABA处理
条件下均无 GUS基因表达。
3 讨论
Vp1 基因在种子的成熟、休眠及发芽过程中起
关键作用[3,15-16]。目前, 已经相继分离了拟南芥 ABI3
及玉米、豌豆的Vp1启动子, 并进行了功能分析[12-13,17],
其中对玉米 Vp1和拟南芥 ABI3的启动子的研究最为
深入, 它们均属于组织特异性启动子并具有诱导表
达特性[12-13]。我们在前期研究中发现, 位于小麦 3B
染色体上的 Vp1B 直接影响穗发芽抗性, 不同 Vp1B
等位基因的表达量与穗发芽抗性直接相关, 而且所
介导的 ABA 敏感性不同[7-8]。Utsugi 等[11]也指出,
Vp1B 是种子休眠过程中起主导作用的重要转录调
节因子之一, 参与调控种子成熟过程中休眠相关基
因的表达。然而, 抗、感穗发芽品种中是否存在调
控序列的差异以及小麦 Vp1 如何实现自我调控, 目
前尚不清楚。
为了解 Vp1 介导的小麦穗发芽抗性机制, 我们
从抗、感穗发芽品种分离了 B基因组 Vp1启动子, 发
第 10期 孙永伟等: 小麦穗发芽抗性相关 Vp1基因启动子的分离及功能验证 1749
表 3 不同启动子缺失系列驱动 GUS 在转基因小麦不同组织中的表达模式
Table 3 Tissue specific expression manner of GUS in transgenic wheat lines harboring different 5′ truncated Vp1 promoter-reporter
fusion vectors
茎节 Node 载体
Vector
根
Root ABA ABA+
叶
Leaf
花药
Anther
穗轴
Axis
颖壳
Glume
胚
Embryo
糊粉层
Aleurone layer
Vp1p319::GUS + + + +
Vp1p660::GUS + + + + + +
Vp1p852::GUS + + + + + +
Vp1p1129::GUS + + + + +
Vp1p1822::GUS + + + + +
Vp1p2232::GUS + + + + +
ABA: 无外源 ABA; ABA+: 添加 100 μmol L1外源 ABA; +: GUS表达; : GUS未表达。
ABA: without exogenous ABA; ABA+: with 100 μmol L1 exogenous ABA; +: GUS expression; : no expression of GUS.
图 7 GUS 在转基因小麦中的表达
Fig. 7 GUS expression in transgenic wheat lines
A: 种子中 GUS染色; B: 茎节中 ABA诱导后 GUS染色; C: 未处理茎节 GUS染色; D: 穗轴和颖壳中 GUS染色; E: 花药中 GUS染色。
A: GUS expression in seed; B and C: GUS expression in node treated with exogenous ABA (B) and without ABA treatment (C); D: GUS
expression in axis and glumes; E: GUS expression in anther.
现抗、感穗发芽小麦的 Vp1 调控区序列一致。抗、
感穗发芽小麦品种中的 B基因组 Vp1编码区序列分
析表明, 在第 3 内含子中反转座子的插入和转座子
的缺失, 导致了不同 Vp1B等位基因的表达差异, 从
而最终表现为穗发芽抗性不同 [7-8]。为进一步了解
Vp1调控及其对 ABA的应答机制, 我们利用万县白
麦中分离出的 B 基因组 Vp1 启动子, 通过瞬时表达
和在转基因小麦中的稳定表达进行了缺失功能分
析。瞬时表达结果表明, 该启动子在没有逆境诱导
的情况下, 不能启动下游基因的表达; 在低温、ABA
和GA等条件诱导下, 可以启动下游基因表达。因此,
可以推断 Vp1B 启动子为诱导型启动子。但 Vp1 启动
子的 3 个缺失表达载体 Vp1p2232::GUS、Vp1p1822::
GUS 和 Vp1p1129::GUS 转化的愈伤组织在低温、
ABA 和 GA 诱导后 GUS 表达明显增强(图 5), 与
pBI121相比, PEG和 NaCl的诱导效果并不明显, 说
明该启动子只对低温、ABA 和 GA 作出应答, 以
ABA 处理后的效果最为明显, 推测可能与该启动子
片段含有 9个 ABRE元件有关。
本研究分离的 Vp1启动子含有 9个ABA响应元
件 ABRE和 3个 GA响应元件 GARE (表 2), 说明在
小麦种子发育、成熟和萌发过程中, 内源激素 ABA
和 GA 对 Vp1 的表达起重要的调控作用。在种子发
育过程中, ABA 的主要作用是促进胚发育, 阻止水
解酶(主要是 α-淀粉酶)的产生, 抑制萌发; 在未成
熟种子中则启动休眠相关基因表达, 导致并保持成
熟种子的休眠[18]。研究发现, 小麦种子的休眠性与
种子中 ABA 水平无关, 而与胚对 ABA 的敏感性相
关[19]。相反, GA能够促进胚乳中储藏物代谢, 可以
解除种子休眠, 从而诱发种子萌发[20]。GA 和 ABA
在种子萌发过程中存在互作, ABA可以直接干预GA
的合成而抑制萌发。可以推测, 9 个 ABA 响应元件
ABRE 的存在, 可以在种子成熟过程中, 对内源激
素 ABA作出应答, 启动 Vp1基因的高效表达, 从而
激活下游 ABI5等基因的表达, 并对启动子区域含有
ABRE元件和 Sph元件的相关基因, 如 Em基因、α-
淀粉酶和迟熟 α-淀粉酶等起重要调控作用, 进而促
进种子成熟和对 ABA 等的应答, 同时, 抑制 ABI1 和
ABI2 等对 ABA 信号传导起负调控基因的表达[21-22]。
有趣的是, Vp1 启动子中还含有 3 个 GA 响应元件
GARE, GA 处理后, 含有 GARE 的启动子片段导致
GUS 表达明显增强。这表明在种子萌发过程中, 随
1750 作 物 学 报 第 37卷
着种子内源GA含量的增加, GA和ABA可通过互作
和调控相关基因的表达, 控制种子休眠、萌发和对
逆境的适应性。
对转基因小麦研究结果表明 , 本研究分离的
2 232 bp Vp1启动子的活性表现为组织特异性, 在种
子糊粉层、花药、穗轴和营养器官根中均不同程度
地表达, 在其他组织没有表达。值得指出的是, 本研
究结果与 Ng等[12]对拟南芥 ABI3启动子研究结果一
致, 在转基因小麦叶片中, 在有或无外源 ABA 诱导
条件下, 均未观察到 GUS 基因的表达。但是所有启
动子片段均能驱动 GUS基因在根中表达(表 3), 推测
与 Vp1基因的 5′ UTR有关。在 5′ UTR不存在情况
下, 拟南芥 ABI3启动子也表现根部表达特异性[12]。另
外, 本研究还发现全长 2 232 bp的 Vp1启动子只能
驱动 GUS在糊粉层中表达, 并没有像预期那样在胚
中表达。推测原因可能是该启动子长度不够, 2 232
bp 区段的启动子中并不包含胚特异性元件, 或者由
于 5′ UTR 的原因导致 Vp1 启动子表达组织特异性
发生改变。Rouster等[23]发现将胚特异表达启动子的
5′ UTR置换糊粉层特异表达基因的 5′ UTR, 可导致
下游基因在胚和糊粉层中同时表达。另外, 与种子
萌发相关的 α-淀粉酶和迟熟 α-淀粉酶基因大多数在
糊粉层表达, Vp1启动子在糊粉层的特异表达, 在一
定程度上解释了 Vp1 作为转录因子, 可通过对 α-淀
粉酶和迟熟 α-淀粉酶基因的调控 , 抑制种子萌发 ,
促进休眠, 最终表现穗发芽抗性。
本研究还发现, 不同调控元件的存在的确导致
Vp1 启动子的组织特异性。例如, 在种子中 GUS 基
因主要在糊粉层中表达, 然而 319 bp的启动子却不
能启动GUS基因表达, 当启动子片段大于 660 bp时,
则能启动 GUS基因在糊粉层中表达(表 3), 因此, 可
以确定在 319~660 bp之间有糊粉层特异性元件或种
子特异性元件存在 , 生物信息学预测结果表明在
319~660 bp 之间有 2 个胚乳特异表达元件, 分别是
SKn-1 和 RYREPE, 推测在糊粉层中的表达可能与
这 2个元件相关; 在颖壳中, Vp1p852::GUS、Vp1p660::
GUS 和 Vp1p319::GUS 载体有表达, 而当启动子片
段大于 1 129 bp时, GUS基因并没有表达(表 3), 生
物信息学预测发现, 在 852 bp至 1 129 bp区间, 只
存在对 GA 应答元件 GARE 和甲基茉莉酸应答元件
TCACG motif, 是否有负调节因子或者其他组织特
异性元件导致该情况的发生, 尚需进一步研究。
在转基因小麦中 Vp1启动子也表现出诱导特性,
当有外源 ABA存在的情况下, 除 319 bp的启动子外,
其他启动子片段均可诱导GUS基因在转基因小麦茎
节中表达。根据启动子功能元件预测结果, 319 bp启
动子只存在 1个 ABRE应答元件(图 4), Shen等[24-25]
研究表明, 一个 ABRE并不能有效对 ABA的诱导作
出应答, 必须存在另外一个ABRE或CE核心序列才
能发挥作用。
4 结论
从穗发芽抗性品种万县白麦中首次克隆了长度
为 2 232 bp的 B基因组 Vp1启动子, 该启动子含有
ABRE、GARE及 DREB等顺式作用元件, 为诱导型
启动子, 在低温、ABA、GA诱导下可有效启动下游
基因表达, 但随着启动子片段长度变短, 其启动下
游基因表达的效率逐渐降低。该启动子在转基因小
麦中表现组织特异性, 在没有诱导的情况下, 可以
启动 GUS基因在糊粉层、花药、穗轴和根中表达, 外
源 ABA诱导后可在茎节中表达。因此 Vp1B启动子
为组织特异性启动子, 但在低温、ABA、GA诱导下
可有效启动下游基因表达。
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