全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(12): 2285−2292 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家烟草专卖局重点科技项目(110200601001)和中国农业科学院作物科学研究所基本科研业务费资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 孙玉合, E-mail: yhsun@163.com
第一作者联系方式: E-mail: lfx-2@163.com
Received(收稿日期): 2011-05-23; Accepted(接受日期): 2011-09-18; Published online(网络出版日期): 2011-09-29.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20110929.1551.005.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.02285
四种细胞质来源的烟草不育系线粒体 SSR位点差异
李凤霞 杨爱国 崔萌萌 龚达平 王卫锋 孙玉合*
中国农业科学院烟草研究所 / 中国农业科学院烟草遗传改良与生物技术重点开放实验室, 山东青岛 266101
摘 要: 采用线粒体 SSR(mtSSR)方法对普通烟草 4种不育类型的不育系、不育胞质来源的烟草野生种和保持系进行
线粒体位点差异分析, 探讨 mtSSR位点差异与胞质不育的关系。在烟草线粒体基因组上检索到 24个能重复稳定扩增
出片段的 mtSSR, 对烟草属植物的这些 mtSSR分析结果显示, 普通烟草种内 mtSSR较为保守, 多态性比率仅 10.5%;
4种不育类型的各自不育系与保持系、不育胞质上存在多个差异位点, 在 Nta(sua.)S类型中差异位点在线粒体编码基
因 orf138a、orf138c以及 orf102~orf210的基因间区; 在 Nat(gla.)S类型中, 差异位点在线粒体 orf138a、orf138c两个
编码基因以及 nad2~sdh3、rps12~orf125b、orf116~orf101b、orf102~orf210的 4个基因间区; 在 Nta(rep.)S类型中, 差
异位点在线粒体编码基因 orf190以及 orf104c~orf202的基因间区; 在 Nta(rus.)S类型中, 差异位点在线粒体编码基因
orf137 以及 rps12~orf125b 的基因间区。这些位点差异可能与各自的雄性不育有关。另外, mtSSR 引物 TMS20 在
Nat(sua.)S、Nat(gla.)S、Nat(rep.)S和 Nat(rus.)S类型的雄性不育系中分别扩增出了 184、172、212和 225 bp的片段,
表明可用该引物区分 4种烟草 CMS类型。
关键词: 烟草; 不育胞质类型; 线粒体 DNA; SSR
Mitochondrial Microsatellite Variability of Tobacco CMS Lines with Four Dif-
ferent Cytoplasms
LI Feng-Xia, YANG Ai-Guo, CUI Meng-Meng, GONG Da-Ping, WANG Wei-Feng, and SUN Yu-He∗
Key Laboratory of Tobacco Genetic Improvement and Biotechnology, Tobacoo Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Qing-
dao 266101, China
Abstract: Sequence variation of the mitochondrial DNA has a direct relation with cytoplasmic male sterility (CMS). In this study,
we analyzed mtSSR variability of four sterile cytoplasm types, including four CMS lines, their maintainer lines and sterial cytoplasm
sources, and explored the relationship between mtSSR variability and CMS. Based on the entire mitochondrial DNA sequence of
Nicotiana tabacum, we identified 39 mtSSR loci having more than ten mononucleotide repeats and 24 mtSSR markers that can be
used to analyze mitochondrial DNA variability of four sterile cytoplasm types. The results showed that the mtSSR polymorphism was
very low in N. tabacum, which was 10.5%, and there were some different loci between the CMS lines and their maintainer lines, the
wild tobacco provided the sterile cytoplasm. Such as, in the Nat(sua.)S, the different loci were located in coding regions of orf138a,
orf138c and intergenic region orf102–orf210; in the Nat(gla.)S, the different loci were located in two coding regions of orf138a,
orf138c and four intergenic regions nad2–sdh3, rps12–orf125b, orf116–orf101b, orf102–orf210; in the Nat(rep.)S, the different loci
were located in coding region orf190 and intergenic region orf104c–orf202; in the Nat(rus.)S, the different loci were located in cod-
ing regions of orf137 and rps12–orf125b. These different loci likely related to their CMS. The results also showed that the fragments
of 184, 172, 212 and 225 bp were amplified by mtSSR primer TMS20 in four types of CMS of ms G-28, 86-6, 98-43, 116, respec-
tively, and using this primer we could distinguish the four types of CMS of Nat(sua.)S, Nat(gla.)S, Nat(rep.)S, Nat(rus.)S between
each other.
Keywords: Tobacco; Sterile cytoplasm type; Mitochondrial DNA; SSR
烟草胞质雄性不育系(cytoplasmic male sterility line,
CMS line)的推广应用是当前烟叶生产的主要发展方向之
一, 至 2009年, 我国烤烟不育系种植面积达 53.3万公顷,
占当年烤烟总面积的一半以上, 所使用的不育胞质来源
2286 作 物 学 报 第 37卷

于烟草属野生烟草种 Nicotiana suaveolens, 为我国烟草
育种和生产上使用的唯一不育胞质[1]。这种单一细胞质的
长期大范围使用在生产上存在潜在危害, 只有增加烟草
CMS 的胞质来源, 才可促进烟草生产的可持续发展。此
后, 国内外烟草育种家致力于烟草新胞质不育系的选育,
通过体细胞融合、远缘杂交等方法先后培育的不育胞质分
别来源于 N. bigelovii、N. undulata、N. debneyi、N.
megalosiphon、N. plumbaginifolia、N. glauca和 N. repanda
等不育系以及自然突变获得的晒烟雄性不育系。不同胞质
来源不育系的败育阶段、败育特点以及表现型各不相同[2-9],
有必要从分子水平探讨其异同。大量研究证明, 线粒体基
因组是细胞质育性因子的载体, 线粒体 DNA (mitochon-
drial DNA, mtDNA)的变异与细胞质雄性不育有直接联
系[10-11]。Levings 和 Pring[12]利用多种限制性内切酶消化
玉米正常胞质和 T 型不育系的 mtDNA, 首次发现两者酶
切图谱存在明显差异, 证明了 CMS 与线粒体基因组的突
变存在相关性。而后相继出现了大量用 RFLP、AFLP、
AP-PCR和 RAPD等分子标记手段进行 mtDNA多态性与
胞质雄性不育关系的研究, 在玉米、矮牵牛、水稻、小麦、
棉花等农作物不育系 mtDNA 上找到了可能与 CMS 有关
的基因座位[12-18]。
近年来, 烟草胞质不育的分子机理研究有很大进展。
Bergman等[19]发现 Nta(rep.)S类型不育系线粒体基因 atp1
同 orf274共转录本升高导致其 ATP/ADP比率显著降低是
该不育类型不育的一个特点; Fitter 等[20]发现 Nta(sua.)S
的不育系线粒体存在融合和重排; 赵婷等 [21]和朱腾义等
[22]分别获得了 Nta(tab.)S 的不育类型存在显著相关性的
atp6、coxII 基因 SNP 位点; 刘齐元等[23]发现 Nta(tab.)S
和Nta(sua.)S的不育系和保持系线粒体基因组有明显的差
异。但是对其他胞质不育类型的烟草雄性不育分子机理尚
未展开研究, 对我国烟草生产上唯一使用的 Nta(sua.)S不
育类型 , 与不育相关的线粒体基因座位也没有提到 , 而
且不同雄性不育类型的线粒体差异也不清楚。线粒体微卫
星(mtSSR)是近年来发展起来的一种新型高效的分子标记
技术, 该技术不但具有微卫星标记共显性、高多态性、分
布广泛等有点 , 又兼顾到线粒体基因组结构简单 , 相对
保守, 单亲遗传等特点, 在植物细胞质遗传及系统发育、
胞质雄性不育鉴定等方面得到了很好的应用[24-27]。由于
传统的 SSR 操作通过银染及人工读带进行基因型分型研
究, 方法虽然成熟但耗时、耗力, 多批次的数据收集和分
析时存在一定的难度, 而基于荧光标记、毛细管电泳和激
光检测的荧光标记 SSR技术是将经荧光标记的 PCR扩增
片段和标准分子量(内标)在同一泳道中进行毛细管电泳,
通过 CEQ 片段分析软件分析结果, 精确计算出微卫星等
位变异扩增片段的大小, 具有分辨率高、自动化, 适合通
量检测的优点 [28], 在大麦 [29]、黑麦草 [30]、莴苣 [31]、竹
子[32]等多种植物 SSR 分子标记研究中显示出极为广阔的
应用前景。
本研究根据普通烟草的线粒体全基因组测序结果[33],
对腺嘌呤和胸腺嘧啶单核苷酸超过 10 个拷贝的区域进行
搜索并设计引物 , 利用 mtSSR分子标记技术, 对不同胞
质来源的雄性不育系、保持系和相应的不育胞质进行
mtSSR扩增, 并采用荧光标记毛细管电泳检测技术, 分析
不同类型的雄性不育系之间以及各种雄性不育类型的雄
性不育系和其对应的保持系、不育胞质的 mtSSR差异, 来
探寻与各种雄性不育类型相关的线粒体基因座位。
1 材料与方法
1.1 试验材料
所用的 4 份不育系材料是由中国农业科学院烟草研
究所分别通过回交转育或体细胞融合再转育 10代以上而
成, 代表了烟草 4 种不同胞质雄性不育类型[2,6-7,34], 其对
应的各自保持系及不育胞质来源的烟草种由中国烟草遗
传育种研究(北方)中心提供(表 1)。

表 1 烟草 4种不育胞质类型的不育系和保持系
Table 1 Male sterile lines and maintainers with four types of
sterile cytoplasm
不育胞质来源/类型
Origins/types of sterile cytoplasm
不育系
Male sterile line
保持系
Maintainer
N. suaveolens/Nat(sua.)S ms G-28 G-28
N. glauca/Nat(gla.)S 86-6 G-28
N. repanda/Nat(rep.)S 98-43 K326
N. rustica/Nat(rus.)S 116 NC82

1.2 烟草高纯度线粒体提取
参照 Sugiyanma 等 [33]和李文强等 [35]方法 , 略有改
动。将生长至 10~12周的烟草材料在 30℃条件下黑暗培
养 3~5 d, 取 40 g叶片, 去除主叶脉, 4℃下过夜, 加入 3
倍体积预冷的匀浆缓冲液(0.5 mol L–1蔗糖, 10 mmol L–1
EDTA, 50 mmol L–1 Tris-HCl, pH 7.5, 1% BSA, 10 mmol
L–1 β-巯基乙醇), 用组织匀浆器破碎组织, 10 min后加入
2倍体积匀浆缓冲液, 静置 20 min, 以 4层无菌纱布过滤,
滤渣加 3倍体积预冷的匀浆缓冲液继续破碎, 2次滤液合
并后于 900×g离心 10 min, 取上清 2 000×g离心 15 min,
并重复此步操作。将得到的上清液 18 000×g离心 15 min,
弃上清液, 得到粗线粒体沉淀。向每管沉淀中加入 5 mL
预冷的洗涤缓冲液 (0.4 mol L–1 蔗糖 , 50 mmol L–1
Tris-HC1, pH 7.5, 0.1% BSA)将沉淀重悬浮, 然后加入 5
U的 DNase I, 室温下反应 30 min, 18 000 ×g离心 15 min,
充分弃上清液 , 得到较纯的线粒体沉淀。向沉淀中加入
终浓度为 50 mmol L–1的 EDTA, 混匀后静置 10 min以终
止反应。然后加入 2 mL 洗涤缓冲液, 18 000×g 离心 15
min, 充分弃上清液。
1.3 线粒体 DNA的提取
向沉淀中加入 1 mL裂解缓冲液(25 mmol L–1 EDTA,
25 mmol L–1 Tris-HCl, pH 8.0, 0.5% SDS), 将沉淀重悬浮,
再加入终浓度为 100 μg mL–1蛋白酶 K, 37℃裂解 2 h, 裂
第 12期 李凤霞等: 四种细胞质来源的烟草不育系线粒体 SSR位点差异 2287


解期间每隔一段时间轻轻摇动一次。裂解结束后依次用苯
酚/氯仿/异戊醇(24∶24∶1)、氯仿/异戊醇(24∶1)抽提; 上
清液加 1/10体积 3 mol L–1醋酸铵和 2.0~2.5倍体积乙醇,
–20℃沉淀半小时以上, 12 000 ×g离心 10 min, 用 70%乙
醇洗涤 2次, 将沉淀于室温凉干, 加入 20~30 μL TE (pH
8.0)溶解 , 经 1%琼脂糖凝胶电泳检测后置–20℃保存待
用。
1.4 以 PCR检测烟草 mtDNA的纯度
以烟草 Actin基因(NTU60495)为核基因组内参, 设计
特异性引物 ActinF: 5-CAAGGAAATCACCGCTTTGG-3;
ActinR: 5-AAGGGATGCGAGGATGGA-3。PCR体系(20
μL)含 DNA 1 μL, 10×PCR buffer 2 μL、1 U Taq聚合酶、
25 mmol L–1 dNTP 1 μL, 0.15 μmol L–1上、下游引物各 0.5
μL。PCR扩增程序为 94℃预变性 5 min; 94℃变性 30 s,
62℃退火 30 s, 72℃延伸 45 s, 30 个循环, 72℃延伸 10
min。
1.5 mtSSR引物筛选与合成
从 NCBI 公共数据库 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
BA000042)下载烟草线粒体全基因组序列 , 利用 SSR
Finder软件, 对多聚 A(poly A)或者 T(poly T)超过 10的重
复进行搜索, 用 Primer 5.0设计引物。为配合 PCR产物的
毛细管电泳检测, 对设计的每对 SSR 引物的上游 5′端进
行 M13 通用序列(5-CACGACGTTGTAAAACGAC-3)加
尾。同时合成经 cy5荧光标记的 M13通用序列。
1.6 mtSSR扩增反应体系
PCR体系(20 μL)含线粒体 DNA约 30~50 ng, 10×PCR
buffer 2 μL、1 U Taq聚合酶、25 mmol L–1 dNTP 1 μL, 0.15
μmol L–1 mtSSR上游引物、0.01 μmol L–1下游引物、0.15
μmol L–1 cy5荧光标记 M13通用引物各 0.5 μL。PCR扩增
程序为 94℃预变性 5 min; 94℃变性 30 s, 58℃退火 30 s,
72℃延伸 45 s, 30个循环, 72℃延伸 10 min。
1.7 cy5荧光标记 mtSSR产物毛细管电泳检测
毛细管电泳检测的上样缓冲液包括去离子甲酰胺
(Sigma) 30 μL、DSS 400分子量内标 0.3 μL、经 50倍稀释的
PCR 产物 0.5 μL。于 CEQ8000 遗传分析系统(Beckman
Coulter, USA)上进行毛细管电泳, 分析系统电压 2.0 kV,
进样时间 30 s; 电泳电压 4.8 kV, 65 min。
2 结果与分析
2.1 烟草 mtDNA的纯度检测
经琼脂糖凝胶电泳检测, 所提取的烟草 mtDNA 无
明显降解现象(图 1)。利用烟草核基因组的 Actin基因特
异性引物, 分别以烟草总 DNA 和 mtDNA 为模板进行
PCR扩增, 结果发现, 该引物只能在总 DNA中扩增出约
105 bp 的特异性条带, 以 mtDNA 为模板没有扩增出任
何产物(图 2)。表明该方法提取的烟草 mtDNA完整性良
好, 而且无核基因组 DNA的污染, 可满足后续实验的要
求。

图 1 烟草 mtDNA的凝胶电泳
Fig. 1 Gel electrophoretic of mtDNAs for N. tabacum
M: D2000 marker; 1: G-28; 2: ms G-28; 3: N. suaveolens; 4: 86-6; 5: N.
glauca; 6: K326; 7: 98-43; 8: N. repanda; 9: NC82; 10: 116; 11: N.
rustica.

图 2 烟草 Actin基因的 PCR检测
Fig. 2 PCR amplification of Actin from N. tabacum
M: D600 marker; 1: nuclear DNA of K326; 2: mtDNA of G-28; 3: ms
G-28; 4: N. suaveolens; 5: 86-6; 6: N. glauca; 7: K326; 8: 98-43; 9: N.
repanda; 10: NC82; 11: 116; 12: N. rustica.

2.2 mtSSR引物筛选及扩增体系建立
通过电子查询 , 在烟草线粒体基因组序列中共发现
41个含有多聚 A或 T 超过 10的 SSR, 其中 3个(T)13 是
同一个序列在线粒体 DNA的 3次重复。以普通烟草线粒
体基因组为模板对 39 对烟草 mtSSR 特异引物进行筛选,
有 24对引物能重复稳定扩增出片段。在这 24个线粒体微
卫星中, 有 8个位于编码区, 1个位于基因的内含子, 其他
位于基因间区(表 2)。
2.3 mtDNA的 SSR分析
2.3.1 烟草属植物 mtSSR 多态性 用筛选的 24 对
mtSSR引物在 11份供试材料: 4个不育系 ms G-28、86-6、
98-43、116以及 3份普通烟草 G-28、K326和 NC82和提
供不育细胞质的 4个烟草种 N. suaveolens、N. glauca、N.
repanda和 N. rustica间进行 SSR扩增和毛细管电泳检测,
共检测到 40个等位变异位点, 其中多态性位点 27个, 占
67.5%。在 3 份普通烟草、4 个不育胞质来源的烟草野生
种以及 4 个不育系间的多态性分别为 10.5%、51.4%和
64.8% (表 3), 反映了在普通烟草种内线粒体差异不大,
基因组较为保守, 而来源于烟草属不同亚属、不同分组的 4
份烟草种的线粒体多态性远高于普通烟草种内。值得一提的
是 4种不同类型的不育系多态性位点比率达到 64.8%, 这与
其线粒体组成成分有很大关系, 由于它们都是通过普通烟
草与烟草属其他种融合、杂交形成, 不育系的线粒体包含普
通烟草的线粒体组分和相应的野生烟线粒体组分, 而且这
些组分之间还不断进行融合、重组与重排。
2288 作 物 学 报 第 37卷

表 2 烟草线粒体微卫星信息
Table 2 Tobacco mitochondrial microsatellite information
位点
Locus
重复序列
Repeat
引物序列
Primer sequence(5–3)
在 mtDNA中的位置
Position in mtDNA
微卫星基因位点
Location of mtSSR
片段大小
Size (bp)
TMs1 T12 CACGACGTTGTAAAACGACCGTGGGATCAACT
GCTCGTTTGATTTATGAAAGCCCGGTGA
2775–2942 Coding region
(orf138a) 168
TMs2 A12 CACGACGTTGTAAAACGACGCAGACGGTCCA
CTACTTATGCCACTGGATCAACTC
55560–55785 Intergenic region
(orf161–orf132) 225
TMs3 T13 CACGACGTTGTAAAACGACCGGTCGAATTCCA
AACCTTTTCCCTCGTAGAGTGGCGTCTTT
76869–77052
278369–278552
427619–427802
Intergenic region
(nad2–sdh3) 184
TMs4 T12 CACGACGTTGTAAAACGACCAAGGCTGTGTAA
GGGTGTGTCTGAGAACGAGTGGAATACCTGA
89418–89569 Intergenic region
(rps12–orf125b)
152
TMs5 A14 CACGACGTTGTAAAACGACCTGGGGGTCTTCA
TTCACTCTGAAGGGCTTATCGCTTCTCC
90062–90214 Intergenic Region
(rps12–orf125b) 153
TMs6 T10 CACGACGTTGTAAAACGACGTCAGCGAAGGA
AGGATAGAGACCGAAGGTAAGGAG
133285–133512 Intergenic region
(cox1–orf105a) 227
TMs7 T12 CACGACGTTGTAAAACGACCTGGATTGAATCT
TCCGCTTTCCCATCAATCATCCAACACA
140566–140760 Intergenic region
(orf158–ofr129) 195
TMs8 A11 CACGACGTTGTAAAACGACCGATTATGCTCCT
GCGGAAGTTGCTTCAATGGCTCGATATG
155566–155800 Coding region
(rps3) 235
TMs9 A11 CACGACGTTGTAAAACGACCAAGCAAGGGAT
GTCGTGAACAGGTCCCACCACCAACTCTA
157298–157470 Intron
(cox2) 173
TMs10 T11 CACGACGTTGTAAAACGACCTCTGCTTTTTCC
TGGATGCTATTTCCGACCTCTTGCATTG
179805–179954 Intergenic region
(trnD–orf171) 150
TMs11 T12 CACGACGTTGTAAAACGACCAGCCAGATCGTC
TGAAGTCATCCACAACCTAACTTGCACGA
195434–195636 Intergenic region
(orf116–orf101b) 203
TMs12 A17 CACGACGTTGTAAAACGACCGTCACCGTCAGC
ATTTGGTAAAAGGCGAACATCTCCATTG
228833–229035 Coding region
(orf138c) 203
TMs13 A10 CACGACGTTGTAAAACGACTCCTCCACTAGCA
GGTTTGGGATCTTCTATAATTTCG
256071–256266 Coding region
(orf190) 195
TMs14 A11 CACGACGTTGTAAAACGACACCAAGAAATGA
CCCGAAATCGCTTCTCAAGGCCCTCT
259914–260100 Coding region
(orf125e) 186
TMs15 T11 CACGACGTTGTAAAACGACTCTATGAAGTAGG
ACGAGATATGATAAAGGAAGCAG
262967–263162 Intergenic region
(atp1–orf120b) 195
TMs16 T13 CACGACGTTGTAAAACGACCTCGTCAAGAAA
GATCGAGCAGAGCTTCGCCCTTTGTATTG
268587–268737 Intergenic region
(orf120b–orf131b) 151
TMs17 T10 CACGACGTTGTAAAACGACCAGAAAAGGTCC
CCTCCTTCACTTTCGACGTTGCACAAAAG
288376–288561 Coding region
(nad1) 186
TMs18 A11 CACGACGTTGTAAAACGACCTTCTTGCCTGCT
AAGGGATTGCTCAAAATTAGCCTCACGAA
302953–303250 Intergenic region
(orf104c–orf202) 198
TMs19 A11 CACGACGTTGTAAAACGACCCTTCTCCCCCAC
CTTTTAGCGAGCCAAGGAAAGAGGGAAG
313675–313851 Intergenic region
(nad6–rps4) 177
TMs20 T16 CACGACGTTGTAAAACGACCGAAGGGGAAGG
AAGAGATGGAAGGGGGCGAAAAGAGTCTA
315512–315703 Coding region
(orf137) 192
TMs21 A12 CACGACGTTGTAAAACGACCGGTAGAACGTG
GGTCTCCAATACAGGCGTGGTGATCAGTT
337800–338023 trnW(tRNA) 224
TMs22 T10 CACGACGTTGTAAAACGACTATGAAAGCAAG
AGGTGGAATAATGTCGTGGCGAAGGT
350042–350266 Intergenic region
(orf110b–mmt2) 224
TMs23 A10 CACGACGTTGTAAAACGACCTTCCCTTTCTAT
AACATACCCCTCATACGGAGTCGCACA
378858–379036 Intergenic region
(orf105–orf125f) 178
TMs24 T10 CACGACGTTGTAAAACGACTAACGAGATGGCT
ATCAAACAGCCCTAAGTCTAAGTTGA
393947–394142 Intergenic region
(orf102–orf210) 195


表 3 不同类型烟草的 mtSSR多态性
Table 3 mtSSR polymorphism in different types of tobacco
类型
Type
材料份数
Accession number
等位位点数
No. of alleles
多态性位点数
No. of polymorphic alleles
多态性比率
Ratio of polymorphic alleles (%)
普通烟草 N. tabacum 3 29 3 10.5
不育胞质 Sterile cytoplasm 4 35 18 51.4
不育系 Male sterile line 4 37 24 64.8

2.3.2 4种雄性不育类型的不育系、保持系及不育胞质来
源的野生烟草间的 mtSSR 分析 在 Nat(sua.)S 类型中,
不育系 ms G-28 和保持系 G-28 以及提供不育胞质的 N.
suaveolens之间, 24对 mtSSR引物共检测到 30个 SSR等
位基因, 其中 18对引物在 ms G-28、G-28和 N. suaveolens
材料中扩增片段没有多态性, 3对引物在 ms G-28中的扩
增片段与 G-28和 N. suaveolens中的一个相同, 另一个不
同。而引物 TMs1在 G-28和 N. suaveolens中获得了 1条
188 bp的片段, 该引物在不育系ms G-28中没有扩增产物
(图 3-a), 引物 TMs12、TMs24 在 ms G-28 和 G-28 和 N.
suaveolens 中扩增出大小不同的片段, 表明该不育系的形
成可能在线粒体的这 3个位点发生过融合与重排, 这 3个
第 12期 李凤霞等: 四种细胞质来源的烟草不育系线粒体 SSR位点差异 2289


微卫星基因位点分别是编码基因 orf138a、orf138c 及
orf102~orf210的基因间区。
在 Nat(gla.)S 类型中, 24 对 mtSSR 引物在不育系 86-6
与其保持系 G-28、不育保持来源的 N. glauca中的扩增结果
显示, 在 3 份材料中共获得 32 个 mtSSR 等位基因, 其中 8
对引物在 ms G-28、G-28和 N. glauca中扩增的片段没有多
态性, 10 对引物在 86-6 中的扩增片段与 G-28 和 N. glauca
中的一个相同, 另一个不同。引物 TMs1、TMs3、TMs4、
TMs11、TMs12和 TMs24在 86-6与 G-28和 N. glauca中分
别获得大小不同的片段(图 3-b), 多态性位点占标记数的一
半, 因此, 该不育系的形成可能发生过更为广泛的线粒体融
合与重排, 该不育类型中发生变化的微卫星基因位点有编
码基因 orf138a、orf138c 以及 nad2~sdh3、rps12~orf125b、
orf116~orf101b和 orf102~orf210的基因间区。
在 Nat(rep.)S 类型中, 24 对 mtSSR 引物在不育系
98-43、保持系 K326 及不育保持来源的 N. repanda 中获
得 33个 mtSSR等位基因, 其中 20对引物在 98-43、K326
和 N. repanda 中扩增片段没有多态性, 2 对引物在 98-43
中的扩增片段和 K326和 N. repanda中的一个相同, 另一
个不同。引物 TMs13、TMs18 在 3 份材料间得到不同片
段大小的扩增(图 3-c), 这 2 个位点位于编码基因 orf190
及 orf104c~orf202的基因间区。

图 3 四种雄性不育类型的不育系、保持系及不育胞质来源的野生烟草间的 mtSSR扩增结果
Fig. 3 PCR patterns of mtSSR in four types of the CMS lines, their maintainers, and wild tobacco with sterile cytoplasm
a: 引物 TMS1在 Nat(sua.)S不育类型的扩增结果; b: 引物 TMS12在 Nat(gla.)S不育类型的扩增结果; c: 引物 TMS18在 Nat(rep.)S不育类型的
扩增结果; d: 引物 TMS4在 Nat(rus.)S不育类型的扩增结果。
a: PCR patterns of Nat(sua.)S type by mtSSR marker TMS1; b: PCR patterns of Nat(gla.)S type by mtSSR marker TMS12; c: PCR patterns of
Nat(rep.)S type by mtSSR marker TMS18; d: PCR patterns of Nat(rus.)S type by mtSSR marker TMS4.
2290 作 物 学 报 第 37卷

在 Nat(rus.)S类型中, 24对mtSSR引物在不育系 116、
保持系 NC82 及不育保持来源 N. rustica 中获得 30 个
mtSSR 等位基因, 其中 16 对引物在 116、NC82 和 N.
rustica中没有扩增多态性片段, 6对引物在 116中的扩增
片段与 NC82 和 N. rustica 中的一个相同, 另一个不同。
引物 TMs4 和 TMs20 在不育系 116 中扩增出了与 NC82
和 N. rustica不相一致的片段(图 3-d), 这 2个位点分别处
于 rps12~orf125b的基因间区和编码基因 orf137中。不育
系和保持系、不育胞质来源的烟草种线粒体 SSR 的位点
差异可能与各自类型雄性不育的产生有关。
2.3.3 四种雄性不育类型的不育系的 mtSSR 分析 在
分别代表 Nat(sua.)S、Nat(gla.)S、Nat(rep.)S和 Nat(rus.)S
不育类型的 4个雄性不育系 ms G-28、86-6、98-43和 116
中, 引物 TMS20分别扩增出了 184、172、212和 225 bp 的
不同片段(图 4), 表明用该引物可区分这 4 种雄性不育类
型。

图 4 引物 TMS20在 4种烟草雄性不育类型的 mtSSR扩增结果
Fig. 4 Amplification patterns of the four types of tobacco CMS by
the mtSSR marker TMS20

3 讨论
3.1 植物线粒体提取方法
线粒体 DNA 的提取是研究线粒体基因组的关键, 对
于植物 mtDNA 提取, 主要是高纯度完整线粒体的获得。
传统烟草线粒体提取采取差速离心和蔗糖衬垫方法, 所
需样品量 250~300 g, 整个操作过程复杂费时, 线粒体产
率低[35-37], 对叶片较小的 N. glauca和 N. repanda等烟草
野生种, 取材较为困难。而且, 在梯度密度离心时吸取中
间层较为困难 , 在涉及到多个材料的线粒体研究中 , 一
般采用多次差速离心的方法[35,37]。本研究用经黑暗处理的
10~12 周苗龄烟草幼嫩叶片提取线粒体 DNA, 线粒体纯
化方法是多次差速离心、过量 Dnase I处理、线粒体裂解、
酚/氯仿抽提和 RNase A 消化等主要步骤, 所提取的烟草
mtDNA结构完整、无核基因组 DNA的污染。此外, 在细
胞破碎过程中, 采用组织匀浆器以比较温和的匀浆强度
研磨, 既可有效破碎细胞, 又较小程度破坏细胞器, 大大
提高了烟草线粒体的产率, 用本方法提取烟草属几个野
生种的线粒体 DNA, 都获得了较好的效果。
3.2 烟草 mtSSR多态性与雄性不育的关系
线粒体是一种遗传上半自主性的细胞器 , 能编码与
自身功能相关的部分基因。研究发现, 植物线粒体基因组
分子构型多样, 线粒体基因组大小在物种间甚至物种内
差异较大, 在线粒体基因组上除了具有少量的编码基因
以外, 含有大量的大片段重复序列、非编码序列以及其他
来源序列。虽然植物线粒体基因组大小和结构很不相同,
在进化过程中有活跃的重组发生, 但其编码基因数量基
本相同, 而且编码区域的序列总长在已测序的物种中也
非常接近 [38], 基因组大小的差异主要是由于植物线粒体
基因组内含有大量长片段的重复序列或大的复制子区域。
另一方面 , 植物线粒体基因组在核苷酸序列上的变
化非常缓慢 [23,39], 碱基替代率分析也表明植物线粒体的
进化速率比细胞核进化速率低 10~20 倍, 甚至比同一物
种的叶绿体基因组的进化速率也低几倍 [25,40-41], 基因组
复杂性相对保守[42]。Hosaka 等[26]用 14 对 mtSSR 引物对
7 个马铃薯栽培种以及 32 个野生种共 476 个材料进行了
mtSSR分析, 结果显示 14对 mtSSR引物中, 有 6对能在
476个材料间扩增出多态性条带, 但这 6对 mtSSR引物除
了 A14-1 外, 其他 5 对的多态性指数非常低, 在 0.064~
0.180之间; Ishii等[25]对普通小麦及祖先种共 43个材料进
行 mtSSR 位点分析, 21 对 mtSSR 引物中 11 对有多态性,
但其中 5 对多态性指数较低, 为 0.09; 燕妮等[27]利用 29
对mtSSR引物对几种不同胞质来源的 15份油菜胞质不育
系进行多态性分析, 其中只有 4对有多态性。这些研究表
明线粒体的 SSR进化较为缓慢。在本研究中, 24对 mtSSR
引物在 3 份普通烟草中共检测到 29 个线粒体 SSR 位点,
多态性位点 3 个, 种内多态性位点比率为 10.5%, 说明普
通烟草 mtDNA在进化上较为保守, 这一结果与 Bland等[36]
比较普通烟草与其两个祖先亲本 N. tomentosiformis和 N.
sylvestris的线粒体序列后的结果一致。本研究中的 4份不
育材料的不育胞质分属于烟草属碧冬烟亚属的残波烟草
组、香甜烟草组以及黄花烟亚属的圆锥烟草组和黄花烟草
组, 亲缘关系较远[43], 24 对烟草 mtSSR 引物在烟草属 4
个烟草种中扩增出 35 个条带, 其中 18 个为多态性条带,
多态性位点比率为 51.4%, 暗示烟草属种间的线粒体
DNA变化的复杂性。
植物细胞质雄性不育与线粒体密切相关, 线粒体基
第 12期 李凤霞等: 四种细胞质来源的烟草不育系线粒体 SSR位点差异 2291


因组内多个正向或反向重复序列引起基因重组或重排 ,
进而线粒体基因组序列的变化, 产生一些 mtDNA 的特异
位点, 导致 CMS。本研究通过 mtSSR 分析找到了存在于
不育系和保持系、不育胞质之间的线粒体 SSR位点差异,
由于线粒体 SSR 进化缓慢, 这些位点的差异可能是不育
系形成时线粒体变异的证据。但植物细胞质雄性不育是个
十分复杂的性状 , 线粒体结构和数量的变化、线粒体
DNA片段差异、线粒体基因的转录、修饰、RNA编辑、
线粒体蛋白的差异等都可能引起不育。本研究中变异的线
粒体DNA序列可能与各自的CMS有关, 但变异的线粒体
DNA是怎样影响育性还需要进一步的研究。
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