全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2009, 35(9): 1584−1589 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2006AA10Z151)和高等学校博士学科点专项科研基金(20050504001)资助。
*
通讯作者(Corresponding author): 余四斌, E-mail: ysb@mail.hzau.edu.cn
Received(收稿日期): 2009-02-25; Accepted(接受日期): 2009-05-05.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2009.01584
一个新的水稻花粉半不育性位点的定位分析
曾 波 1 李 敏 1 杨祖荣 2 谭陈菊 1 董华林 1 余四斌 1,*
1 华中农业大学植物科学技术学院, 湖北武汉 430070; 2 湖北省种子集团公司, 湖北武汉 430070
摘 要: 利用一套以籼稻珍汕 97B 为背景的粳稻日本晴染色体片段代换系, 鉴定发现 1 个半不育的代换系。全基因
组基因型分析表明, 该代换系仅含 3 个粳稻导入片段, 而其他遗传背景与珍汕 97B 相同。在湖北武汉和海南分别种
植其衍生的 F2和 F3分离群体, 采用单标记分析和区间作图法分析花粉育性和小穗育性的数量性状位点(QTL), 结果
表明, 该代换系的半不育性是第 2 染色体上的粳稻导入片段引起的, 该片段 RM262~RM475 区间存在 1 个新的影响
花粉育性的 QTL, 其贡献率为 13.9%。研究结果将为进一步精细定位水稻育性 QTL以及鉴定相关功能基因提供重要
的试验基础。
关键词: 染色体片段代换系; 花粉不育; QTL; 水稻
Mapping of a Novel Semi-Sterile Pollen QTL in Rice
ZENG Bo1, LI Min1, YANG Zu-Yong2, TAN Chen-Ju1, DONG Hua-Lin1, and YU Si-Bin1,*
1 College of Plant Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China; 2 Hubei Seed Group Company, Wuhan 430070,
China
Abstract: Hybrid sterility has been an obstacle in utilization of potential heterosis in inter-subspecific hybrids of indica and ja-
ponica. In order to understand the genetic basis of pollen sterility of indica-japonica hybrid, we identified a line (IL37) with
semi-sterility from a set of chromosomal segment substitution lines, of which each contained a single or few substitution segments
from a japonica variety Nipponbare in the genetic background of indica variety Zhenshan 97B. The graphical genotype analysis
of the line (IL37) by using 160 polymorphic SSR revealed that there were three chromosomal segments from the japonica with
the similar genetic background of Zhenshan 97B. Its derived F2 and F3 segregation populations were planted respectively in Wu-
han and Hainan, and evaluated for quantitative trait loci (QTLs) conferring pollen fertility and spikelet fertility via single-marker
analysis and interval mapping. One new QTL of pollen sterility was detected at the interval RM262–RM475 on chromosome 2,
explaining the phenotypic variation of 13.9%. The results suggest that japonica substitution segment carrying the QTL is a major
cause of the semi-sterility in IL37. Further fine mapping and identification of candidate genes in the QTL region would facilitate a
better understanding of the genetic basis of pollen sterility in rice.
Keywords: Chromosomal segment substitution line; Pollen semi-sterility; Quantitative trait loci; Rice (Oryza sativa L.)
杂种不育是种间和亚种间生殖隔离最为普遍的
一种现象[1-2]。水稻籼粳亚种存在的杂种优势, 为水
稻增产提供了巨大的潜力。然而, 水稻亚种间杂种
往往存在着部分或完全的不育性, 已成为亚种间基
因转移或杂种优势利用的主要障碍。因此, 定位和
克隆水稻育性相关基因, 研究它们的功能, 对克服
亚种间杂种育性障碍具有重要的理论和实践意义。
花粉育性的下降, 是造成水稻结实率下降的主
要原因[3]。目前, 在粳稻与非洲栽培稻、栽培稻与野
生稻等构建的遗传群体已定位了 44 个花粉育性相关
的数量性状基因位点(quantitative trait locus, QTL)
(http://www.gramene.org/db/qtl/qtl_display), 分布于水
稻 12 条染色体的 29 个区域。近年来, 随着高密度
分子标记的发展, 许多与水稻花粉成熟、花粉萌发以
及花粉与胚囊识别等育性基因被精细定位或克隆[4-13]。
这些结果为深入研究水稻育性的分子遗传机理奠定
了基础。如水稻第 1 染色体着丝粒附近的隐性不育
基因 ms91(t)控制着花粉的发育[11], 能使正常植株不
产生花粉粒; 第 8 染色体上的花粉育性基因 pss1 使
植株表现为雌配子正常但花药瘦小、花粉育性和结
第 9期 曾 波等: 一个新的水稻花粉半不育性位点的定位分析 1585


实率表现为典型的半不育[12]; 而 S33(t)和 S34(t)主要
影响杂种的花粉育性和花粉萌发率[13]。最近, Chen
等[14]成功地克隆了第 6 染色体上控制胚囊育性的基
因 S5。它具有 3种等位基因, 分别存在于籼稻(S5-i)、
粳稻(S5-j)和广亲和品种中(S5-n); S5-i和 S5-j仅有两
个碱基的差别, 引起编码氨基酸的替换; 而广亲和
品种的 S5-n 则在其编码蛋白的 N 末端有大片段缺
失, 造成该蛋白的亚细胞定位的改变, 可能导致其
功能丧失。但这些等位基因如何相互作用控制杂种
育性, 并不完全清楚。
我们在粳稻(日本晴)片段导入籼稻珍汕 97B 的
代换系群体中发现 1 个稳定表现的半不育株系。本
实验利用该代换系及其衍生的 F2和 F3分离群体, 验
证并检测粳稻片段影响花粉育性的一个新位点。
1 材料与方法
1.1 材料
以测序粳稻品种日本晴为供体亲本, 籼型保持
系珍汕 97B 为轮回亲本, 通过连续回交构建一套以
珍汕 97B 为背景的日本晴染色体片段代换系[15]。
2005 年在武汉种植该代换系群体, 田间鉴定发现一
份结实率明显下降的株系(编号为 IL37), 并与珍汕
97B 正反交, 获得相应杂种 F1。2006 年湖北武汉正
季种植 IL37及其衍生的 F2; 从 F2群体中利用分子标
记辅助选择目标区段杂合的 1 个单株, 套袋收获种
子, 即为衍生 F3群体。2007年海南陵水种植 IL37、
正反交 F1及衍生的 F3群体。亲本、IL37 及 F1各种
植 30个单株; F2和 F3群体分别种植 100和 150个单
株用于表型验证及 QTL定位。
1.2 育性调查
在抽穗期, 选取单株已完全抽出的 3 个穗子 ,
每穗取中上部成熟未开颖花 , 置于乙醇∶冰乙酸
(3 1)∶ 的固定液中, 4℃冰箱保存。镜检时, 取出 6朵
颖花的花药混合捣碎, 用 1% I2-KI 溶液染色, 普通
光学显微镜 10倍目镜下观察花粉育性。每个样本观
察 3 个视野, 观察花粉粒不少于 200 个。根据花粉
染色及形态, 染色深、饱满、圆形花粉粒为可育花
粉, 不染或染色浅、皱缩和空瘪的畸形花粉粒为不
育花粉[16], 用可育花粉的百分率表示花粉育性。成
熟时考察各单株的自然结实率, 作为小穗育性。
1.3 SSR标记检测与连锁图的构建
采集亲本、代换系及群体单株的苗期叶片 1~2
cm, 分别放入 1.5 mL离心管中并编号。采用 CTAB
法[17]提取 DNA。依据 McCouch 等[18]发表的水稻简
单重复序列(simple sequence repeat, SSR)分子标记
连锁图谱, 选择覆盖水稻全基因组的 572 对 SSR 筛
选珍汕 97B 和日本晴之间的多态性。SSR引物序列
信息来自 http://www.gramene.org/microsat/, 由上海
英骏生物工程有限公司合成。用双亲间具有多态性
的引物进行代换系全基因组扫描及 F2和 F3群体的基
因型分析。珍汕 97B带型记为“A”, 日本晴带型记为
“B”, 杂合带型记为“H”。利用 MapMaker Version 3.0
软件[19]建立分子标记连锁图谱。
用 20 μL PCR扩增反应体系, 含 150 nmol的引
物、250 mmol L−1 dNTPs、10×PCR buffer (20 mmol
L−1 Tris、50 mmol L−1 KCl、2.5 mmol L−1 MgCl2、0.1
mmol L−1 EDTA、1 mmol L−1 DTT、50% glycerol)、
约 20 ng的模板 DNA、1 U的 Taq DNA聚合酶。反
应程序为 94 4 min, 33℃ 次循环(94 40 s, 55 40 s, ℃ ℃
72 50 s), 72 5 min℃ ℃ 。PCR反应在 PTC-100热循环
仪中进行。扩增产物经 4%非变性聚丙烯酰胺凝胶电
泳分离及银染后进行带型分析[20]。
1.4 数据分析
单因素方差分析和数据反正弦转换在 Microsoft
Excel 中完成。双因素方差分析在 Statistica5.5 软件
中完成[21]。采用 QTLmapper 2.0区间作图定位花粉
育性 QTL[22]。以 LOD值 2.0作为阈值检测可能存在
的 QTL, 若标记区间 LOD 值>2.0, 则认为该区间
LOD值最高处对应的位点为该性状的 QTL。QTL的
命名原则遵循 McCouch (1997)的方法 [23]。
2 结果与分析
2.1 代换系的基因型和育性表现
双亲间(珍汕 97B 和日本晴)检测到 170 对多态
性标记, 多态性比例为 29.7%。从中挑选均匀覆盖水
稻 12条染色体的 160对标记, 进行代换系 IL37的基
因型分析, 结果表明, 该代换系仅在第 1和第 2染色
体上存在日本晴导入片段, 其他基因组(背景)与珍
汕 97B完全相同。第 1染色体 RM283附近的导入片
段约 5 cM, 第 2染色体上的 RM475区段约 12 cM,
RM525区段约 24 cM (图 1)。3个导入片段的遗传长
度约占整个基因组的 2.3%。
代换系(IL37)的花粉育性和小穗育性均表现为
半不育(表 1和图 2), 而其他农艺性状与珍汕 97B基
本一致。IL37在海南的平均株高为 77 cm, 抽穗期为
75 d, 珍汕 97B的平均株高 83 cm, 抽穗期 74 d。
1586 作 物 学 报 第 35卷



图 1 代换系 IL37的导入片段的图示基因型(显示染色体 1和 2
上的 3个日本晴导入片段)
Fig. 1 Graphical genotype of IL 37 showing three introgres-
sion segments on chromosome 1 and 2

表 1 还显示 , 正反交杂种 F1 的小穗育性均比
IL37 显著提高, 但正反交杂种间存在一定差异, 以
珍汕 97B为父本的杂种育性显著低于以 IL37为父本
的杂种。结合图示基因型分析(图 1)可以推断, IL37
中 3 个导入片段上可能存在影响花粉和小穗育性的
QTL。
2.2 导入片段遗传效应的验证与分析
针对 F2 群体, 单标记方差分析结果表明, 第 2
染色体上 2个导入片段(RM475和 RM525区段)对花
粉育性具有显著效应, RM475 区段对小穗育性可能
有一定效应(P = 0.07); 而第 1染色体上 RM283标记
区段对花粉和小穗育性均没有显著作用(表 2)。说明
IL37 的半不育性主要是第 2 染色体上的 RM475 或
RM525标记片段(或基因)引起的。



图 2 代换系 IL37的花粉碘染和小穗结实情况
Fig. 2 Pollens stained with I2-KI and seed setting in panicles of
the chromosome segment substitution line (IL37)

选择 F2群体中第 2 染色体目标区段(RM475 和
RM525)均为杂合, 而第 1 染色体上不含导入片段的
单株衍生出 F3群体。图 3 显示, F3群体的平均花粉
育性和小穗育性均出现可育与不育的分离, 但呈连
续分布, 表现出数量性状的遗传特点。对第 2 染色
体上 2个导入片段的 14个相关标记位点作方差分析,
结果表明, 只有标记位点 RM262、RM475和 RM525
极显著或显著地影响 F3群体的花粉育性和小穗育性
(表 2), 从而验证了 IL37的花粉育性或小穗育性是第
2染色体上的导入片段(或基因)引起的。
2.3 花粉育性的 QTL定位
表 3列出了利用 F3群体检测到的 1个影响花粉
育性的QTL (qPS2)。它位于RM262~RM475区间, 解
释的表型变异为 13.9%。在该 QTL 上, 杂合基因型
的花粉育性与珍汕 97B 纯合基因型无显著差异, 但

表 1 亲本、IL37及正反交 F1代的花粉育性和小穗育性(海南)
Table 1 Pollen and spikelet fertility of parents, IL37 and reciprocal F1 in Hainan
株系
Line
花粉育性
Pollen fertility (%) a)
小穗育性
Spikelet fertility (%)
珍汕 97B Zhenshan 97B 92.5±3.7 92.1±5.1
日本晴 Nipponbare 90.3±4.1 91.2±4.7
IL37 57.9±9.1 27.9±6.2
IL37/珍汕 97B IL37/Zhenshan 97B 未调查 Data not available 64.2±4.8
珍汕 97B/IL37 Zhenshan 97B/IL37 未调查 Data not available 78.2±10.8
a) 平均数±标准差, 每份材料调查 30株。
a) Mean ± SD measured from thirty individuals per line.
第 9期 曾 波等: 一个新的水稻花粉半不育性位点的定位分析 1587


表 2 单标记分析导入片段对花粉和小穗育性的影响(湖北武汉和海南陵水)
Table 2 Single-marker analysis of introgressed segments on pollen and spikelet fertility (in Wuhan and Hainan)
湖北武汉 F2 F2 in Wuhan 海南 F3 F3 in Hainan 性状
Trait
标记
Marker
染色体
Chr. 均方
MS
F值
F-value
P值
P-value
均方
MS
F值
F-value
P值
P-value
RM283 1 0.012 0.485 0.6185 — — —
RM262 2 — — — 0.121 8.905 0.0001
RM475 2 0.128 6.581 0.0030 0.141 10.152 0.0000
花粉育性
Pollen fertility
RM525 2 0.084 3.933 0.0263 0.077 5.199 0.0015

RM283 1 0.015 1.059 0.3506 — — —
RM262 2 — — — 0.069 3.905 0.0102
RM475 2 0.035 2.715 0.0713 0.092 5.109 0.0072
小穗育性
Spikelet fertility
RM525 2 0.019 1.435 0.2431 0.060 3.103 0.0286

较日本晴纯合基因型显著提高(图 4), 表明来源于日
本晴的等位基因为隐性。针对小穗育性, 该区间的
LOD值(1.7)接近但未超过统计阈值(表 3), 是否存在
结实率 QTL, 还需要进一步实验。
为了明确第 2 染色体上 2 个导入片段是否存在
互作效应, 对 F3群体的花粉育性及其反正弦转化数
据进行了双因素方差分析。图 5 是其反正弦转化数据
分析的结果, 表明 2个片段(分别以 RM475和 RM525
代表)不存在影响花粉育性的显著互作。
3 讨论
本研究从籼粳亚种衍生的代换系中发现 1 个结
实率显著下降的株系。该代换系含有的粳稻导入片


图 3 衍生 F3群体的花粉育性和小穗育性的频率分布(海南)
Fig. 3 Distributions of fertility for pollen and spikelet in the
derived F3 population (Hainan)

表 3 F3群体中花粉育性的 QTL检测
Table 3 QTL for pollen fertility detected in the derived F3 lines
性状
Trait
基因座
QTL
标记区间
Interval
LOD值
LOD
加性效应
Additive
显性效应
Dominant
贡献率
Variance (%)
花粉育性 Pollen fertility qPS2 RM262–RM475 5.6 7.2 2.9 13.9
小穗育性 Spikelet fertility RM262–RM475 1.7 4.8 0.3 6.1



图 4 QTL上不同基因型的花粉育性差异
Fig. 4 Pollen fertility of three genotypes at the QTL identified
in the derived F3 population
A, B, and H represent homozygous Zhenshan 97B, homozygous
Nipponbare, and the heterozygous, respectively.


图 5 双因素方差分析表明第 2染色体上两个片段不存在互作
Fig. 5 Two-way ANOVA showing no significant interaction
between the two introgression segments on chromosome 2
A, B, and H represent homozygous Zhenshan 97B, homozygous
Nipponbare, and the heterozygous, respectively.
1588 作 物 学 报 第 35卷

段(RM262~RM475)及其上的花粉育性基因(qPS2)是
导致其花粉育性和小穗育性降低的主要原因。qPS2
只在导入纯合的情况下才表现出花粉育性的显著降
低, 杂合基因型并无明显的育性改变(图 4)。这与其
他许多研究结果所展示的杂合基因型的效应是不同
的[6,13]。如第 3染色体的 S33纯合基因型的花粉育性
约为 90%, 而杂合基因型则降低到 53.6%[13]; 第 5染
色体的 S31 纯合基因型的平均育性约为 60%, 而杂
合基因型则降低到 41%[6]。另外, 在水稻第 2染色体
上已定位有两个影响花粉育性的 QTL。一个是在旱
稻与非洲稻衍生的群体中发现的 S29。该位点杂合
时, 其花粉育性显著下降[9]。另一个是控制杂种花粉
低温不育的 qLTSPS2, 其杂合基因型比纯合型显著
降低花粉育性 [8]。但它们与本实验发现的 qPS2 在
位置和效应上都不一样。因此, qPS2 是一个影响水
稻花粉育性的新基因。这为精细定位或分离鉴定育
性基因提供了重要的实验基础。
值得提出的是在粳稻日本晴背景下, qPS2 的不
育效应是检测不到的, 只有纯合导入到珍汕 97B 的
遗传背景中才表现出来。这种 “隐蔽”的基因效应在
其他高世代回交群体的研究中也有报道[24]。就籼粳
杂交育种实践而言, 如果粳稻中一些有利基因与不
育基因紧密连锁, 杂交后代因不育基因逐渐纯合导
致结实率降低, 进而被选择淘汰, 则不利于籼粳基
因的相互转移和利用; 另一方面, 该基因的杂合并
未引起杂种育性的降低, 可能有利于杂种优势的利
用, 因此, 这类基因的发掘应引起重视。
水稻亚种间杂交后代出现的结实率变化, 除受
环境影响较大外, 一般是由花粉育性或胚囊育性、
或两者同时引起的。本研究在武汉和海南两种环境、
两个群体(F2和 F3)中都发现 qPS2区段影响花粉育性
(表 2), 且 F3群体中花粉育性和小穗育性的相关系数
(0.348)达到极显著水平, 由此认为, qPS2 主要是一
个控制花粉育性的位点。但该 QTL尚不足以完全解
释分离群体中花粉育性的变异。这可能有以下几个
原因：(1)水稻亚种间杂种后代的育性容易受到诸如
温度等环境因素的影响[25]。如本试验在武汉和海南
两种环境下显著影响小穗育性的标记位点就有一定
差异(表 2), 表明某些 QTL 可能受到环境影响而未
被检测到。(2)存在上位性互作的影响。已有研究表
明 [26-27], 育性基因的互作影响亚种间的杂种不育
性。在本研究中, 尽管 qPS2与染色体 2上一个导入
片段(基因)没有互作效应(图 5), 但并不能排除它与遗
传背景中其他基因存在互作。由于本实验在 F2群体
中未检测到第 1 染色体上导入片段的效应, 故在 F3
群体未对其作进一步分析。但该导入片段是否与
qPS2互作, 尚待验证。(3)我们仅在染色体 1和 2上
增加了标记密度, 而其他染色体上只以 10 cM 左右
的密度间隔选择标记作基因型分析, 所以, 代换系
可能还有未被检测到的微小导入片段, 它们含有与
qPS2互作或直接影响育性的基因。另外, 我们发现,
正反交 F1代的平均结实率存在显著差异(表 1), 可能
暗示代换系的结实率变化除受花粉育性的影响外 ,
还有其他因素的影响。总之, 为了清楚地解析以上
这些问题, 有必要设计相关实验对花粉育性基因进
行精细定位和深入分析。
4 结论
水稻第 2 染色体上 RM262~RM475 区间存在 1
个新的影响花粉育性 QTL(qPS2)。在该位点上, 纯
合日本晴基因会导致代换系育性的显著下降, 而杂
合基因型对其花粉育性影响不大。该位点与染色体
2上的另一个导入片段(基因)不存在互作。
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