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Effects of Different Fertilizers on Functional Diversities of Microbial Flora in Rhizospheric Soil of Monoculture Tobacco

不同肥料种类对连作烟草根际土壤微生物功能多样性的影响



全 文 :作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(1): 105111 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由云南省烟草专卖局(公司)科技项目(08A02, 07A05, 09YN003)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 林文雄, E-mail: wenxiong181@163.com
Received(收稿日期): 2010-06-15; Accepted(接受日期): 2010-09-26.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.00105
不同肥料种类对连作烟草根际土壤微生物功能多样性的影响
杨宇虹 1 陈冬梅 2 晋 艳 1 王海斌 2 段玉琪 1 郭徐魁 2 何海斌 2
林文雄 2,*
1 云南省烟草农业科学研究院, 云南玉溪 653100; 2福建农林大学农业生态研究所, 福建福州 350002
摘 要: 烟草连作障碍是制约烟草产量与品质的关键因素。以连作 12 年的烟草土壤为对象, 施用不同肥料, 调查施
肥后的土壤对连作烟草作物的生长、土壤微生物功能多样性的影响及其对土壤化感自毒的调节作用。结果表明, 烟
草根际土壤化感自毒潜力以施用常规复合肥最大, 施用农家肥最小。基于 BIOLOG 平板法的微生物功能多样性研究
表明, 施用常规复合肥利于氨基酸类、胺类物质为碳源的微生物生长; 施用有机肥利于羧酸类物质为碳源的微生物生长;
而施用农家肥则利于糖类、脂肪酸、酚酸类物质为碳源的微生物生长。土壤微生物利用单一碳源的主成分分析结果
表明, 与碳源利用相关的主成分 1、主成分 2可分别解释变量方差的 74.37%和 25.63%。在主成分分离中有主要贡献
的是糖类、脂肪酸类、酚酸类碳源。相关性分析结果显示, 烟草土壤的化感自毒潜力与以糖类和酚酸类物质为碳源
的微生物 AWCD值呈显著正相关, 而与以脂肪酸类物质为碳源的微生物 AWCD值呈显著负相关。此外, 农家肥施用
最利于微生物生长, 有机肥次之, 常规复合肥最差。
关键词: 烟草; 连作障碍; 微生物; 功能多样性; BIOLOG
Effects of Different Fertilizers on Functional Diversities of Microbial Flora in
Rhizospheric Soil of Monoculture Tobacco
YANG Yu-Hong1, CHEN Dong-Mei2, JIN Yan1, WANG Hai-Bin2, DUAN Yu-Qi1, GUO Xu-Kui2, HE
Hai-Bin2, and LIN Wen-Xiong2,*
1 Institute of Tobacco Research, Yuxi 653100, China; 2Agroecological Institute, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China
Abstract: Tobacco is an intolerant continuous cropping crop. Continuous cropping obstacle restricts sustainable development of
tobacco production, which is one of the most important problems in agricultural production. In this study, tobacco consecutively
planting for twelve years in the same and the rhizospheric soil was sampled to investigate the changes in the functional diversities
of microbial flora after different fertilizer treatments. The results showed that the autotoxic allelopathic potential was maximum
for the monoculture soil treated with traditional compound fertilizer, and minimum for the soil treated with farmyard manure.
BIOLOG analysis showed that the traditional compound fertilizer was conducive to the growth of the microbial flora feeding on
amino acids and amine as carbon sources. The commercial organic fertilizer was favorable to the growth of the microbial flora
using carboxylic acids as a carbon source, and farmyard manure was good for the growth of the microbial flora feeding on carbo-
hydrate, fatty acids, and phenolic acids as carbon sources. Principal component analysis indicated that the first two components
related to carbon sources accounted for 74.37% and 25.63% of the data variation, respectively. The carbon source of carbohydrate,
fatty acids, and phenolic acids made a mainly contribution to the separation of two principal components. Correlation analysis
indicated that the autotoxic allelopathic potential of tobacco rhizospheric soil was positively correlated with the average well color
development (AWCD) value of microbial flora feeding on carbohydrate and phenolic acids as carbon sources, and negatively cor-
related with that of the microbial flora using the carbon source of fatty acids. In addition, for the growth of microbial flora in
monoculture soil, farmyard manure was the best, commercial organic fertilizer showed the medium effect, and traditional com-
pound fertilizer had the worst effect.
Keywords: Tobacco; Consecutive cropping problem; Microbial flora; Functional diversity; BIOLOG
106 作 物 学 报 第 37卷

连作障碍是指在正常的栽培管理措施下, 同一
地块连续种植相同作物, 造成产量降低、品质变劣、
生育状况变差、病虫害发生频繁的现象。烟草是我
国最重要的经济作物之一, 属于茄科忌连作的作物,
但因其具有较高的经济效益而被大量连作种植[1]。
然而 , 随着连作年限的延长 , 连作障碍日趋严重 ,
制约了烟草生产的可持续发展, 成为亟待解决的问
题。
目前, 有关连作障碍影响因子的研究虽已取得
很大进展, 但是结论不一。归纳起来主要有土壤理
化性质恶化、植物化感自毒作用、土壤微生物区系
的变化等原因[3-5]。这三大因素均与土壤存在密切关
系, 土壤内部的变化又是一个复杂而又紧密相联系
的过程 , 土壤微生物在此过程中扮演着重要的角
色。盘莫谊等[6]研究表明, 烟草连作对土壤中的细菌
数量影响最大, 真菌次之, 放线菌最小。烟草长期连
作将改变土壤微生物数量及其多样性, 并导致连作
病害的发生, 不利于维系土壤生态系统的健康[7]。据
报道, 某些微生物对连作烟苗的生长具有一定的抑
制作用, 而施肥可以改善这一影响[8]。王超等[9]研究
发现施肥可提高土壤中细菌的数量, 并在一定程度
上缓解烟草连作障碍。郭汉华等[10]研究也证实施肥
可提高土壤微生物的数量, 进而减轻连作对烟草造
成的影响。可见烟草连作障碍的形成与土壤的肥力
及土壤微生物数量存在着密切的关系。前人曾对不
同作物和土壤类型的微生物数量进行了大量研究,
近年来, 有机肥、饼肥或微生物肥料对烟草根际土壤
微生物数量的影响等也已有报道[11-13]。尽管如此, 研
究烟草连作对土壤微生物的影响依然停留在对连作
后土壤可培养微生物数量的变化上, 对土壤微生物
功能多样性的变化鲜有报道。深入研究不同施肥种
类对连作烟草土壤微生物功能多样性的影响, 对于
揭示烟草连作障碍形成的机理具有重要的理论与实
践意义。因此, 本研究以连作烟草 12年的土壤为对
象, 探讨不同施肥种类对连作烟草土壤微生物功能
多样性的影响及其对土壤化感自毒作用的调节机制,
以期为深入揭示烟草连作障碍形成的机理, 建立切
实可行的消减技术提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 试验概况
2008—2009年在云南烟草科学研究院玉溪试验
基地(此前烟草已经连作 11年)种植烟草品种 K326。
各处理均施纯氮 75 kg N hm2。处理 1 (T1)为对照,
施用常规复合肥。处理 2 (T2)施用常规复合肥+农家
肥(农家肥为猪粪的堆肥, 堆沤 3个月), 农家肥用量
为 1 kg 株1 (按含 N量 0.4%扣减常规复合肥)。处理
3 (T3)施用常规复合肥+有机肥(有机肥为工业化生
产的商品有机肥)。每个处理设 3次重复, 共计 9小
区, 每小区栽烟 56 株, 小区采用顺序排列。施用的
常规复合肥为烟草专用复合肥, 其 N∶P2O5∶K2O
为 12∶12∶24。处理 2、处理 3的总 N∶P2O5∶K2O
与对照相同。种植前土壤 pH 7.6, 含有机质 2.2%、
速效氮 45.9 mg kg1、速效磷 69.1 mg kg1、速效钾
160.5 mg kg1、全氮 0.95 g kg1、全磷 1.70 g kg1、
全钾 10.0 g kg1、阳离子交换量 4.54 cmol kg1。于
4 月 25 日移栽, 处理 1、处理 3 取 50%复合肥做基
肥, 4月 26日在距烟株 10 cm处穴施, 10~15 cm深埋;
5月 5日取 10 g 株1复合肥作提苗肥兑水浇施; 其余
肥料于栽后 5月 25日双穴施。处理 2中以 1 kg 株–1
农家肥做基肥撒施, 其余肥料与处理 1、处理 3施用
方法相同; 在烟叶采烤完后整地前, 分小区用四分
法留取土样并于 4℃以下保存, 用于土壤化感自毒
潜力评价及微生物功能多样性分析。
1.2 不同施肥条件下烟草土壤化感自毒潜力评价
采用土壤-琼脂三明治法 [14]测定评价根际土壤
化感潜力, 并略做修改。称取土壤样品 15 g, 倒入
30 mL 冷却至约 45℃、浓度为 0.8%的琼脂溶液中,
充分混匀, 待固化后再加 0.5%的琼脂溶液 2 mL 复
盖表面, 冷却后每个培养皿中播入 10粒预萌发的莴
苣或烟草, 设无土处理为对照, 5 次重复, 置人工气
候箱培养。莴苣培养温度为 25℃, 烟草培养温度为
30℃, 每天光照 12 h (7:00~19:00)。莴苣培养 3 d后
及烟草在培养 10 d后测定根长。不同土壤的化感自
毒潜力即受体的相对抑制率 (inhibition rate, IR),
IR=(1-处理值/对照值)×100%。
1.3 土壤微生物功能多样性分析
采用 BIOLOG ECO 微平板法进行微生物功能
多样性分析[14]。称取 5 g 鲜土置高压灭菌的三角瓶
中, 加入含 0.85% NaCl的无菌水 100 mL, 封口, 120
r min1振荡 30 min, 冰浴中静置 2 min, 取上清液 5
mL 置 100 mL 灭菌三角瓶中, 加入 45 mL 无菌水,
重复稀释 3 次, 制得 1∶1000 的提取液, 立即用于
ELISA反应。将 BIOLOG ECO平板预热到 25℃, 用
移液器取 150 μL 提取液于各孔中, 28℃恒温培养,
在 0、1、2、3、4、5、6和 7 d用 ELISA反应平板
第 1期 杨宇虹等: 不同肥料种类对连作烟草根际土壤微生物功能多样性的影响 107


读数器读取 590 nm的吸光值。采用 BIOLOG ECO平
板每孔颜色平均变化率(average well color develop-
ment, AWCD)表示土壤微生物群落 ELISA 反应。
AWCD=[∑(C–R)]/N, 其中C是所测定的31个碳源孔的
吸光值, R为对照孔的吸光值, N为碳源的数目。
1.4 数据处理
采用 SPSS11.5软件进行数据统计、主成分分析
和相关分析。
2 结果与分析
2.1 不同施肥条件下连作烟草土壤的自毒潜力
长期种植烟草的土壤表现出明显的连作障碍 ,
和对照相比, 烟草、莴苣幼苗根系的生长受到明显
抑制, 不同施肥条件可能影响烟草土壤的化感自毒
潜力(图 1)。施加常规复合肥(T1)的烟草根际土壤对
烟草、莴苣幼苗根长的抑制率分别为 45.15%和
57.52%, 施加常规复合肥+农家肥(T2)的烟草根际
土壤对烟草、莴苣幼苗根长的抑制率分别为 18.03%
和 33.18%, 而施加常规复合肥+有机肥(T3)的该值
则分别为 21.70%和 37.81%。可见, 几种施肥处理中,
常规复合肥+农家肥最有利于减轻烟草土壤的自毒
作用, 而常规复合肥+有机肥次之, 施加常规复合肥
最差。此外, 不同的受体植物响应烟草土壤的自毒
作用虽然趋势一致, 但强度上存在一定差异, 即莴
苣敏感度较烟草高。

图 1 不同施肥条件下连作烟草土壤对莴苣、烟草根长的影响
Fig. 1 Autotoxic effect of soil mediated by continuous crop-
ping tobacco on the root length of tobacco and lettuce under
different fertilize treatments
T1: 常规复合肥; T2: 常规复合肥+农家肥; T3: 常规复合肥+有
机肥。大写字母相关性达极显著差异(P<0.01), 小写字母相关性
达显著水平(P<0.05)。
T1: traditional compound fertilizer; T2: traditional compound fer-
tilizer mixtured with farmyard manure; T3: traditional compound
fertilizer mixtured with commercial organic fertilizer. ** Capital
letter significant at P<0.01; * Small letter significant at P<0.05.

2.2 不同施肥条件下连作烟草根际土壤微生物
功能多样性的变化规律
由图 2 可见, 烟草根际土壤微生物对不同碳源
的利用程度均随培养时间的增加而增大, 即不同施
肥处理, 不同碳源培养下, 烟草根际土壤 AWCD 值
与培养时间的拟合方程斜率均为正值。将 31种不同
碳源划分为 6大类——糖类、脂肪酸类、氨基酸类、
胺类、羧酸类、酚酸类后进行 AWCD值方程拟合分
析发现, 不同施肥条件下, 烟草根际土壤微生物对
不同类别碳源的利用程度存在显著的差异。以糖类、
脂肪酸类、酚酸类物质为碳源时, 常规复合肥+农家
肥(T2)对连作烟草土壤的 AWCD 值影响最大(方程
斜率分别为 0.320、0.289和 0.222), 常规复合肥+有
机肥(T3)的处理次之(方程斜率分别为 0.318、0.272
和 0.196), 施用复合肥 (T1)的影响最小 (方程斜率
0.293、0.264和 0.176)。以氨基酸类物质为碳源时, 不
同施肥条件下连作烟草土壤微生物碳源利用的
AWCD 值为施用常规复合肥>施用常规复合肥+有
机肥>施用常规复合肥+农家肥 (方程斜率 0.365>
0.353>0.344)。以胺类物质为碳源时, 不同施肥条件
对连作烟草土壤微生物碳源利用的 AWCD 值为施
用常规复合肥 (0.370)>施用常规复合肥+农家肥
(0.360)>施用常规复合肥+有机肥(0.344)。然而, 以
羧酸类物质为碳源时, 其影响规律则为施用常规复
合肥+有机肥(0.373)>施用常规复合肥(0.332)>施用
常规复合肥+农家肥(0.314)。进一步分析发现, 单纯
施用常规复合肥最利于以氨基酸类、胺类物质为碳
源的微生物生长; 施用常规复合肥+有机肥最利于
以羧酸类物质为碳源的微生物生长; 施用常规复合
肥+农家肥最利于以糖类、脂肪酸类、酚酸类物质为
碳源的微生物生长。不同施肥条件可显著影响烟草
根际土壤微生物的功能多样性。
2.3 不同施肥条件下连作烟草根际土壤微生物
碳源利用特性的主成分分析
利用培养 7 d后的 AWCD值, 对不同施肥条件
下土壤微生物利用单一碳源特性进行主成分分析 ,
结果表明(表 1和图 3), 与土壤微生物碳源利用功能
多样性相关的主成分 1、主成分 2 可分别解释变量
方差的 74.4%和 25.6%。进一步分析发现, 常规复合
肥处理的烟草土壤位于主成分 1 的正端, 主成分 2
的正、负端交叉点。常规复合肥+有机肥处理后的烟
草土壤位于主成分 1 的负端, 主成分 2 的正端。常
规复合肥+农家肥处理后的烟草土壤位于主成分 1
的负端, 主成分 2 的负端。主成分得分系数与单一
碳源 AWCD值的相关分析结果表明, 与主成分 1相
关的碳源有 16 个, 其中 12 个呈正相关, 主要是糖
108 作 物 学 报 第 37卷

类、酚酸类碳源; 4个呈负相关, 主要是糖类、脂肪
酸类碳源。而与主成分 2 相关的的碳源有 2 个, 其
中 1个脂肪酸类碳源呈正相关, 1个酚酸类碳源呈负
相关。可见碳源在主成分分离中起主要贡献作用的
是糖类、脂肪酸类、酚酸类碳源。
2.4 利用不同碳源的连作烟草土壤微生物与连
作烟草土壤化感自毒潜力的相关性分析
不同施肥条件下, 烟草土壤的化感自毒潜力与土
壤中利用不同碳源微生物 AWCD 值的相关性分析结
果表明(表2), 烟草土壤的化感自毒潜力与以糖类和酚
酸类物质为碳源的微生物AWCD值呈显著正相关, 与
以脂肪酸类物质为碳源的微生物 AWCD 值呈显著负
相关。而以酚酸类物质和脂肪酸类物质为碳源的微生
物 AWCD 值呈极显著负相关。可见不同施肥条件下,
烟草土壤的化感自毒潜力与土壤中以糖类和酚酸类物
质为碳源的微生物利用效率存在密切的联系。

图 2 不同施肥处理的烟草连作土壤不同类型碳源平均颜色变化率(AWCD)
Fig. 2 Changes in averages of well color development (AWCD) for different types of carbon sources in different continuous cropping
tobacco soils under different fertilizer treatments
T1: 常规复合肥; T2: 常规复合肥+农家肥; T3: 常规复合肥+有机肥。
T1: traditional compound fertilizer; T2: traditional compound fertilizer mixtured with farmyard manure; T3: traditional compound fertilizer
mixtured with commercial organic fertilizer.
第 1期 杨宇虹等: 不同肥料种类对连作烟草根际土壤微生物功能多样性的影响 109



图 3 培养 7 d后土壤微生物碳源利用主成分分析的因子荷载图
Fig. 3 Loadings for the principal component analysis (PCA) of
microbe in monoculture soil of tobacco after cultured in media
for 7 days

3 讨论
烟草连作障碍是一种普遍现象, 导致的烟草生
长不良、病害发生、产量下降, 已成为烟草生产中
的一个严重问题[1]。众多学者研究表明, 不同程度的
施肥用量及施肥方式可在一定程度上减轻烟草连作
障碍[8-10]。本研究发现, 添加适量农家肥或有机肥有
利于减轻烟草连作障碍, 且施加农家肥比商品有机
肥的效果明显。此外, 施肥可改变烟草连作土壤的
微生物种群和数量, 进而改变连作土壤对烟草的化
感自毒作用[8,10]。一般认为, 各种微生物生理类群在
土壤微生态环境中发挥重要作用, 它们在物质转化
与分解中具有特定的功能。土壤微生物群落结构主
要指土壤中各主要微生物类群在土壤中的数量以及
各类群所占的比率, 其数量及结构的变化直接影响
根际微生物整体功能, 在植物根系的微生态环境中
微生物在物质和能量的转化中起着重要作用。可见,
揭示施肥对连作烟草土壤微生物功能多样性的影响,
对于进一步利用施肥种类来消减烟草连作障碍具有
重要意义。本研究表明, 施肥有利于土壤微生物种
群数量的提升, 但不同施肥种类对连作烟草土壤微
生物群落功能的影响存在显著差异。从 31个碳源因
子中提取与碳源利用相关的主成分 1 和主成分 2 能
够解释变量方差总和为 100%, 而在两大成分分离
中起主要贡献作用的是糖类、脂肪酸类、酚酸类碳
源。土壤微生态系统功能的发挥是一个紧密联系过
程, 连作烟草土壤的化感自毒潜力与以糖类和酚酸
类物质为碳源的微生物 AWCD 值变化呈显著正相
关。可见酚酸类、糖类利用相关的土壤微生物的利
用效率变化对连作烟草土壤化感自毒潜力的影响起
着关键的作用。谭秀梅等[15]研究表明, 杨树人工林

表 1 土壤中与主成分 1和主成分 2显著相关的主要培养基成分
Table 1 Main components in media significantly correlated with principle components 1 and 2 in PCA for each soil
主成分
Principal components
不同碳源
Different carbon resources
相关系数
Correlation coefficient
α-D-lactose 1.00**
D-cellobiose 1.00**
Glycogen 1.00**
α-cyclodextrin 1.00**
D,L-α-glycetol phosphate 1.00**
Glucose-1-phosphate 1.00**
D-galacturonic acid 1.00**
N-acetyl-D-glucosamine 1.00**
D-mannitol 1.00**
D-xylose 1.00**
β-methyl-D-glucose 1.00**
4-hydroxy benzoic acid 0.98*
Itaconic acid 1.00**
1-erythritol 1.00**
D-galacturonic acid 1.00**
主成分 1
Principal component 1
D-glucosaminic acid 1.00**
γ- hydroxybutyric acid 0.98* 主成分 2
Principal component 2 4-hydroxy benzoic acid 1.00**
**相关性达极显著水平(P<0.01); *相关性达显著水平(P<0.05)。
**Significant at P<0.01; *Significant at P<0.05.
110 作 物 学 报 第 37卷

表 2 不同施肥条件下连作烟草土壤微生物 AWCD值与土壤化感自毒潜力的相关性分析
Table 2 Correlation between the AWCD value of microbial community and its autotoxic allelopathic potential of monoculture soil of
tobacco under different fertilizer treatments
自毒潜力
Autotoxic potential
不同碳源培养条件下的微生物 AWCD值
AWCD value of microbe flora culture in different carbon sources 项目
Item 烟草
Tobacco
莴苣
Lettuce
糖类
Carbohydrate
酚酸类
Phenolic acid
脂肪酸类
Fatty acid
羧酸衍生物类
Carboxylic acid
胺类
Amide
氨基酸类
Amino acid
烟草
Tobacco
1.00** 自毒潜力
Autotoxic
potential 莴苣
Lettuce
1.00** 1.00**


糖类
Carbohydrate
0.99** 0.98* 1.00**
酚酸
Phenolic acid
0.98* 0.99* 0.94 1.00**
脂肪酸
Fatty acid
0.94 0.96* 0.89 0.99** 1.00**
羧酸衍生物
Carboxylic acid
0.57 0.51 0.66 0.37 0.25 1.00**
胺类
Amide
0.24 0.18 0.36 0.03 0.11 0.94 1.00**
不同碳源培
养条件下的
微生物
Microbe
flora culture
in different
carbon
source
氨基酸类
Amino acid
0.64 0.68 0.55 0.79 0.87 0.27 0.59 1.00**
**相关性达极显著水平(P<0.01); *相关性达显著水平(P<0.05)。**Significant at P<0.01; * Significant at P<0.05.

连作后土壤中的酚酸类物质含量增加, 且酚酸的增
加降低了土壤中氨化细菌的繁殖。张淑香等[16]研究
也发现, 连作大豆易导致土壤中酚酸类物质积累。
可见, 连作烟草土壤, 酚酸类物质的积累可能是导
致烟草连作障碍产生的原因之一, 而施用农家肥可
促进土壤中以酚酸为碳源微生物的类群的繁殖, 这
类微生物的繁殖降低了烟草土壤中酚酸的积累, 在
一定程度上减轻了烟草连作障碍。
在各种微生物的 AWCD值相关性中, 农家肥处
理下的微生物高于有机肥处理。而使用常规复合肥
处理时有利于促进胺类、氨基酸类、脂肪酸类、羧
酸类利用相关的微生物生长, 但抑制酚酸类、糖类
利用相关的微生物生长(表 4)。施用农家肥最利于减
轻连作障碍, 施用有机肥次之, 施用常规复合肥最
小。由此可见, 连作烟草土壤的化感自毒作用与土
壤中糖类和酚酸类物质的数量存在显著的关系, 然
而土壤微生态系统微生物的种类繁多, 糖类与酚酸
类利用相关的微生物究竟有哪几类?这些微生物种
类之间又是如何传递信号促进或抑制其他类别微生
物生长, 从而影响土壤化感自毒作用的仍待深入探
讨。
4 结论
合理施肥可不同程度上减轻连作对烟草生长带
来的影响。农家肥的使用最利于改善烟草连作障碍,
商品有机肥次之, 常规复合肥最差。农家肥主要以
促进土壤中利用糖类和酚酸类物质为碳源的微生物
生长来调节或减轻连作对烟草生长的影响。修复长
期连作导致的土壤微生物结构变异与功能恶化是有
效克服连作障碍的重要途径。
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