全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2009, 35(8): 1491−1499 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(30871300)资助。
*
通讯作者(Corresponding author): 张骁, E-mail: xzhang@henu.edu.cn
第一作者联系方式: E-mail: linzhang@henu.edu.cn
Received(收稿日期): 2009-02-20; Accepted(接受日期): 2009-04-22.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2009.01491
NO与 Ca2+对蚕豆保卫细胞气孔运动的互作调控
张 霖 赵 翔 王亚静 张 骁*
河南省植物逆境生物学重点实验室 / 河南大学生命科学学院, 河南开封 475004
摘 要: 以蚕豆(Vicia faba L.)为材料研究 NO和 Ca2+对蚕豆气孔运动及质膜 K+通道的影响。结果表明, 10 mmol L−1
Ca2+和 100 μmol L−1 NO供体 SNP均有效抑制气孔开放, NO清除剂 c-PTIO不能缓解 Ca2+抑制气孔开放, 相反胞外加
入 0.1 mmol L−1 Ca2+可以明显加强 NO对气孔开放的抑制程度, 该现象可被 La3+(Ca2+通道抑制剂)缓解。以膜片钳技
术记录全细胞K+电流发现, 胞外 10 μmol L−1或 100 μmol L−1 SNP均可选择性抑制蚕豆保卫细胞质膜内向K+通道, 追
加 0.1 mmol L−1 Ca2+可显著激活质膜外向 K+通道 , 且可被 La3+所缓解, 然而 0.1 mmol L−1 Ca2+单独作用并不影响质
膜外向 K+通道活性。10 mmol L−1 Ca2+单独处理可激活质膜外向 K+通道 , 但不能被 c-PTIO缓解。分别用 Ca2+和
NO专一的荧光探针 Fluo-3-AM和 DAF-2DA标记蚕豆保卫细胞原生质体, 检测胞内 Ca2+和 NO的水平变化发现, 100
μmol L−1 SNP明显诱导胞内 Ca2+积累, 但 10 mmol L−1 Ca2+并不能诱导 NO在细胞内积累。记录保卫细胞质膜 Ca2+
通道电流发现, NO可明显激活质膜 Ca2+通道。表明 NO有效抑制气孔开放, 可能主要通过激活质膜 Ca2+通道, 提高
胞内 Ca2+, 激活质膜外向 K+通道促进 K+外流 , 同时 , 可选择性抑制内向 K+通道阻止 K+内流, 两种途径共同作用
抑制气孔开放。然而, 胞外 10 mmol L−1 Ca2+对气孔和质膜 K+通道活性的调节并不依赖于 NO。
关键词: 钙离子 ; 一氧化氮 ; 保卫细胞 ; 质膜 K+通道 ; 信号转导
Crosstalk of NO with Ca2+ in Stomatal Movement in Vicia faba Guard Cells
ZHANG Lin, ZHAO Xiang, WANG Ya-Jing, and ZHANG Xiao*
Henan Key Laboratory of Plant Stress Biology, School of Life Sciences, Henan University, Kaifeng 475004, China
Abstract: Previous studies suggested that both NO and Ca2+ can serve as a signalling intermediate in ABA, H2O2-induced
stomatal movement. However, its mechanism(s) of action is not well defined in guard cells and, generally, in higher plants. In this
study, extracellular 10 mmol L−1 Ca2+ significantly inhibited stomatal opening, which was not alleviated by carboxy PTIO
(c-PTIO, a NO scavenger). Sodium nitroprusside (SNP, a NO donor) showed effects of inhibition on stomatal opening at concen-
tration of 10 or 100 μmol L−1. However, 0.1 mmol L−1 Ca2+ facilitated NO-inhibited stomatal opening, which was alleviated by
LaCl3 (a Ca2+channel inhibitor) at concentration of 1 mmol L−1. To gain further insights into Ca2+ function in NO-regulated
stomatal movement, we patch-clamped Vicia faba guard cell protoplasts in a whole-cell configuration. In the absence of extracel-
lular Ca2+, NO inhibited inward rectifying K+ current at concentration of 10 or 100 μmol L−1, but have little effects on outward
rectifying K+ current. NO significantly activated outward rectifying K+ current, when CaCl2 was added to the bath solution, at
concentration of 0.1 mmol L−1, which was alleviated by LaCl3. In contrast, 0.1 mmol L−1 CaCl2 alone had little effects on inward
or outward rectifying K+ current. Extracellular Ca2+ significantly inhibited inward rectifying K+ current and activated outward
rectifying K+ current at concentration of 10 mmol L−1, which was not alleviated by c-PTIO. A single-cell analysis of cytosolic
Ca2+ and NO using Ca2+ or NO specific fluorescence probe Fluo-3-AM and DAF-2DA revealed that 100 μmol L−1 SNP evidently
induced accumulation of Ca2+ in the guard cells, which was partially alleviated by LaCl3, but 0.1 or 10 mmol L−1 CaCl2 had few
effects on the accumulation of NO in the guard cells. These results indicated that NO promotes influx of Ca2+ into cytoplasm
through Ca2+ channels to activate outward rectifying K+ channels and promotes K+ eflux, alternatively, NO inhibits inward recti-
fying K+ channels and blocks K+ influx, thus inhibiting stomatal opening and preventing the excessive loss of water in plants. In
addition, extracellular Ca2+ at concentration of 10 mmol L−1 modulates stomatal movement and plasma membrane K+ channels of
Vicia guard cells in a NO-independent signaling pathway.
Keywords: Calcium; Nitric oxide; Guard cell; Plasma membrane K+ channels; Signal transduction
1492 作 物 学 报 第 35卷

Ca2+已被广泛认为是胞内信使 , 参与 ABA、
H2O2 诱导的气孔关闭[1-2]。诸多生物及非生物胁迫
都会引起植物胞质 Ca2+浓度([Ca2+]cyt)的上升[3-4], 植
物可以根据[Ca2+]cyt变化的差异如位置、幅度、频率
及持续的时间解码不同的刺激从而使细胞作出相应
的反应[5]。研究发现胞外 Ca2+可通过引起保卫细胞
[Ca2+]cyt 振荡以诱导气孔关闭 [6]。盐胁迫下 , 胞外
Ca2+浓度 ([Ca2+]ext)增加可引起 [Ca2+]cyt 上升 [7-8],
Schroeder 等[9]报道[Ca2+]cyt 的上升, 可有效抑制内
向 K+ 通道、激活外向 K+ 通道, 促使气孔关闭。尽
管如此, 胞外 Ca2+影响[Ca2+]cyt 的机制并不清楚。
Tang等[10]研究表明, 胞外 Ca2+作为一种信号与质膜
Ca2+受体 CAS 结合, 激活磷脂酶 C(PLC), 产生 IP3
诱导胞内钙库释放 Ca2+, 以提升胞内 Ca2+, 然而
McAinsh等[11]认为胞外 Ca2+诱导胞内 Ca2+升高不需
要磷脂酶 C, 但涉及到 Ca2+流入。研究酵母发现, 胞
外 Ca2+可通过 Cch1p and Mid1p-Ca2+运输体系进入
细胞提高[Ca2+]cyt[12]。由此可见, 生物体对控制体内
循环流动的 Ca2+ 有着精确的调节机制, 以应对周边
环境的变化。
NO 作为重要的信号分子对调控动物细胞 Ca2+
通道活性和监控胞内 Ca2+平衡起着重要的作用[13-14],
NO 和 Ca2+信号系统形成重要的网络, 共同参与多
种生理过程的调控[15]。植物防御反应中 cGMP 和
cADPR 介导了 NO 信号转导途径[16], 而 cGMP 和
cADPR 是触发胞内Ca2+信号途径启动的重要成员[17]。
我们前期的研究表明, NO位于 H2O2下游介导 ABA
诱导的气孔关闭[18], 也可通过诱导质膜 H+-ATPase
脱磷酸化介导 ABA 抑制蓝光诱导的气孔开放 [19],
Yan 等[20]报道 NO 也可有效介导 ABA和 H2O2抑制
的气孔开放。作为逆境信号的 ABA和 H2O2, 可通过
激活质膜 Ca2+通道, 促使胞外 Ca2+内流, 提升胞内
Ca2+浓度 , 以发挥其对气孔运动的调节 [2,21]。那么
NO 是否通过调节胞内 Ca2+的平衡, 以对气孔运动
调节呢？刘新等[22]利用保卫细胞质膜 Ca2+通道抑制
剂处理蚕豆表皮条可以抑制 NO 诱导的气孔关闭,
初步证明 Ca2+参与 NO 的信号转导, 但其调节机制
并不清楚。Garcia-Mata 等[23]研究发现, NO 对蚕豆
保卫细胞质膜内向K+通道的调节依赖于胞内钙库释
放 Ca2+。然而 Sokolovski等[24]报道, NO有效抑制保
卫细胞质膜外向 K+通道, 但并不依赖于胞内钙库释
放 Ca2+。我们在研究小麦时发现, NO可有效激活小
麦根表皮细胞质膜内向 K+通道, 促进根细胞对 K+
的吸收, 抵御干旱胁迫[25]。而外源 Ca2+是否参与 NO
对保卫细胞质膜K+通道和气孔运动的调节以及作用
机制等问题并不清楚。
最近, 我们研究发现胞外 Ca2+可有效调节保卫
细胞质膜 K+通道, 影响气孔运动[8], 同时 NO也可以
有效调节保卫细胞质膜 K+通道, 调节气孔运动[24-25]。
Garcia-Brugger 等[26]报道植物抗病防御反应中, NO
的生物合成依赖于胞外 Ca2+的内流。弄清楚 NO 和
Ca2+在气孔运动调节方面的“交谈”(crosstalk)机制 ,
对于理解控制植物水分利用的气孔调节机制具有重
要意义。为此, 本研究利用药理学、电生理学及细
胞生物学的技术和方法, 综合探讨 NO 和 Ca2+对气
孔运动的调控, 为深入研究 NO 及 Ca2+的细胞及分
子机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 植物材料
将蚕豆(Vicia faba L.)种子用 75%乙醇表面消毒
5 min, 在生化培养箱中催芽 3~4 d, 播种于培养土
(营养土∶蛭石为 2∶1)中。蚕豆生长的光/暗周期为
12 h/12 h, 光照强度为 0.20~0.30 mmol m−2 s−1, 昼夜
温度分别为(25±2)℃和(20±2) , ℃ 相对湿度在 70%左
右, 生长期间无胁迫。
1.2 药品和试剂
硝普钠(sodium nitroprusside, SNP); c-PTIO [2-(4-
carboxyphenyl)-4,4,5,5 tetramethylimidazoline]; EGTA;
4,5-diaminofluorescein diacetate (DAF-2DA)和 Fluo-
3-AM 购自 Sigma 公司, 使用前配成 50 mmol L−1
DMSO 溶液 , 分成小包装冷冻保存 ; 纤维素酶
(cellulase RS)购自日本 Yakult Honsha公司; 果胶酶
(pectolyase Y-23) 购自日本 Seishin Pharmaceutical
公司; 其他试剂均为分析纯。
1.3 表皮条的生物分析
参照 Zhang 等[27]方法, 取 3~4 周龄蚕豆苗顶端
第 1~2 对完全展开的叶片, 用蒸馏水洗净, 撕取下
表皮, 洗去叶肉细胞后, 切成 5 mm长的表皮条, 暗
处理 2 h诱导气孔关闭。用CO2-free 10 mmol L−1 MES,
50 mmol L−1 KCl, pH 6.15开放缓冲液为对照, 以缓
冲液中加入不同浓度的 CaCl2为处理, 同时在 23℃
下, 光照(0.20~0.30 mmol m−2 s−1) 2 h。然后在 10×25
倍倒置显微镜下用测微尺测定气孔宽长比值。每个
处理至少测 3个表皮条, 每个表皮条中随机测 20个
气孔开度, 每个处理重复 5 次(不少于 300 个气孔开
度), 统计平均值和标准误差。
第 8期 张 霖等: NO与 Ca2+对蚕豆保卫细胞气孔运动的互作调控 1493


1.4 蚕豆保卫细胞原生质体的分离及质膜 K+和
Ca2+通道电流记录
参照 Zhang 等[28]的方法分离原生质体, 取 3~4
周龄苗顶端第 2 对完全展开叶, 用蒸馏水洗净, 撕
取下表皮, 洗净叶肉细胞后, 切成约 5 mm长的表皮
条, 进行酶解提取。酶解液含 1.3%纤维素酶 RS、
0.0075%果胶酶(Pectolyase Y-23)、0.25%牛血清蛋白
(BSA)、0.5 mmol L−1抗坏血酸, 用山梨醇调渗透压
至 460 mOsmol kg−1, pH 5.5 (KOH)。
采用 Hamill 等[29]常规全细胞记录技术记录质
膜 K+电流。无钙细胞外液含 10 mmol L−1谷氨酸钾、
2 mmol L−1 MgCl2、1 mmol L−1 KOH和 10 mmol L−1
Mes; 含钙细胞外液含 10 mmol L−1 谷氨酸钾、2
mmol L−1 MgCl2、1 mmol L-1 KOH、10 mmol L−1 Mes
和 0.1 mmol L−1 CaCl2, 上述两种细胞外液均用山梨
醇调渗透压至 460 mOsmol kg−1, 并调 pH 至 5.5
(KOH)。电极液均包含 100 mmol L−1 谷氨酸钾、2
mmol L−1 MgCl2、4 mmol L−1 KOH、1.1 mmol L−1
Mg-ATP、10 mmol L−1 HEPES, 山梨醇调渗透压为
510 mOsmol kg−1, pH 7.2 (KOH)。使用 EPC-9膜片钳
放大器(HEKA Elektronik, Lambrecht, Germany)测定
全细胞电流 , 刺激电压从–190 mV 逐级去极化到
+110 mV, 每级为+20 mV, 维持时间 3 s, 频率为 0.2
Hz。全细胞封接形成 10~15 min 后采集数据, 以连
续两次稳定的值作为对照电流, 不同浓度 SNP 或
SNP+La3+等(图注)处理 10 min后采集处理数据。使
用 PULSE+PULSEFIT 软件采集和分析全细胞电流,
每一实验重复 6~8次。
采用 Miao 等[30]全细胞记录技术记录质膜 Ca2+
电流。细胞外液含 100 mmol L−1 CaCl2, 0.1 mmol L−1
DTT, 10 mmol L−1 MES-Tris (除其他提及诸如 100
µmol L−1SNP或者 1 mmol L−1 LaCl3等用作处理外),
用山梨醇调渗透压至 490 mOsmol kg−1, pH调至 5.6;
电极液均包含 10 mmol L−1 BaCl2, 0.1 mmol L−1 DTT,
4 mmol L−1 EGTA, 和 10 mmol L-1 HEPES-Tris, 用山
梨醇调渗透压至 510 mOsmol kg−1, pH调至 7.2。使
用 EPC-9 膜片钳放大器 (HEKA Elektronik, Lam-
brecht, Germany)测定全细胞电流, 刺激电压从–190
mV 逐级去极化到+30 mV。全细胞封接形成 10~15
min 后采集数据, 以连续两次稳定的值作为对照电
流, 不同浓度 SNP或 SNP+La3+ 等(图注)处理 10 min
后采集处理数据。使用 PULSE+PULSEFIT软件采集
和分析全细胞电流, 每一实验重复 8~10次。
1.5 荧光探针的负载及荧光图像的记录
参照 Zhang等[31]的方法负载 Ca2+ 荧光探针, 原
生质体的分离同上, 将分离好的原生质体放在 5 mL
负载缓冲液 [10 μmol L−1 Fluo 3-AM, 0.2% (V/V)
pluronic F-127, 5 mmol L−1 MES, pH 5.0] 用山梨醇
调渗透压至 500 mOsmol kg−1, 暗处 4 , ℃ 负载 1.5 h。
参照 Lü等[18]的方法负载NO荧光探针, 将分离
好的原生质体放在 5 mL 负载缓冲液(10 mmol L−1
MES, 50 mmol L−1 KCl, pH 6.15)中, 然后将 NO荧光
探针加入盛有原生质体的负载缓冲液中混匀 , 使
DAF-2DA终浓度为 20 μmol L−1, 负载温度控制在
25 , ℃ 负载 20 min。
将负载 DAF-2DA 和 Fluo-3-AM 的原生质体用
漂洗缓冲液(10 mmol L−1 MES, 50 mmol L−1 KCl, 1
mmol L−1 CaCl2, 用山梨醇调渗透压至 500 mOsmol
kg−1, 并调 pH 至 6.0)中漂洗两次, 以洗去细胞表层
多余的探针, 然后用盖玻片迅速将原生质体固定在
显微镜载物台上 , 用激光共聚焦扫描显微镜 (FV
1000, Olympus)观察。LCSM 的工作条件为 Ex=488
nm, Em=500~550 nm, Power 2%, Zoom 3~5, 中速扫
描, Frame 512×512 pixel, 对每个细胞荧光变化做适
时记录。每个实验至少重复 5次, 当结果一致时, 取
其中一个细胞用 FV10ASW1.6软件分析荧光强度。
2 结果与分析
2.1 NO和 Ca2+对气孔运动的调节
图 1所示, 胞外 0.1 mmol L−1 CaCl2可促进气孔
开放, 而 10 mmol L−1 CaCl2处理可明显抑制气孔开
放, 使气孔开度下降 62.0%, 追加 c-PTIO (NO 的清
除剂)并不影响胞外 Ca2+对气孔运动的调节作用。此
外, 10 μmol L−1和 100 μmol L−1 NO供体 SNP均可不
同程度地抑制气孔开放。有趣的是, 胞外追加 0.1
mmol L−1 CaCl2, 显著增强了 100 μmol L−1 SNP处理
对气孔开度的抑制作用, 且该现象可被 Ca2+通道抑
制剂 La3+缓解。该结果表明, NO可能主要通过调节
质膜 Ca2+通道, 促进胞外 Ca2+的内流, 以抑制气孔
开放; 然而胞外 10 mmol L−1 Ca2+对气孔开度的抑制
并不依赖于 NO。
2.2 NO 与 Ca2+对蚕豆保卫细胞质膜 K+通道的
调节
胞外液存在 0.1 mmol L−1 CaCl2的条件下 , 10
μmol L−1 SNP 可有效抑制质膜内向 K+通道电流 ,
但对质膜外向 K+通道电流影响较小 ; 100 μmol L−1
1494 作 物 学 报 第 35卷



图 1 外源 NO和 Ca2+ 对蚕豆气孔运动的调节
Fig. 1 Regulation of exogenous NO and Ca2+ on stomatal
movement in Vicia faba
CK：对照; –Ca= 0 mmol L−1, LCa=0.1 mmol L−1, HCa=10 mmol
L−1为 Ca2+ 梯度处理; SNP1=10 μmol L−1, SNP2=100 μmol L−1为
SNP梯度处理; SNP2+La=100 μmol L−1 SNP+ 1 mmol L−1 LaCl3;
c-PTIO浓度为 200 μmol L−1, 图中每个值来自于 300个测量结果
的平均值(n=6)。
The concentrations of CaCl2 used are 0 mmol L−1 for –Ca, 0.1 mmol
L−1 for LCa and 10 mmol L−1 for HCa; The concentrations of SNP
used are10 μmol L−1 for SNP1, 100 μmol L−1 for SNP2; SNP2+La
for 100 μmol L−1 SNP+ 1 mmol L−1 LaCl3; c-PTIO for 200 μmol L−1.
Each value is the mean of 300 measurements ±SE (n=6).

SNP 明显抑制保卫细胞质膜内向 K+通道电流 , 显
著激活其外向 K+通道电流 , 然而当 1 mmol L−1
La3+ (质膜 Ca2+通道抑制剂)与 100 μmol L−1 SNP共
同处理时, 发现 NO对保卫细胞质膜外向 K+通道电
流的激活作用被抑制(图 2)。进一步说明 NO对气孔
开度的抑制, 可能主要通过调节质膜 Ca2+通道, 促
进胞外 Ca2+的内流, 进而影响质膜 K+通道活性, 导
致大量 K+外流, 气孔关闭。
为排除胞外 0.1 mmol L−1 Ca2+本身对保卫细
胞质膜 K+通道的影响 , 如图 3 所示 , 人为去除胞
外 Ca2+, 并记录全细胞 K+通道电流 , 结果发现 K+
通道电流并没有明显变化(图 2 和图 3 中 CK), 因
此排除了 0.1 mmol L−1 Ca2+本身对质膜 K+通道调
控。然而 , 无胞外 Ca2+下 , NO供体 SNP处理同样
能够抑制保卫细胞质膜内向K+通道电流 , 但并不激
活其外向 K+通道电流。只有胞外追加 0.1 mmol L−1
CaCl2 时 , 方可显著激活保卫细胞质膜外向 K+通
道电流。该结果进一步证实胞外 Ca2+介导 NO 对
保卫细胞质膜 K+通道调控。
胞外 10 mmol L−1 Ca2+也可明显抑制气孔开放
(图 1)。检测其对保卫细胞质膜 K+通道电流的影
响发现 , 10 mmol L−1 CaCl2处理几乎完全抑制保卫
细胞质膜内向 K+通道电流 , 显著激活其外向 K+
通道电流 , 该现象并不能被 200 μmol L−1 c-PTIO
缓解(图 4)。结果表明, 胞外 10 mmol L−1 Ca2+对保
卫细胞质膜 K+通道的调节并不依赖于 NO。



图 2 外源 NO 在低浓度的胞外 Ca2+条件下对蚕豆保卫细胞质膜内向及外向 K+通道的调节
Fig. 2 Regulation of exogenous NO on inward-rectifying and outward-rectifying K+ channel current from protoplasts in Vicia faba
guard cells in response to 0.1 mmol L−1 CaCl2
A: 不同处理对电压依赖的蚕豆保卫细胞内向及外向 K+ 通道电流的影响; B: 全细胞跨膜 K+电流(pA)与跨膜电势(mV)的关系; CK: 对
照; SNP1: 10 μmol L−1 SNP; SNP2: 100 μmol L−1 SNP; SNP2+La: 100 μmol L−1 SNP和 1 mmol L−1 LaCl3共同处理。B中每个数据均来自
6个独立重复试验的平均值±标准误。
A: effects of different treatments on Voltage-dependent Vicia faba guard cell inward-rectifying and outward-rectifying K+ channel current;
B: relationship between the whole cell K+ current (pA) and membrane potential (mV); CK: control; SNP1: 10 μmol L−1 SNP; SNP2: 100 μmol
L−1 SNP; SNP2+La: 100 mol L−1 SNP+1 mmol L−1 LaCl3 treatments. Each value in B is the mean current (current) from six independent
experiments and the error bar denotes the standard error.
第 8期 张 霖等: NO与 Ca2+对蚕豆保卫细胞气孔运动的互作调控 1495




图 3 外源 NO在无胞外 Ca2+条件下对蚕豆保卫细胞质膜内向及外向 K+通道的调节
Fig. 3 Regulation of exogenous NO on inward-rectifying and outward-rectifying K+ channel current from protoplasts in Vicia faba
guard cells
A: 不同处理对电压依赖的蚕豆保卫细胞内向及外向 K+通道电流的影响; B: 全细胞跨膜 K+电流(pA)与跨膜电势(mV)的关系; CK: 对
照; SNP1: 10 μmol L−1 SNP; SNP2: 100  μmol L−1 SNP; SNP2+LCa: 100 μmol L−1 SNP和 0.1 mmol L−1 CaCl2共同处理。B中每个数据均
来自 6个独立重复试验的平均值±标准误。
A: effects of different treatments on Voltage-dependent Vicia faba guard cell inward-rectifying and outward-rectifying K+ channel current;
B: relationship between the whole cell K+ current (pA) and membrane potential (mV); CK: control; SNP1: 10 μmol L−1 SNP; SNP2: 100 μmol
L−1 SNP; SNP2+LCa: 100  μmol L−1 SNP+0.1 mmol L−1 CaCl2 treatments. Each value in B is the mean current (current) from six independent
experiments and the error bar denotes the standard error.



图 4 外源 Ca2+ 对蚕豆保卫细胞质膜内向及外向 K+ 通道的调节
Fig. 4 Regulation of exogenous Ca2+ on inward-rectifying and outward-rectifying K+ channel current from protoplasts in Vicia faba
guard cells
图中 A和 B处理同图 2; CK: 对照; HCa: 10 mmol L−1 CaCl2; HCa +c-PTIO: 10 mmol L−1 CaCl2和 200 μmol L−1 c-PTIO共同处理。B中
每个数据均来自 6个独立重复试验的平均值±标准误。
The treatments of A and B are the same as in Fig. 2. CK: control; HCa: 10 mmol L−1 CaCl2; HCa +c-PTIO: 10 mmol L−1 CaCl2+200 μmol L−1 c-PTIO
treatments. Each value in B is the mean current (current) from six independent experiments and the error bar denotes the standard error.

2.3 NO对蚕豆保卫细胞内 Ca2+水平的影响
用 Ca2+专一的荧光探针 Fluo-3-AM标记蚕豆保
卫细胞原生质体检测胞内 Ca2+的水平变化。结果显
示, 100 μmol L−1 SNP处理保卫细胞原生质体 2 min
后即可促进 Ca2+内流, 处理 10 min后显著诱导 Ca2+
在保卫细胞中积累, La3+的加入可部分缓解 SNP 诱
导胞内 Ca2+积累(图 5)。进一步证明了胞外 Ca2+介导
NO 对保卫细胞质膜 K+通道和气孔运动的调节主
1496 作 物 学 报 第 35卷



图 5 NO诱导的胞内 Ca2+(以 Fluo-3-AM荧光显示)产生和变化的过程
Fig. 5 Levels of Ca2+ generation from guard cells after exogenous NO was added
A：不同处理后保卫细胞原生质体内 Fluo-3-AM的荧光变化过程; a1~a5：对照的保卫细胞中 Fluo-3-AM的荧光变化; b1~b5：100 μmol
L−1 SNP处理后保卫细胞中 Fluo-3-AM荧光变化图; c1~c5：100  μmol L−1 SNP和 1 mmol L−1 LaCl3共同处理后保卫细胞内 Fluo-3-AM
荧光变化图; 时间顺序如下: a1、b1和 c1为处理前对照, a2~a5、b2~b5和 c2~c5分别表示处理后 2、4、6、8 min时荧光图。B: 不同
处理后保卫细胞原生质体内 Fluo-3-AM的荧光变化统计分析。
A: effects of different treatments on levels of Ca2+ generation from guard cells; a1–a5: Fluo-3-AM fluorescence picture of control; b1–b5:
fluorescence picture after adding SNP 100  μmol L−1; c1–c5: fluorescence picture after adding SNP 100 μmol L−1 with 1 mmol L−1 La3+; a1, b1,
c1: images before treatment; a2–a5, b2–b5, and c2–c5 show the time course of fluorescence changes at in different treatments respectively.
Each value in B is the levels of Ca2+ in guard cells from six independent experiments and the error bar denotes the standard error.

要通过质膜 Ca2+通道从胞外进入胞内实现。
用NO专一的荧光探针DAF-2DA检测保卫细胞
内 NO 水平的变化。如图 6 所示, 外源单独施加 1
mmol L−1 CaCl2或 10 mmol L−1 CaCl2处理时均不能
引起蚕豆保卫细胞内 NO 积累。说明胞外 10 mmol
L−1 Ca2+对保卫细胞质膜 K+通道和气孔运动的调节
并不依赖于 NO。
2.4 NO对蚕豆保卫细胞质膜 Ca2+通道调节
如图 7 所示, 细胞质膜超极化并不能激活质膜
Ca2+通道(n =15), 胞外追加 100 μmol L−1SNP后, 绝
大部分细胞的全细胞 Ca2+通道电流在超极化下被激
活(n =12), 1 mmol L−1 La3+的加入可明显抑制 NO激
活的质膜 Ca2+电流。表明外源 Ca2+介导 NO 对保卫
细胞质膜 K+通道的调节, 主要通过质膜 Ca2+通道进
入胞内实现。
3 讨论
在干旱胁迫条件下, 植物调整合适的气孔开度
以防止水分的过度散失, 并确保二氧化碳的吸收以
保证光合作用的进行, 这对植物的生长发育至关重
要。表皮生物分析显示, 胞外 0.1 mmol L−1 Ca2+可促
进气孔开放, 10 mmol L−1Ca2+处理明显抑制气孔开放,
使气孔开度下降 62.0%(图 1), 这与McAinsh等[11]的研
究结果相似, 即较高浓度的胞外 Ca2+ 可以诱导气孔



图 6 外源 Ca2+ 诱导的胞内 NO(以 DAF-2DA荧光显示)产生和变化的过程
Fig. 6 Levels of NO generation from guard cells after exogenous Ca2+ was added
图中 A和 B处理同图 5; a1~a5为对照处理保卫细胞中 DAF-2DA的荧光变化; b1~b5：0.1 mmol L−1 CaCl2处理后保卫细胞中 DAF-2DA
荧光变化图; c1~c5：10 mmol L−1 CaCl2处理后保卫细胞内 Fluo-3-AM荧光变化; 时间顺序如下: a1、b1和 c1为处理前对照, a2~a5、b2~b5
和 c2~c5分别表示处理后 2、4、6、8 min时荧光图。
The treatments of A and B are the same as in Fig. 5. a1–a5: DAF-2DA fluorescence picture of control; b1–b5: fluorescence picture after add-
ing CaCl2 1 mmol L−1; c1–c5: fluorescence picture after adding CaCl2 10 mmol L−1. a1, b1, c1: images before treatment; a2–a5, b2–b5, and
c2–c5 show the time course of fluorescence changes in different treatments respectively. Each value in B is the levels of NO in guard cells
from six independent experiments and the error bar denotes the standard error.
第 8期 张 霖等: NO与 Ca2+对蚕豆保卫细胞气孔运动的互作调控 1497




图 7 外源 NO对蚕豆保卫细胞质膜 Ca2+ 通道的调节
Fig. 7 Regulation of exogenous NO on Ca2+ channel current from protoplasts in Vicia faba guard cells
A: 不同处理对蚕豆保卫细胞质膜 Ca2+ 通道电流的影响; B:全细胞电流在–190 mV下变化统计。CK: 对照; SNP: 10 μmol L−1 SNP;
SNP+La: 100 μmol L−1 SNP和 1 mmol L−1 LaCl3共同处理。B中每个数据均来自 12个独立重复试验的平均值±标准误。
A: effects of different treatments on Ca2+ channel current from protoplasts in Vicia faba guard cells; B: whole cell Ca2+ channel current in
response to membrane potential of –190 mV; CK: control; SNP: 100 μmol L−1 SNP; SNP+La: 100 μmol L−1 SNP+1 mmol L−1 LaCl3 treat-
ments. Each trace was plotted with the mean value of 12 recordings from 12 different cells, respectively.

关闭。Gethyn 等[6]报道胞外 Ca2+ 可引起保卫细胞
[Ca2+]cyt 振荡以诱导气孔关闭。我们前期研究发现,
胞外 Ca2+浓度([Ca2+]ext)增加可引起[Ca2+]cyt 上升[8],
而[Ca2+]cyt 升高可有效抑制气孔开放[9]。由此, 推测
胞外 Ca2+可能主要通过诱导胞内 Ca2+的增加以影响
气孔运动。但[Ca2+]ext 对[Ca2+]cyt 及气孔运动调节的
机制仍不清楚。
众所周知, NO与 Ca2+信号系统交联, 调控植物
细胞诸多生理过程 [15]。本研究发现, 10 mmol L−1
Ca2+和 100 mol L−1 NO供体 SNP均有效抑制气孔开
放, 0.1 mmol L−1 CaCl2明显增强 NO对气孔开度的
抑制效应, 该现象可被质膜 Ca2+通道抑制剂 La3+有
效阻止(图 1), 这与刘新等[22]的研究结果相似。尽管
有证据表明 La3+可以进入植物细胞[32], 胞内 Ca2+通
道也可被 La3+所抑制[33], 但是胞外 La3+的加入和胞
外 Ca2+的去除对 NO调节气孔运动作用的相似性(图
1), 表明 La3+主要是抑制了胞外 Ca2+的内流, 而非
抑制胞内 Ca2+库的释放。因此初步推测 Ca2+有效促
进 NO 对气孔开放的抑制效应, 可能主要通过激活
质膜 Ca2+通道, 进而促进胞外 Ca2+的内流实现。
气孔运动依赖于保卫细胞的收缩与膨胀, K+跨
膜流动可直接调节细胞的膨压, 导致气孔的开闭。
Schroeder 等[9]报道[Ca2+]cyt升高可以抑制内向 K+通
道、激活外向 K+通道, 抑制气孔开放。本实验发现,
胞外液存在 0.1 mmol L−1 CaCl2的条件下 , SNP可
有效抑制质膜内向 K+通道电流 , 其中 100 μmol
L−1 SNP 还显著激活其外向 K+通道电流。但胞外
无 Ca2+并不影响质膜 K+通道电流(图 2和图 3), 因
此排除了 0.1 mmol L−1 Ca2+本身对质膜 K+通道的
调控。有趣的是 , 去除胞外 Ca2+, NO供体 SNP处
理依然能够抑制保卫细胞质膜内向K+通道电流 , 但
并不能激活其外向 K+通道电流 , 只有胞外追加 0.1
mmol L−1 CaCl2 时 , 方可显著激活保卫细胞质膜
外向 K+通道电流。该结果证实了 Ca2+参与 NO 对
保卫细胞质膜 K+通道调节, 同时也表明 NO 调节质
膜 K+通道的复杂性。
NO 对气孔运动及质膜 K+通道的调节依赖胞外
Ca2+的存在。胞外 Ca2+可能通过 NO 激活的钙通道
进入保卫细胞以调节质膜 K+通道。为证实这一推测,
我们研究了 NO 对保卫细胞质膜 Ca2+通道及胞内
Ca2+积累的影响, 发现 NO 可有效激活质膜 Ca2+通
道(图 7), 增加胞内 Ca2+积累(图 5)。同时发现 La3+的
加入可缓解 NO诱导胞内 Ca2+积累(图 5), 进一步证
实 NO 诱导胞内 Ca2+的积累, 可能主要是通过激活
质膜 Ca2+通道, 促使胞外 Ca2+的内流实现。
值得注意的是, 10 mmol L−1 CaCl2处理几乎完
全抑制保卫细胞质膜内向 K+通道电流 , 显著激活
其外向 K+通道电流(图 4), 抑制气孔开放(图 1), 这
与我们以前研究的结果一致 [8]。然而胞外 Ca2+影
响气孔运动的机制并不清楚。NO可有效激活保卫
细胞质膜 Ca2+通道(图 7), 调节质膜 K+通道(图 2 和
图 3), 影响气孔运动(图 1)。那么 NO是否参与胞外
Ca2+调节的气孔运动？为此我们在实验中加入 200
µmol L−1 c-PTIO (NO的清除剂), 结果发现, c-PTIO
并不能缓解胞外 10 mmol L−1 Ca2+对保卫细胞质膜
K+通道和气孔运动的调节效应。该结果表明 NO可
1498 作 物 学 报 第 35卷

能并不介导 10 mmol L−1 Ca2+对保卫细胞质膜 K+通
道的调节。使用 NO 专一的荧光探针 DAF-2DA 检
测保卫细胞内 NO的水平变化发现, 外源单独施加 1
mmol L−1 CaCl2或 10 mmol L−1 CaCl2处理时均不能
引起蚕豆保卫细胞内 NO积累(图 6)。进一步证实 10
mmol L−1 Ca2+对保卫细胞质膜 K+通道和气孔运动
的调节, 并不依赖于 NO。
4 结论
NO 有效抑制气孔开放, 可能主要通过激活质
膜 Ca2+通道促进胞外 Ca2+的内流, 提高胞内 Ca2+,
以有效激活质膜外向 K+通道促进 K+外流 , 并且可
选择性抑制内向 K+通道阻止 K+内流, 两种途径共
同作用抑制气孔开放 , 以防止植物水分的过度散
失。然而高浓度的胞外 Ca2+对气孔运动和质膜 K+
通道活性的调节并不依赖于 NO。
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