全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(6): 11161123 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由福建省科技重点项目(2008N0005), 福建省科技重点项目(2007N0011), 国家麻类产业技术体系建设(nycytx-19-s12)和国家公
益性行业(农业)科研专项(nyhyzx07-018-3)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 祁建民, E-mail: qijm863@163.com, Tel: 0591-83644898
第一作者联系方式: E-mail: wangbin_doc@163.com ** 共同第一作者
Received(收稿日期): 2010-09-16; Accepted(接受日期): 2011-03-06.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.01116
应用 ISSR分子标记绘制红麻种质资源 DNA指纹图谱
汪 斌 1 祁 伟 1,** 兰 涛 1 陈惠端 2 徐建堂 1 粟建光 3
李爱青 4 祁建民 1,*
1福建农林大学 / 作物遗传育种与综合利用教育部重点实验室, 福建福州 350002; 2 福建农林大学机电工程学院, 福建福州 350002;
3 中国农业科学院麻类研究所, 湖南长沙 410205; 4 安徽省种子管理总站, 安徽合肥 230001
摘 要: 以 6份红麻种质资源为材料, 对 UBC807~UBC890等 80个 ISSR引物进行筛选, 筛选出多态性好的 ISSR引
物 20个。利用这 20个 ISSR引物扩增来自国内外 84份红麻种质资源, 共获得 230条谱带, 平均每个引物扩增出 11.5
条谱带, 其中多态性谱带 185 条, 多态性条带比率为 80.43%, 表明供试的红麻种质资源遗传多样性较丰富。以供试
84份红麻种质资源的 ISSR扩增谱带为基础, 建立了供试材料扩增条带指纹数据库的 Excel文件。根据指纹图谱唯一
性原则, 采用自行开发的 DNA指纹数据分析软件, 再从 20个多态性好的 ISSR引物中遴选出 UBC 813、UBC 825、
UBC 836、UBC 888和 UBC 889引物, 绘制出 82个红麻种质资源的 DNA指纹图谱, 为红麻种质资源分子身份证的
构建奠定了基础。
关键词: 红麻; 种质资源; DNA; ISSR; 指纹图谱
Establishment of DNA Fingerprintings of Kenaf (Hibiscus cannabinus L.)
Germplasm Resources with ISSR Molecular Markers
WANG Bin1, QI Wei1,**, LAN Tao1, CHEN Hui-Duan2, XU Jian-Tang1, SU Jian-Guang3, LI Ai-Qing4, and
QI Jian-Ming1,*
1 Key Laboratory of Ministry of Education for Genetics, Breeding and Multiple Utilization of Crops, Fujian Agriculture and Forestry University,
Fuzhou 350002, China; 2 College of Mechanical and Electrical Engineering, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China;
3 Institute of Bast Fiber Crops, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Changsha 410205, China; 4 Anhui Province Seeds Management Station,
Hefei 230001, China
Abstract: Kenaf (Hibiscus cannabinus L.) is an important economic crop in China. To identify germplasm resources and establish
the data base of DNA fingerprintings, we adopted six kenaf germplasm resources to screen 80 ISSR primers, 20 of which were
polymorphic. Then 20 ISSR primers were used to amplify 84 kenaf germplasm resources introduced and preserved from home
and abroad. Totally 230 bands were produced, the average number of DNA bands amplified by each primer was 11.5, and the
number of polymorphic DNA bands was 185. The polymorphic proportion of DNA bands was 80.43%, which indicated the abun-
dant genetic diversity of kenaf germplasm resources preserved. Based on the DNA bands amplified from 84 kenaf germplasm
resources, the Excel data base for PCR amplified bands of the kenaf germplasm resources was established. According to the prin-
ciple of uniqueness of the fingerprintings, the DNA fingerprints of 82 kenaf germplasm were constructed with five ISSR primers
(UBC813, UBC825, UBC836, UBC888, and UBC889) selected from 20 polymorphic primers, using the analyzing software de-
signed by our laboratory programmed and based on image manipulation. The fingerprintings provide a basis of the molecular
identification of kenaf germplasm resources. In this research, the DNA fingerprintings system was proved to be feasible and reli-
able.
Keywords: Kenaf (Hibiscus cannabinus L.); Germplasm resource; DNA; ISSR; Fingerprinting
红麻(Hibiscus cannabinus L.)是锦葵科(Malvaceae)木
槿属(Hibiscus)一年生韧皮纤维作物，具有生长速度快、
抗逆性强、适应性广、丰产性高等生物学特性, 其纤维还
具有吸水、散水快和抑菌、抗菌等功效。红麻以其巨大的
第 6期 汪 斌等: 应用 ISSR分子标记绘制红麻种质资源 DNA指纹图谱 1117
生物产量(为树木的 3~5倍)、极强的二氧化碳吸收能力(为
树木的 4~5 倍)以及品质可与针叶林木相媲美等突出优点
而倍受关注[1]。建国以来，我国十分重视麻类种质资源的
搜集、鉴定与利用研究，并取得了系列成果[2-4]。Howard
等[5]曾根据叶型、茎色、叶柄色、株型和花瓣色等性状, 将
红麻划分为 5个变种(Simplex、Viridis、Ruber、Purpureus
和 Vulgaris)和不同类型。虽然评价指标和性状有一定变动,
但这一评价、鉴定及分类方法一直沿用至今[6]。关于红麻
与近缘种亲缘关系的研究, Menzel 等[7]根据染色体同源性,
将红麻所在的木槿属 Furcaria组的种分成 3类, 第 3类包
含红麻 11个二倍体和四倍体种, 一般为 B和A染色体组。
1989年黄培坤等[3]对美国引进的 325份红麻及其近缘种进
行筛选鉴定, 评价出综合性状优良的品种 BG52-135 和 J-
1-113等。1991年邓丽卿等[8]对来源于不同国家和地区的
450 份红麻栽培品种及野生资源材料进行了形态分类鉴
定研究, 把我国保存的红麻种质资源分为 29个类别。2006
年李爱青等[9]从形态学和细胞学角度, 证明了红麻存在亚
种的可能性。从总体来说, 红麻种质资源的研究多为形态
学水平的，其中一些也涉及到细胞学，但在红麻种质资源
基因组 DNA水平上的系统鉴定仍显不足。
在分子标记技术发展的过程中, AFLP、RAPD、ISSR、
SRAP 和 SNP 等多种新型标记技术在多种作物或动物上
获得成功应用[10-24]。唐利华等[24]采用 ISSR标记技术对来
自全国的黑木耳 34 个主要栽培菌株进行 DNA 指纹分析,
初步构建其标准化 DNA 指纹图谱。王心宇等[25]对 ISSR
标记技术在构建多态水平很低的小麦种内指纹图谱方面
做了初步研究。发现(AG)n、(AC)n、(TG)n 等二核苷酸重
复引物类型在小麦中多态水平最高 , 能将亲缘关系很近
的品种或品系区分开。Prevost等[23]用 ISSR指纹图谱鉴别
马铃薯品种, 仅用了 4个 ISSR引物就将 30多个品种区分
开来。
近年来，红麻的分子标记研究也取得了一些进展, 利
用分子标记进行了红麻的遗传多样性研究和不育基因的
定位研究等。如郭平安等[26]利用 RAPD 标记对红麻及其
同属的近缘种进行了分析, 将 27份材料分成了 7组, 其中
红麻分成 2 组, 一组为栽培红麻, 一组为野生材料。陶爱
芬等[10]和林荔辉等[11]利用 ISSR 分子标记分析 30 份红麻
栽培品种表明我国红麻栽培品种多数遗传基础较为狭窄。
霍光等[13]利用 ISSR 分子标记分析 44 份红麻种质资源得
到了相似的结果。同时，李辉等[12]利用 ISSR分子标记对
红麻的雄性不育基因进行分析 , 筛选到一条与红麻不育
基因有关的引物 U859。本文以 ISSR 多态性谱带为基础,
用编程的基于图像处理的 DNA 指纹图谱分析软件, 绘制
出 82个红麻种质资源的 DNA指纹图谱, 为红麻种质资源
的分子身份证构建奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 供试材料
从我国保存的红麻种质资源和现代育成的品种中选
取 84 份, 其中包括从美国、古巴、澳大利亚、非洲等 22
个国家和地区引进的栽培品种 23 份, 野生及半野生类型
21份, 我国“八五”至“十五”期间由中国农业科学院麻类研
究所、福建农林大学、广东省农业科学院等单位选育的红
麻新品种 40 份。全部供试材料(表 1)于 2005 年种植于福
建农林大学试验大田。
1.2 红麻基因组 DNA的提取和纯化
在幼苗期, 采用本研究室改良的 CTAB 法提取红麻
幼嫩叶片的基因组 DNA, 用 1%琼脂糖凝胶电泳检测。然
后对所提取的红麻 DNA进行纯化[10,27]。
1.3 多态性 ISSR引物筛选及参试材料的 ISSR分析
以福红 2号、福红 952、福引 0-16-1、福红 7号、福
红 992 和闽红 964 的基因组 DNA 为模板, 对 UBC087~
UBC890等 80个 ISSR引物进行多态性筛选, ISSR引物购
自上海生工生物技术有限公司。在冰上建立 25 L 的
ISSR-PCR反应体系(表 2)。ISSR-PCR扩增程序为 94℃预
变性 5 min; 94℃ 45 s, 50℃ 1.5 min, 72℃ 1.5 min, 36个循
环; 72℃ 10 min; 10℃保存。退火温度因扩增产物的效果
而调整。PCR产物经 1%的琼脂糖凝胶电泳分离, EB染色
检测。然后利用上面 6 个红麻材料筛选出的多态性 ISSR
引物, 对 84份红麻材料进行标记分析, 获得扩增谱带。
1.4 红麻 DNA指纹图谱的绘制
对于 84个红麻材料的 ISSR扩增谱带, 只分析清晰可
辨的电泳条带。对于每条 ISSR 引物的扩增产物, 按照扩
增条带的分子量从大到小编号和读取。以扩增条带出现为
“1”, 不出现为“0”, 把图形资料转换成数字资料。将每个
ISSR 引物对 84 份红麻种质资源的扩增结果记录为一张
Excel表格。将每个 Excel表格中的 0、1序列数据阵导入
计算机程序, 进行运算分析, 找出其中唯一的特征值, 每
个特征值所对应的物种号即为此引物所能扩增出的具有
特异性谱带的品种。分别对多个 ISSR引物的扩增结果进
行运算, 直到将所有材料分开为止, 从而构建出供试 84
个红麻种质资源的 DNA指纹图谱。
2 结果与分析
2.1 供试材料 DNA提取与多态性 ISSR引物筛选
采用本实验室已建立的红麻总 DNA 提取的改良
CTAB 法与 ISSR 扩增技术优化体系[27], 以福红 2 号、福
红 952、福引 0-16-1、福红 7号、福红 992和闽红 964的
基因组 DNA 为模板, 对 UBC087~UBC890 等 80 个 ISSR
引物进行多态性筛选 , 采用 1%的琼脂糖凝胶电泳分离
ISSR的 PCR扩增产物, 共选出 20个多态性较理想的 ISSR
引物(表 3)。
2.2 多态性引物对供试材料的 ISSR分析
利用筛选出的 20 条多态性引物对 84 份红麻种质资
源进行 ISSR分析, 图 1为引物 UBC825对 84个红麻材料
的扩增结果。由图中可以看出, 84个红麻材料的 ISSR-PCR
1118 作 物 学 报 第 37卷
表 1 供试 84份红麻种质资源名称、来源及类型
Table 1 Varieties, origins, and types of 84 kenaf germplasm resources in the experiment
编号
No.
材料名称
Name
来源
Origin
类型
Type
编号
No.
材料名称
Name
来源
Origin
类型
Type
1 福红 2-1 Fuhong 2-1 FAFU, China Cultivar 43 H305 IBFC, CAAS, China Cultivar
2 福红 2号 Fuhong 2 FAFU, China Cultivar 44 Bg52-1 Mali Cultivar
3 福红 3号 Fuhong 3 FAFU, China Cultivar 45 743 GAAS, China Cultivar
4 福红 4号 Fuhong 4 FAFU, China Cultivar 46 粤引 1号 Yueyin 1 GAAS, China Cultivar
5 福红 5号 Fuhong 5 FAFU, China Cultivar 47 粤引 4号 Yueyin 4 GAAS, China Cultivar
6 福红 6号 Fuhong 6 FAFU, China Cultivar 48 非洲裂叶 Africa cleft leaf Africa Cultivar
7 福红 7号 Fuhong 7 FAFU, China Cultivar 49 金山无刺(早)
Jinshanwuci (early)
FAFU, China Cultivar
8 福红 8号 Fuhong 8 FAFU, China Cultivar 50 金山无刺(晚)
Jinshanwuci (late)
FAFU, China Cultivar
9 福红 9号 Fuhong 9 FAFU, China Cultivar 51 泰红 763 Taihong 763 Thailand Cultivar
10 福红 951(红) Fuhong 951(red) FAFU, China Cultivar 52 古巴 8号 Cuba 8 Cuba Cultivar
11 福红 952(绿) Fuhong 952(green) FAFU, China Cultivar 53 83-20 America Cultivar
12 福红 991(红) Fuhong 991(red) FAFU, China Cultivar 54 85-15 Poland Cultivar
13 福红 992(绿) Fuhong 992(green) FAFU, China Cultivar 55 F65 France Cultivar
14 福红 02/9 Fuhong 02/9 FAFU, China Cultivar 56 AS-277 Australia Cultivar
15 福引 0-16-1 Fuyin 0-16-1 FAFU, China Cultivar 57 AS233 Australia Cultivar
16 闽红 88/31 Minhong 88/31 FAAS, China Cultivar 58 阿联红麻 Alianhongma Egypt Cultivar
17 闽红 321 Minhong 321 FAAS, China Cultivar 59 ZF78 South Africa Cultivar
18 闽红 964 Minhong 964 FAAS, China Cultivar 60 85-135 Philippines Cultivar
19 H318 IBFC, CAAS, China Cultivar 61 PA264 Pakistan Cultivar
20 H316 IBFC, CAAS, China Cultivar 62 85-13 Sudan Cultivar
21 LC0301 IBFC, CAAS, China Cultivar 63 H029 Kenya Wildspecies
22 福红 992 Fuhong 992 FAFU, China Cultivar 64 H038 Kenya Wildspecies
23 福红 9913 Fuhong 9913 FAFU, China Cultivar 65 H060 Tanzania Wildspecies
24 ZH-01 ZAAS, China Cultivar 66 H070 Tanzania Wildspecies
25 K03-2 GXU, China Cultivar 67 H076 Tanzania Wildspecies
26 中红麻 4号 Zhonghongma 4 IBFC, CAAS, China Cultivar 68 H094 Tanzania Wildspecies
27 青皮 3号 Qingpi 3 Viet Nam Cultivar 69 H098 Tanzania Wildspecies
28 02/11(绿) 02/11(green) FAFU, China Cultivar 70 H102 Tanzania Wildspecies
29 02/12(无刺) 02/12(no thorn) FAFU, China Cultivar 71 塔什干 Tashigan Soviet Cultivar
30 02/29(绿) 02/29(green) FAFU, China Cultivar 72 GA42 Ghana Half wildspecies
31 02/31(红) 02/31(red) FAFU, China Cultivar 73 ZB90 Zambia Half wildspecies
32 02/51(绿) 02/51(green) FAFU, China Cultivar 74 IDN147 Indonesia Half wildspecies
33 KB11 IBFC, CAAS, China Cultivar 75 85-244 Kenya Half wildspecies
34 KB2 IBFC, CAAS, China Cultivar 76 SL-254 Salvador Half wildspecies
35 SCS11-04 Germany Cultivar 77 ZM412 Zimbabwe Half wildspecies
36 SCS11-06-1 Germany Cultivar 78 NA414 Nigeria Half wildspecies
37 SCS11-09 Germany Cultivar 79 85-132 Sudan Half wildspecies
38 C2032 Cuba Cultivar 80 MX247 Mexico Half wildspecies
39 EV-41 America Cultivar 81 ZB324 Zambia Half wildspecies
40 红引 135 Hongyin 135 IBFC, CAAS, China Cultivar 82 SD124 Sudan Half wildspecies
41 83-6 Pakistan Cultivar 83 UG93 Uganda Half wildspecies
42 83-7 Pakistan Cultivar 84 H118 Tanzania Wildspecies
FAFU: 福建农林大学; FAAS: 福建省农业科学院; IBFC, CAAS: 中国农业科学院麻类研究所; ZAAS: 浙江省农业科学院; GXU: 广西大
学; GAAS: 广东省农业科学院。
FAFU: Fujian Agriculture and Forestry University; FAAS: Fujian Academy of Agricultural Sciences; IBFC, CAAS: Institute of Bast Fiber Crops,
Chinese Academy of Agricultural Sciences; ZAAS: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences; GXU: Guangxi University; GAAS: Guangdong
Academy of Agricultural Sciences.
第 6期 汪 斌等: 应用 ISSR分子标记绘制红麻种质资源 DNA指纹图谱 1119
表 2 ISSR-PCR反应体系
Table 2 ISSR-PCR reaction system
反应体系
Reaction system
所加的量
Amount added (μL)
终浓度
Final concentration
Primer pair (4 μmol L–1) 4.000 0.64 μmol L–1
10×buffer 2.500 1×buffer
Mg2+ (25 mmol L–1) 2.500 2.5 mmol L–1
dNTPs (10 mmol L–1) 0.375 150 μmol L–1
Taq (5 U μL–1) 0.300 0.06 U μL–1
DNA (20 ng μL–1) 2.000 1.6 ng μL–1
Sterile water 13.325
扩增条带比较清晰 , 可将不同红麻材料相互区分。对于
ISSR扩增谱带, 只分析清晰可辨的电泳条带。结果表明，
20条多态性 ISSR引物，共扩增出 230条谱带, 平均每个
引物扩增出 11.5条谱带, 其中多态性谱带 185条, 多态性
条带比率为 80.43%, 表明供试的红麻种质资源遗传多样
性较丰富。每个 ISSR 引物对 84 份红麻种质资源的扩增
结果记录为一张 Excel表格, 共建立了 20张 Excel表格。
2.3 特征谱带的筛选分析
用我校自行开发的 DNA指纹数据分析器, 依次读入
20 条 ISSR 引物扩增结果对应的 Excel 表格数据, 对每个
引物将 84份红麻种质资源的 PCR扩增谱带转换成的 0、
1数据进行分析, 找出其中对应引物 PCR扩增唯一性的特
异性谱带。如图 2为对引物 UBC825的扩增谱带数据进行
特征值分析的结果截图。在筛选出的 20 个 ISSR 多态性
引物中, 每个多态性引物分别能扩增出 7~23 条多态性条
带, 不同引物能够区分的红麻种质资源数不同, 其范围在
3~66之间。如引物UBC825能扩增出 17条多态性条带, 并
且可以区分出 66个品种(图 2); 引物 UBC836能扩增出 11
条多态性条带, 并且可以区分出 37个品种。
表 3 20个 ISSR引物的编号及序列
Table 3 Serial numbers and sequences of 20 ISSR primers
引物编号
Primer number
引物序列
Primer sequence (5′–3′)
引物编号
Primer number
引物序列
Primer sequence (5′–3′)
UBC 813 CTCTCTCTCTCTCTCTT UBC 850 GTGTGTGTGTGTGTGTYC
UBC 814 CTCTCTCTCTCTCTCTA UBC 856 ACACACACACACACACYA
UBC 815 CTCTCTCTCTCTCTCTG UBC 864 ATGATGATGATGATGATG
UBC 816 CACACACACACACACAT UBC 868 GAAGAAGAAGAAGAAGAA
UBC 825 ACACACACACACACACT UBC 873 CACAGACAGACAGACA
UBC 827 ACACACACACACACACG UBC 881 GGGTGGGGTGGGGTG
UBC 828 TGTGTGTGTGTGTGTGA UBC 885 BHBGAGAGAGAGAGAGA
UBC 829 TGTGTGTGTGTGTGTGC UBC 888 BDBCACACACACACACA
UBC 835 AGAGAGAGAGAGAGAGYC UBC 889 DBDACACACACACACAC
UBC 836 AGAGAGAGAGAGAGAGYA UBC 890 VHVGTGTGTGTGTGTGT
图 1 84个红麻材料用 UBC825引物扩增结果
Fig. 1 Amplification results of primer UBC825 in 84 kenaf germplsm resources
M: 标准 DNA分子量 marker, 图片上边数字为 84个红麻种质资源编号。
M: DNA molecular weight ladder. The number above is serial number of 84 kenaf germplsm resources.
1120 作 物 学 报 第 37卷
图 2 引物 UBC 825扩增谱带筛选绘制的部分结果图
Fig. 2 Screening results of amplified bands of primer UBC 825
图中黑色长方形代表红麻材料在对应的 ISSR引物有扩增条带, 上边物 n代表第 n个供试红麻种质材料(表 1编号), 引 1代表此次分析的引物。
The black rectangles in the figure indicate that there are amplified bands of the kenaf germplsm resources on the site. Material n on the top of the
figure represents the No.n kenaf germplsm resources (Fig.1 numbers). Primer 1 represents the screening analysis primer in this experiment.
2.4 82个红麻种质资源的 DNA指纹图谱
综合考虑扩增产物多态性条带的数量和所能区分的
品种数目, 最后我们选用 UBC825(以 P1 代表, 下同)、
UBC836(P2)、UBC813(P3)、UBC888(P4)和 UBC889(P5) 5
个引物, 建立了 82个红麻种质资源基因组的 DNA指纹图
谱。构建 DNA 指纹图谱的 5 个 ISSR 引物的有关信息见
表 4。
表 4 红麻 DNA指纹图谱构建所用 5个 ISSR引物的退火温度、多
态性条带数和区分材料数
Table 4 Anneal temperature, polymorphic bands number and
distinguished germplasms of five ISSR primers used for establish-
ment of kenaf DNA fingerprinting
引物编号
Primer
number
退火温度
Anneal tem-
perature (℃)
多态性条带数
Polymorphic
bands number
区分材料数
Distinguished
germplasms
UBC825 51.5 17 66
UBC836 51.0 11 37
UBC813 50.0 9 10
UBC888 52.5 15 18
UBC889 53.0 7 3
图 3所示为利用 UBC825等 5个引物构建的 82个红
麻种质资源的 DNA指纹唯一性图谱。但是用此 5个引物
对于福红 3号和福红 9号还无法鉴别, 经查其系谱, 福红
9 号系从福红 3 号中单株选择的株选后代, 在遗传基础上
没有明显差异。图中共包含 5个引物的指纹图谱, 如果采
用上对齐方式 , 则会将不同引物的相同编号的条带误为
一致。故本图采用下对齐的方式进行构图, 以示不同引物
之区别。
3 讨论
自 1984年开发出 DNA指纹(DNA fingerprint)图谱技
术后，就显示出巨大的应用价值, 1985年先后在移民身份
确定、罪犯身份确定中使用[28]。在大田作物上, 科学准确
地鉴别农作物品种及种质资源材料的遗传特异性 , 对种
子质量鉴定、遗传资源评价、品种权益保护等均具重要现
实意义。近年来 DNA分子标记的不断发掘和检测技术的
渐趋完善, 使从 DNA 水平上对品种的遗传特异性进行快
速、准确、不受环境条件影响的鉴定成为可能[29]。目前
所育成的一些红麻品种间在形态性状标记上的差异较难
区别, 而 DNA分子标记在 DNA指纹鉴定、品种保护及亲
缘关系分析科学性方面显得尤为重要。
DNA指纹图谱很多是基于具有特异引物的微卫星标
记(microsatellite 或 SSR)来构建, 如小麦[29]、水稻[30]、玉
米[31]等。这是因为特异引物拥有一些非特异引物所没有
的优点, 如扩增产物的特异性, 重现性(稳定性)等, 尤其
是微卫星标记的多态性比较高。红麻的分子标记起步较晚,
目前大多数分子标记都是非特异引物标记, 如 ISSR[10-11]、
RAPD[26]、SRAP[32]等。然而基于非特异引物的分子标记
也是可以构建 DNA指纹图谱的[33-34]。若利用非特异引物
(如 ISSR)构建红麻的 DNA指纹图谱, 则要求所用的 ISSR
标记具备特异性、稳定性和多态性等。为了满足这些条件，
红麻的 ISSR标记体系则需要摸索和完善，诸如红麻基因
组 DNA的质量、PCR反应体系和程序、电泳分离参数等
都必须标准化[27]。
利用分子标记进行 DNA 指纹鉴定或构建 DNA 指纹
图谱，遵循的原则之一是利用尽量少的标记分开尽量多的
品种, 以降低成本和提高检测效率, 这就要求所用的标记
多态性要好。本研究中所筛选出的多数的 ISSR引物能产
生高强带, 较少有重叠。ISSR 在不同品种间扩增效果存
在较大差异 , 不同引物和品种的组合中 , 最高可扩增出
11 条带, 最低的只扩增出 4 条带。筛选出的 20 个 ISSR
引物对 84份红麻材料进行 PCR扩增, 共扩增出 230条带,
平均每个引物扩增出 11.5 条, 其中多态性条带共 185 条,
第 6期 汪 斌等: 应用 ISSR分子标记绘制红麻种质资源 DNA指纹图谱 1121
图 3 82份红麻供试材料基因组 DNA指纹图谱标准模式图
Fig. 3 Standard mode image of genome DNA fingerprintings of 82 kenaf germplsm resources for experiment
图中黑色长方形代表该红麻材料的该 ISSR引物在这个位置有扩增条带, 上边标注的 x-Py中, x代表供试红麻种质材料(表 1编号), Py代表不
同的引物, 其中 P1: UBC825, P2: UBC836, P3: UBC813, P4: UBC888, P5: UBC889。
The black rectangles in the figure indicate that there are amplified bands of the kenaf germplsm resources on the site. In the annotation x-Py on the
upper part of the figure, x represents different kenaf germplsm resources (Fig.1 numbers), and Py represents the different primers in this experiment.
P1: UBC825, P2: UBC836, P3: UBC813, P4: UBC888, P5: UBC889.
占总数的 80.43%。尤其是引物 UBC825能扩增出 17条多
态性条带, 并且可以区分出 66 个品种。由此可见, ISSR
技术能够提供基因组 DNA 丰富的信息, 是红麻种质资源
研究中快速、可靠、有效的新技术。但是 ISSR标记毕竟
利用的是非特异引物, 其扩增条带的稳定性还是相对的。
为了实现最终的准确、稳定的红麻 DNA指纹图谱的构建,
1122 作 物 学 报 第 37卷
在今后进一步研究上可考虑将 ISSR标记中的多态性条带
回收、克隆和测序, 然后转化成 SCAR标记。若开发出一
定数量的特异的 SCAR 标记, 则可满足较大容量的红麻
种质资源指纹图谱绘制的需要。例如水稻的 DNA指纹鉴
定的部颁标准使用了 24对微卫星引物, 其中 12对首选引
物, 12对候选引物[30]。
唯一性是 DNA指纹图谱的终极目标。由于研究对象
的遗传背景、供试材料份数及其所选引物的多态性等因素
的影响与限制，在构建 DNA 指纹图谱过程中，往往用 1
个引物达不到唯一性这个要求。本研究用了 5个 ISSR引
物最终将 82 份红麻种质资源区分开来, 预计还可以区分
更多的种质资源。本研究的一大特色是应用我校陈惠端老
师自行开发的 DNA 指纹图谱分析软件, 能够快速准确在
供试品种中找出特异性谱带, 并解决了供试品种太多时,
肉眼难以分析的问题, 提高了准确性, 具有一定的科学性
和可靠性, 适合红麻指纹图谱分子数据库构建使用。本文
构建出的红麻 DNA指纹图谱可以在品种鉴定和知识产权
保护等方面发挥作用 , 也可以在挖掘重要功能基因方面
提供分子标记基础 , 而且也可揭示红麻种质资源的遗传
多样性和亲缘关系 , 为红麻杂交育种对亲本的利用提供
科学依据 , 为我国红麻种质资源分子数据库的建设奠定
一定的工作基础。随着红麻基础研究的不断深入, 红麻的
特异引物标记正在开发 , 其中包括多态性较高的微卫星
标记引物[35]。预计, 随着红麻微卫星标记的不断开发, 在
不久的将来用微卫星标记构建红麻的 DNA指纹图谱则会
变成现实。
致谢: 福建农林大学本科生杨开琪与张世美的无私帮助,
中国农科院麻类研究所种质资源室戴志刚助研提供部分
红麻种质资源, 特表示衷心感谢。
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