全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(10): 1794−1800 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由陕西省自然科学基金项目(SJ08-ZD04)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 闵东红, E-mail: mdh2493@nwsuaf.edu.cn
第一作者联系方式: E-mail: gdwei1973@126.com
Received(收稿日期): 2011-01-13; Accepted(接受日期): 2011-06-25; Published online(网络出版日期): 2011-07-28.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20110728.1003.019.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.01794
以流式核型分析小麦根尖细胞的有丝分裂同步化过程
郭东伟 1 张仁和 1 李春莲 1 陈耀锋 1 闵东红 1,* 陈 明 2 李连成 2
徐兆师 2 马有志 2
1西北农林科技大学农学院, 陕西杨凌 712100; 2中国农业科学院作物科学研究所, 北京 100081
摘 要: 构建染色体特异文库是简化小麦基因组测序的有效途径, 而通过同步化处理提高根尖细胞有丝分裂指数,
使根尖细胞中富集高比例的中期染色体是实现染色体分选成功的前提。采用双阻断法用 50 µmol L−1 羟基脲和 100
µmol L−1 氟乐灵对普通小麦根尖细胞进行同步化处理, 然后用流式核型分析法观测各周期细胞在不同时间点上的比
例变化。结果显示, 最佳方案为羟基脲处理 10 h, 恢复 7 h, 氟乐灵处理 4 h。以此方案处理中国春小麦根尖可获得最
高的有丝分裂指数, 达 70.1%。附加冰水处理(0℃)有助于减少染色体碎片和增加流式核型的分辨率, 但对富集更多的
中期染色体没有效果。
关键词: 小麦; 有丝分裂; 同步化; 流式核型; 分选
Analyzing Synchronization Process of Mitosis Cells in Wheat Root-tip with
Flow Karyotype
GUO Dong-Wei1, ZHANG Ren-He1, LI Chun-Lian1, CHEN Yao-Feng1, MIN Dong-Hong1,*, CHEN Ming2,
LI Lian-Cheng2, XU Zhao-Shi2, and MA You-Zhi2
1 Agronomy College, Northwest A&F University, Yangling 712100, China; 2 Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences,
Beijing 100081, China
Abstract: Genomic sequencing of wheat can be simplified through constructing chromosome specific library. Synchronization of
cells is propitious to high mitosis index (MI), which results in the accumulation of metaphase chromosomes and a successful flow
sorting. In the present study, we used a double-blocked strategy in the synchronization treatment of wheat (Triticum aestivum L. cv.
Chinese Spring) root-tip cells with 50 µmol L−1 hydroxyurea (HU) and 100 µmol L−1 trifluralin. The effects of treatments were
evaluated by analyzing the dynamic proportions of cells at different stages of cell cycle. The optimal time of treatments were 10 h
for HU block, 7 h for recovery, and 4 h for trifluralin block. According to this synchronization scheme, the maximum MI was
70.1%. Additional ice water (0℃) depression was helpful for decreasing chromosome debris and rising resolution of the flow
karyotype, but had no effect on the accumulation of metaphase chromosomes in root-tip cells.
Keywords: Wheat; Mitosis; Synchronization; Flow karyotype; Flow sorting
运用流式分选技术, 分离足量、高纯度的植物
单一染色体, 进而构建染色体特异文库对于简化像
小麦这样具有复杂基因组构成的植物的基因组测序,
基因作图和基因发掘是一条很有吸引力的途径[1-3]。研
究证实, 根尖是目前制备染色体悬浮液, 实现染色体
分选的理想供体材料[4-5], 然而在大部分植物正常生
长的根尖分生组织细胞中, 处于分裂期的细胞仅仅
占整个分生区细胞的 5%~8%[6], 以这种根尖制备染
色体悬浮液进行染色体分选时, 过多的细胞碎片和
细胞核所产生的背景噪音信号会掩盖染色体信号 ,
无法用于染色体悬液的制备。因此, 在进行染色体
悬浮液的制备前, 要先进行同步化处理, 即通过低
温、DNA合成抑制剂和纺锤丝形成抑制剂等理化措
施处理根尖细胞 , 使其大部分处于有丝分裂的中
第 10期 郭东伟等: 以流式核型分析小麦根尖细胞的有丝分裂同步化过程 1795


期。以这样的根尖制备的染色体悬液才能获得以染
色体信号为主的流式核型[7]。
由于染色体流式分选对根尖细胞有丝分裂同步
化程度要求较高, 有丝分裂指数(mitosis index, MI)
需在 50%以上, 单一的处理方法很难达到这一同步
化水平[6,8-9]。1997年, Lee等[6]开创了“羟基脲(HU)+
氟乐灵+冰水”的综合处理方案, 有效推动了小麦染
色体分选的研究。HU是一种可逆性 DNA合成抑制
剂, 它能引起细胞 DNA 合成的阻断, 从而使分生区
细胞保持较高比例的 G1期和较低比例的 S期细胞。
然而该方案的确立以常规细胞学镜检为基础, 需要在
所有 3 个步骤处理完成之后才能验证处理效果; 此外,
由于不同植物基因组大小各异, 有丝分裂周期持续
的时间长短不一, 当用这种双阻断法同步化其他植
物根尖时, 需要不断反复尝试后才能确定各个处理
步骤的最佳作用时间, 整个同步化方案的确立费时
费力。本文在先期研究的基础上, 通过对各个处理
阶段设时间梯度, 取样流式核型分析, 将处于不同
周期的细胞比例与处理时间相对应以确定各处理的
最佳作用时间, 并最终形成同步化方案。
1 材料与方法
1.1 植物材料及其同步化处理
以普通小麦中国春(Triticum aestivum cv. Chi-
nese Spring)为材料, 按 4个步骤同步化处理。
第 1步, 用 125 mmol L−1羟基脲(HU)处理。室
温浸种至露白, 转至铺湿滤纸的 9 cm培养皿, 25℃
避光催芽, 选主根长 1.2~1.5 cm 的种子摆放于另一
培养皿内, 加 10 mL Hoagland培养液(Sigma, USA)
和 50 µL HU继续培养 2~28 h; 每 2 h取 20粒种子,
在 2%多聚甲醛的 MgSO4 缓冲液 (10 mmol L−1
MgSO4·7H2O, 50 mmol L−1 KCl, 5 mmol L−1 HEPES)
中 4℃固定 20 min; 倒去固定液, 以 MgSO4缓冲液
冲洗 1 次。取根尖制备细胞核悬浮液, 以流式核型
分析确定 HU最佳作用时间。
第 2 步, 恢复处理。取上述 HU 最佳作用时间
处理的种子, 用去离子水冲洗 3 次, 重新摆放在含
10 mL Hoagland溶液的培养皿中, 25℃暗培养 7 h,
每小时取样一次, 按上述方法固定、制备悬液和流
式分析。
第 3步, 用 0.1 mmol L−1氟乐灵(trifluralin)处理。
经最佳时间恢复处理后的种子摆放于加 100 µL氟乐
灵和 10 mL Hoagland溶液的培养皿中培养 3~6 h, 每
30 min取样一次, 水洗 3次, 按上述方法固定、制备
悬液和流式分析。同时取少量种子的根尖做常规染
色体压片, 镜检有丝分裂指数。
第 4步, 冰水处理。氟乐灵处理后的种子, 以去
离子水洗 3次, 转入 50 mL离心管加满水后在 0℃冰
水混合物中放置 22 h。在 0℃条件下, 一些尚未进入
M 期的 G2 期细胞能逐步进入 M 期, 从而可以富集
更多的中期染色体, 增加细胞悬浮液中的染色体浓
度, 降低染色体悬浮液中细胞碎片的比例, 增加信
噪比和流式分辨率。处理后的根尖按上述方法进行
流式核型分析。
1.2 悬浮液的制备与流式核型分析
取固定好的种子, 截取 60 条根尖, 用 11#手术
刀片于含 1 mL分离液(10 mmol L−1 MgSO4·7H2O, 50
mmol L−1 KCl, 5 mmol L−1 HEPES, 3 mmol L−1 DTT,
0.2% Triton-X100)的培养皿中切碎根尖分生组织
(0.5 mm), 溶液连同根尖碎片转入 1.5 mL 离心管, 在
PT-100型匀浆器中 9 600×g匀浆 12 s, 然后用 118 µm
尼龙网过滤, 滤液于冰上(DAPI终浓度 2 µg mL−1)染色
30 min。流式细胞仪参数为 CV 值 1.8%~2.2%、紫外
激发、输出功率 150 mW、FH-1电压 280 V/420 V、线
性 2倍放大、流速 180~270 条 s−1。采用 CELLQuest
软件, 以 10 000 个粒子为单位获取数据, 确定各阶
段的最佳处理时间。
2 结果与分析
2.1 HU处理最佳时间
流式核型图中 G1、S 和 G2 峰所占的面积分别
代表在对照未处理根尖(图 1-A)和 HU 处理 10 h 时
(图 1-B) 3种周期细胞所占比例。将其他各处理时间
根尖不同周期细胞比例转换成柱形图如图 2 所示,
从整个处理过程看, 对照 G1、S 和 G2 期细胞的比
例在根尖生长 2~28 h内基本保持一致, 平均分别为
55.5%、20.1%和 24.5%, 而经 HU处理的各周期细胞
比例随 HU处理时间发生变化(图 2)。HU处理后, G1
细胞核从处理后 2 h 开始增加, 10 h 达到最高值
74.8%。与之相反, S 期细胞比例随处理时间延长而
逐渐下降, 在 10 h时达到最低值 1.7%; 之后 HU的
抑制作用逐渐减弱, S期细胞比例逐步增加, 但在最
初的 10~16 h内, 这种抑制减弱并不明显, S期细胞
比例变化不大, 到 16 h后才迅速增加, 直至 22 h左
右达到峰值 33.9%; 此后 DNA合成又开始回落。G1
期细胞比例在 HU处理后 20~22 h降至最低(32.4%),
1796 作 物 学 报 第 37卷



图 1 羟基脲处理 0 h(A)和 10 h(B)小麦根尖分生细胞流式核型图
Fig. 1 Flow karyotype histogram of meristematic cells in wheat root tip treated by HU for 0 h (A) and 10 h (B)



图 2 HU处理 2~28 h各时期细胞比例
Fig. 2 Proportions of cells at different stages after HU treatment (2−28 h)

之后再次增加。与 G1 和 S 期细胞峰值出现时间相
异的是G2期细胞, 其在 16~20 h维持了较高的水平,
说明 HU对 DNA合成的抑制作用不是无限期的, 当
超过 10 h时, 部分 G1细胞会冲破抑制进入 DNA合
成阶段, 使 G2 期细胞逐渐增加, 加上原有的 G2 期
细胞, 最终在 16 h达到峰值, 之后完成 DNA复制的
细胞开始进入分裂期, G2 期细胞又开始下降, 但此
时由于有更多的 G1 期细胞冲破 HU 的抑制进行
DNA 合成, 保证了 G2 期细胞能够维持在较高的水
平, 20 h后才迅速减少。到 24 h时, 各周期细胞重新
回到处理前对照的水平, 完成了一个分裂周期。分
析结果表明, HU 小麦根尖细胞 DNA 合成的最大抑
制约发生在处理后 10 h, HU处理更长时间并不能强
化这种抑制作用。
2.2 恢复处理最佳时间
HU处理 10 h后的根尖被转移至营养液中恢复
生长 1~7 h, 其流式核型(图 3)显示, 在去除 HU 后,
根尖中累积的 G1期细胞核很快进入 S期, 去除 1 h
时, G1期细胞核下降至 50%左右, 相应的 S期和 G2
期细胞分别增加至 9.3%和 41.1%(数据未显示); 随
着恢复时间的延长, 更多细胞进入合成期, 并在 3.5 h
时达到第 1次合成高峰, 随之而来的 G2期细胞则在
4~6 h维持较高的比例, S期细胞在 7 h时再次形成
一个小高峰, 并有继续增加的趋势。这说明恢复处
理的时间与前一阶段 HU 处理的强度密切相关, HU
处理 10 h 时表现出的抑制作用最大, 细胞后续进入
合成期所需要的准备时期就更长, 因此在去除HU后
需要 7 h甚至更长时间才能进入 DNA大量合成期。
第 10期 郭东伟等: 以流式核型分析小麦根尖细胞的有丝分裂同步化过程 1797




图 3 去除 HU抑制后 1~7 h内小麦根尖的各时期细胞流式核型图
Fig. 3 Flow karyotype histogram of wheat root tip after removal of HU for 1–7 h

正常生长的根尖细胞中 S 期持续约 10 h [12], 而受
HU 处理的细胞至少需要相同甚至更久的时间来完
成 DNA的合成。因此, 我们认为 HU处理 10 h后根尖
需要至少 7 h才能逐步恢复正常的 DNA合成。
2.3 氟乐灵处理最佳时间
恢复处理 7 h 之后, 根尖细胞大部分进入 S 和
G2期, 而部分早期进入 G2期的细胞开始进入 M期
(分裂), 此时经氟乐灵处理不能形成纺锤丝的细胞
停滞在中期。因此, 根尖中富集了大量中期染色体
(图 4), 由其制备的染色体悬浮液, 在 420 V、2倍线
性放大条件下, 能够形成以染色体为主要信号的流
式核型(图 5), 图中通道 100~200 处显示, 由不同大
小染色体所形成的混合染色体峰, 各处理时间点上
的根尖都能产生以染色体信号为主的流式核型, 将
处理时间点根尖常规细胞学压片, 统计有丝分裂指
数, 除 3 h略有降低外, 其余时间点上根尖有丝分裂
指数差异不大, 并始终维持在较高水平(60%以上),
其中以 3.5 h最高, 达 70.1% (图 6)。然而与有丝分
裂指数不同的是 , 各处理间核型分辨率存在差异 ,
分辨率在 3 h和 6 h上略有下降, 第 II和第 III染色
体峰难以区分, 这可能是因为开始进入分裂期的细
胞染色体浓缩程度较小, 更不易彼此分离, 而在 6 h
染色体则可能因为过于浓缩致密, 染料不能有效进
入染色体内部; 最佳的分辨率出现在 4.0~4.5 h, 此
时除了第 II染色体峰和第 III染色体峰能够清晰分辨
外, 在通道值大约 200 处形成一个明显的小峰, 根


图 4 未同步化(A)和同步化后(B)根尖有丝分裂指数比较
Fig. 4 Comparison of mitosis index between normal (A) and
synchronization root tips (B)
Scale bars: 100 μm.

据先前的研究表明这是一条由 3B 染色体独立组成
的染色体峰(图 5), 也是现有技术和材料条件下唯一
能够被直接分拣的小麦单条染色体[2,13]。
2.4 冰水处理的效果
未经冰水处理的根尖(图 7-A)比经过冰水处理的根
尖(图7-B)在通道值 25~110产生了更多的细胞碎片, 这
是因为冰水处理后的根尖质地更脆, 切割过程中更容
易保持染色体的完整性, 因而产生的染色体碎片少,
这对以端体为分选材料的研究似乎尤为重要; 而二者
在染色体富集程度上似乎没有明显差异, 这可能是此
时的细胞大部分已进入分裂期, 冰水处理富集染色体
的最佳作用时期已过所致。在 Luo等[14]的研究中也有
类似报道。
3 讨论
根尖是目前制备悬浮液, 进行染色体分选的理
想供体材料, 根尖分生区细胞在有丝分裂的同时能
1798 作 物 学 报 第 37卷



图 5 氟乐灵处理 3~6 h后根尖 M期细胞流式核型
Fig. 5 Flow karyotype of metaphase cell in root tip treated by trifluralin for 3–6 h



图 6 氟乐灵处理不同时间的小麦根尖细胞有丝分裂指数
Fig. 6 Mitosis index of wheat root tip cells under trifluralin
treatment for different hours

保持相对稳定的核型; 而且根尖能够在实验室环境
下通过简单萌发大量获得, 易于同步化处理以富集
大量中期染色体。尽管不同的研究组在不同分选材
料的同步化处理中应用了不同的方法, 但主要是通
过抑制 DNA 合成或抑制纺锤丝合成来提高细胞的
同步化效率, 如 Mayer等[15]和 Simkova等[16]用甲基
胺草磷(APM amiprophos-methyl)辅以 HU 处理同步
化大麦和小麦根尖; Kovarova 等[17]以 HU 和黄草消
(Oryzalin)同步化蚕豆根尖细胞; Nompumelelo 等[18]
则以 12 μg mL−1蚜栖菌素(Aphidicolin)处理拟南芥
的根尖细胞进行同步化。早期研究认为, 蚜栖菌素
比 HU 能更有效阻断 DNA 的合成[19]。Lee 等[6]按
HU处理 18 h, 恢复 2 h和氟乐灵处理 4 h的方案处
理小麦根尖时也获得了高分辨率的流式核型。这可
能是因为羟基脲对 DNA 合成的抑制作用不是无限
制的, 当处理时间超过 10 h一些细胞便突破 HU的
抑制进入合成期至 16 h达到高峰, 并在 16~20 h维
持了相对高比例的 G2 期细胞, 在经历短时间(2 h)
恢复后, 即进行氟乐灵阻断, 从而使大量细胞得以维
持在 G2/M 期; 尽管以这一方案同步化小麦根尖也能
获得较高的有丝分裂指数, 但其作用并非最优。在本
研究中, 当 HU 的作用时间修订为 10 h, 并辅以后续
的 7 h恢复和 4 h氟乐灵处理时, 有丝分裂指数提高至
70.1%。而且在 7 h恢复处理后, S期细胞比例还有持
续增加的趋势, 因此, 进一步延长恢复时间可能有利
于将同步化水平提至更高程度。
在我们先前的研究中, 最佳应用浓度和时间都是
通过细胞学压片统计有丝分裂指数确定的, 由于不
同视野下, 以及根尖不同部位细胞的有丝分裂比例
差异 , 容易造成统计误差; 此外 , 对于一些多步骤
的综合处理方案, 有丝分裂指数只能在所有处理完
成之后统计, 初期处理步骤的最佳作用时间则难以
快速确定。在本研究中, 我们以单一浓度的阻断剂
处理根尖, 在流式核型分析的基础上, 将处理时间
与不同周期细胞的比例对应起来, 逐步确定各处理
步骤的最佳作用时间, 最终形成一个优化了的小麦
根尖同步化方案, 阐明了各个步骤最优处理的细胞
学基础, 整个方案的确定相对简单、快速。以同样的
第 10期 郭东伟等: 以流式核型分析小麦根尖细胞的有丝分裂同步化过程 1799




图 7 未经过冰水处理(A)和经过冰水处理(B)小麦同步化根尖细胞流式核型
Fig. 7 Flow karyotype of wheat root tip treated (A) or no treated (B) by ice water

方法我们分析了黑麦同步化处理时的流式核型, 结
果表明以 HU处理 14 h、恢复 2 h、氟乐灵处理 4 h
的方案同步化黑麦根尖后, 其流式核型远端的一个小
染色体峰能够被直接分离(图 8), 可能是 2R 染色体,
与 Simkova 等[20]的报道一致。至于如何用更高或更
低浓度阻断剂提高小麦根尖的有丝分裂指数则需要
进一步的研究确定。但我们观察到高浓度(200 μmol
L−1)或长时间(14 h)氟乐灵处理小麦根尖易导致细胞
微管结构的畸变, 细胞不能正常生长, 根尖端部产
生明显的肿胀不利于高质量染色体悬浮液的制备。




图 8 同步化处理后黑麦根尖细胞流式核型图
Fig. 8 Flow karyotype of synchronized cells in rye root-tip
4 结论
以流式核型分析为基础可以简便、快速地确定
根尖同步化处理方案。一种优化的同步化方案为 :
HU处理 10 h、恢复 7 h和氟乐灵处理 4 h, 按此顺序
处理中国春小麦的根尖可获得高达 70.1%的有丝分
裂指数和高分辨率的流式核型。
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