全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2009, 35(11): 20642072 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家自然科学基金项目 (30771346), 天津市科委重点项目(08JCZDJC16500), 天津市教委重点项目(2006ZD08)资助。
*
通讯作者(Corresponding authors): 王振英, E-mail: wzycell@yahoo.com.cn; 彭永康, E-mail: pykcell@yahoo.com.cn
Received(收稿日期): 2009-02-12; Accepted(接受日期): 2009-05-08.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2009.02064
栽培小麦 Brock和京 411感染白粉菌后蛋白质组的变化
于 振 1 李 倩 1 赵建叶 1 江 帆 1 王振英 1,* 彭永康 1,* 解超杰 2
刘志勇 2 孙其信 2 杨作民 2
1天津师范大学化学与生命科学学院 / 细胞遗传与分子调控天津市重点实验室, 天津 300387; 2中国农业大学农学与生物技术学院,
北京 100193
摘 要: 用华北地区流行的白粉菌 15号生理小种, 感染强抗白粉病的栽培小麦 Brock和对白粉病敏感的小麦京 411,
通过蛋白质组技术分析其差异蛋白。结果表明, Brock经白粉菌感染 12 h后, 至少有 6个蛋白质斑点(43 kD/pI 6.7、
43 kD/pI 6.9、43 kD/pI 7.2、28 kD/pI 5.8、26 kD/pI 5.5和 26 kD/pI 6.5)表达量明显增加；感染 3 d后, 有 5个蛋白质
斑点(48 kD/pI 5.6、43 kD/pI 6.9、43 kD/pI7.2、28 kD/pI5.8和 26 kD/pI5.5)表达量增加；感染 5 d后, 有 12个新的蛋
白质斑点(16 kD/pI 7.6、42 kD/pI 6.5、40 kD/pI 4.8、40 kD/pI 4.6、31 kD/pI 5.7、16 kD/pI 4.6、20 kD/pI 8.3、50 kD/pI
6.7、48 kD/pI 6.6、28 kD/pI 5.7、23 kD/pI 4.8和 25 kD/pI 4.7 )被诱导合成, 2种蛋白质斑点(26 kD/pI 4.6和 17 kD/pI 7.9)
消失。京 411经白粉菌感染 12 h后, 3个蛋白质斑点(21 kD/pI 6.4、18 kD/pI 5.4和 14 kD/pI 7.0)表达量增加；感染 3 d
后, 有 2个蛋白质斑点(80 kD/pI 5.4和 14 kD/pI 7.0)表达量增加, 1个蛋白质斑点(16 kD/pI 5.4)表达量下降；感染 5 d
后, 有 3个蛋白质斑点(50 kD/pI 7.3、40 kD/pI 7.3和 24 kD/pI 7.2)表达量增加, 2个斑点(40 kD/pI 4.8和 14 kD/pI 7.2)
表达量下降, 但没有发现新的蛋白质合成。对 Brock 中诱导产生的 12 个新蛋白质斑点, 利用 MALDI-TOF-MS 方法,
于 NCBI进行数据查询, 其中有 6个分别属于 F-box亮氨酸高度重复蛋白、重金属转运/解毒蛋白、β-1,3-葡聚糖酶(两
个同工体)、β-1,3-葡聚糖酶前体、锌指蛋白。功能查询表明, 上述 6个蛋白参与细胞周期调控、发育、激素响应、基
因转录和病害防御等。推测 Brock 和京 411 感染白粉菌后, 出现的蛋白质组变化可能与各自的抗、感白粉病特性
有关。
关键词: 白粉病；小麦；蛋白质组；β-1,3-葡聚糖酶；MALDI-TOF-MS
Proteome Changes in Wheat Varieties Brock and Jing 411 after Inoculating
Blumenia graminis
YU Zhen1, LI Qian1, ZHAO Jian-Ye1, JIANG Fan1, WANG Zhen-Ying1,*, PENG Yong-Kang1,*, XIE
Chao-Jie2, LIU Zhi-Yong2, SUN Qi-Xin2, and YANG Zuo-Min2
1 College of Chemistry and Life Science / Tianjin Key Laboratory of Cyto-Genetical and Molecular Regulation, Tianjin Normal University, Tianjin
300387, China; 2 College of Agronomy and Biotechnology, China Agricultural University, Beijing 100193, China
Abstract: The protein of resistant wheat (Triticum aestivum L.) variety Brock and susceptible variety Jing 411 was extracted from
leaves and separated using two-dimensional polyacrylamid gel electrophoresis (2-DE) at 12 h, 3 d, and 5 d after inoculating
prevalent race No. 15 of B. graminis f. sp. tritici. In Brock, compared with control with no pathogen inoculation, at least six pro-
tein spots of 43 kD/pI 6.7, 43 kD/pI 6.9, 43 kD/pI 7.2, 28 kD/pI 5.8, 26 kD/pI 5.5 and 26 kD/pI 6.5 obviously increased in content
at 12 h time point; and five protein spots of 48 kD/pI 5.6, 43 kD/pI 6.9, 43 kD/pI 7.2, 28 kD/pI 5.8 and 26 kD/pI 5.5 increased in
content at 3 d time point. At 5d after inoculation, 12 novel proteins were induced, viz. 16 kD/pI 7.6, 42 kD/pI 6.5, 40 kD/pI 4.8, 40
kD/pI 4.6, 31 kD/pI 5.7, 16 kD/pI 4.6, 20 kD/pI 8.3, 50 kD/pI 6.7, 48 kD/pI 6.6, 28 kD/pI 5.7, 23 kD/pI 4.8 and 25 kD/pI 4.7;
simultaneously, two protein spots that were observed earlier disappeared. In Jing 411, three protein spots of 21 kD/pI 6.4, 18
kD/pI 5.4, and 14 kD/pI 7.0 increased in content at 12 h after inoculation. At the 3 d time point, two protein spots of 80 kD/pI 5.4
and 14 kD/pI 7.0 increased in content, however, one protein spot (16 kD/pI 5.4) showed decrease in protein abundance. At the 5 d
time point, three protein spots of 50 kD/pI 7.3, 40 kD/pI 7.3, and 24 kD/pI 7.2 and two protein spots of 40 kD/pI 4.8 and 14 kD/pI
第 11期 于 振等: 栽培小麦 Brock和京 411感染白粉菌后蛋白质组的变化 2065
7.2 showed increase and decrease in protein abundance, respectively, but there were no novel protein spots induced. Among the 12
novel protein spots induced in Brock, six spots were identified using MALDI-TOF-MS and NCBI database searching, which were
F-box and leucine-rich repeat protein, heavy metal transport/detoxification protein, endo-beta-1,3-glucanase (two isozymes),
beta-1,3-glucanase precursor and zinc finger protein. These proteins are involved in a wide range of physiological processes, such
as cell cycle control, development, phytohormone response, and resistance to fungal disease. Thus, the proteome changes in Brock
and Jing 411 leaves are probably associated with the resistance and susceptibility to powder mildew, respectively.
Keywords: Powdery mildew; Wheat; Proteome; Beta-1,3-glucanase; MALDI-TOF-MS
由白粉菌[Blumenia graminis (DC.) Speer f. sp.
tritici]引起的小麦白粉病近年来已上升为小麦的主
要病害之一, 可造成小麦的大面积减产[1]。对小麦白
粉病抗病机制已开展了很多研究, 尤其在抗病基因
的定位 [2]和克隆 [3-4], 以及抗病基因的分子标记筛
选[5-7]等领域。但是由于白粉菌新生理小种不断出现,
部分抗病基因相继丧失抗性, 单纯依靠发掘和利用
抗病基因来控制小麦白粉病存在一定的局限性。抗
病基因如何调控抗病特性愈来愈受关注, 因此, 在
蛋白质组水平分析基因表达产物有助于深入了解小
麦抗白粉病机制。
蛋白质组研究是近 10 年发展起来的一种分子
生物学研究方法, 它可以在整体水平上研究细胞内
蛋白质的组成及其活动规律, 能够更直接与基因功
能相关联 , 揭示生命活动的规律和本质 , 因此 , 已
广泛应用于作物生长发育机制和逆境响应研究, 如
细胞质雄性不育机制 [8], 生长与发育机制 [9-10], 低
温、盐、干旱、水分、除草剂、病害等环境胁迫响
应等[11-16]。利用蛋白质组技术研究作物病害亦有报
道, 如 Sun等[17] 研究水稻感染稻瘟病后蛋白质组的
变化, 发现有 8个蛋白质斑点被诱导或表达量增加；
Curto 等 [18]发现豌豆感染白粉病后, 在对白粉病具
抗性和敏感性的豌豆叶片中, 产生蛋白质含量或质
量(诱导产生新蛋白)的变化；Wang等[19]发现小麦感
染赤霉病后, 叶片中有 30个蛋白质斑点产生含量上
的变化；封德顺等 [20]对高感白粉病的小麦品种
Chancellor及其表现白粉病免疫的 Pm3b近等基因系
在接种白粉病菌前后的蛋白质组变化进行了研究 ,
发现抗病性与病菌诱导一些抗性蛋白大量表达
有关。
Brock 是一种强抗白粉病的小麦栽培种, 由中
国农业大学作为抗病遗传资源从英国引进。经鉴定,
Brock 携带的 Pm2 基因已丧失白粉病抗性, 但发现
其带有一个新的抗白粉病基因, 位于 3BL 上[21]。本
研究以 Brock和对白粉菌高度敏感的京 411为材料,
利用蛋白质组技术对感染白粉菌后, 抗、感白粉病
品种不同时间点叶片中蛋白质组变化以及这些变化
的蛋白质的归属、生理功能、与 Brock 中抗白粉病
新基因间可能存在的关系进行了比较分析, 为揭示
小麦抗白粉病机制及 Brock 抗病资源在生产上可能
的利用提供一些帮助。
1 材料与方法
1.1 植物材料和白粉菌菌株
栽培小麦 Brock 引自英国, 强抗白粉病；栽培
小麦京 411, 对白粉菌敏感。白粉菌为华北地区流行
的优势种 15号生理小种。
1.2 病菌接种和诱导发病
栽培小麦 Brock和京 411种子经 0.1% HgCl2表
面消毒 5 min, 自来水冲洗 2次, 再在带有湿润滤纸
的培养皿中室温下萌发 24 h, 然后将萌动种子移入
土中培养, 每天给予适当的水分。当两种小麦生长
至三叶期时, 将其分别分为对照组和接种组。用毛
笔将培养在感病品种京 411 上生长旺盛的白粉菌涂
抹到接种组叶片上, 并在接种后 12 h、3 d 和 5 d
取样。
1.3 取样及蛋白质制备
取叶片 0.1 g, 用去离子水洗净, 滤纸吸干, 参
照 Curto等[18]的方法分离蛋白质, 用 10% TCA-丙酮
溶液(含 0.07% β-巯基乙醇)提取叶片全蛋白, 用裂
解液[9.5 mol L1脲, 2% NP40, 1.6% Ampholine (pH
5~7), 0.4% Ampholine (pH 3~10), 5% β-巯基乙醇]对
其进行裂解, 按 Bradford[22]的方法测蛋白质浓度。
1.4 双向电泳
第一向等电聚焦(IEF, isoelectric focusing)参照
O’Farrell[23]的方法。凝胶浓度为 3%, 含 9 mol L1
尿素, 2% NP40 40 L, 30%聚丙烯酰胺凝胶 340 mL,
pH 3~10 两性电解质 30 L, pH 5~7 两性电解质
60 L, 双蒸水 1.09 mL, 四甲基乙烯二胺 2 L, 过
硫酸胺 10 L。将制成的第一向凝胶溶液用注射器注
入凝胶管(120 mm 2 mm), 静置 5 h后进行预聚焦
(200 V 15 min, 300 V 30 min, 400 V 90 min), 其后,
每管加样 60 L, 进行等电聚焦(400 V 14~16 h)。等
电聚焦结束后 , 用注射器将胶条从凝胶管内脱出 ,
2066 作 物 学 报 第 35卷
放入平衡液(0.06 mol L1 Tris-HCl, pH 6.8, 5% -巯
基乙醇, 10%甘油, 2% SDS)平衡 20 min。电泳的第二
向用 12.5%的聚丙烯酰胺凝胶[24], 3次重复, 凝胶经
考马斯亮蓝[25]染色。
1.5 MALDI-TOF MS分析
用 GS800 色谱扫描仪获得双向电泳胶扫描图像,
用 PDQuest 软件进行斑点检测、匹配和差异斑点鉴
别 , 确定对照和处理组之间有差异的蛋白质斑点 ,
进行质谱分析。
从制备胶上切下经鉴别有差异的蛋白质斑点 ,
用超纯水冲洗 2次, 50 mmol L1 NH4HCO3脱色 2次,
100%乙腈干燥后, 再用 0.1% TFA在 50% 乙腈溶液
37℃下消化过夜。将制备物混匀, 冻干。将冻干的制
备物溶解在含有 0.1% TFA和 50%乙腈的 5 mg mL1
CHCA 中, 利用 ABI 4700 型(USA)正离子生物质谱
仪进行MALDI-TOF MS分析, 以胰蛋白酶自动降解
片段为内部标准校正。通过MASCOT软件, 在NCBI
数据库进行查询。为了确保蛋白质鉴定的可靠性 ,
每个被鉴定的蛋白质序列覆盖率至少达 15%, 最少
肽数目为 5 个, 肽质量数误差范围为±1 Da, 未水解
的酶切位点数为 1, 对照物种为水稻和拟南芥。
2 结果与分析
2.1 Brock感染白粉菌后叶片蛋白质组的变化
白粉菌感染 12 h后, 至少有 6个蛋白质斑点(图
1-a, b)表达量明显增加, 分别是斑点 1, 43 kD/pI 6.7；
斑点 2, 43 kD/pI 6.9；斑点 3, 43 kD/pI 7.2；斑点 4, 28
kD/pI 5.8；斑点 5, 26 kD/pI 5.5；斑点 6, 26 kD/pI 6.5。
感染 3 d后, 除斑点 2、3、4和 5仍表现出表达量增
加外, 斑点 7 (48 kD/pI 5.6)表达量也明显增加(图 1-c,
d)。白粉菌感染 5 d 后, 诱导产生 12 个新的蛋白质
斑点, 分别是斑点 1, 16 kD/pI 7.6；斑点 2, 42 kD/pI
6.5；斑点 3, 40 kD/pI 4.8；斑点 4, 40 kD/pI 4.6；斑
点 5, 31 kD/pI 5.7；斑点 6, 16 kD/pI 4.6；斑点 7, 20
kD/pI 8.3；斑点 8, 50 kD/pI 6.7；斑点 9, 48 kD/pI 6.6；
斑点 10, 28 kD/pI 5.7；斑点 11, 23 kD/pI 4.8；斑点
12, 25 kD/pI 4.7。同时也有 2个蛋白质斑点消失, 分
别是斑点 13, 26 kD/pI 4.6；斑点 14, 17 kD/pI 7.9 (图
1-e, f)。
2.2 京 411感染白粉菌后叶片蛋白质组变化
京 411经白粉菌感染 12 h后, 3个蛋白质斑点(斑
点 1, 21 kD/pI 6.4、斑点 2, 18 kD/pI 5.4、斑点 3,
14 kD/pI 7.0)表达量增加(图 2-a, b)。感染 3 d后, 2
个蛋白质斑点(斑点 1, 80 kD/pI 5.4、斑点 3, 14 kD/pI
7.0)表达量增加, 1 个蛋白质斑点(斑点 2, 16 kD/pI
5.4)表达量下降(图 2-c, d)。当感染 5 d后, 有 3个蛋
白质斑点(斑点 1, 50 kD/pI 7.3、斑点 3, 40 kD/pI 7.3、
斑点 4, 24 kD/pI 7.2)表达量增加, 2个斑点(斑点 2, 40
kD/pI 4.8、斑点 5, 14 kD/pI 7.2)表达量下降(图 2-e, f),
但在京 411 中没有发现经白粉菌感染后有新的蛋白
质合成。
2.3 差异蛋白的肽质谱指纹图分析
对 Brock叶片中诱导产生的 12个差异蛋白进行
功能分析, 结果仅鉴别确定其中 6个(斑点 1~6)的归
属, 其可能功能包括 F-box亮氨酸高度重复蛋白、重
金属转运/解毒蛋白、β-1,3-葡聚糖酶(斑点 3、4呈两
个同工体形式)、β-1,3-葡聚糖酶前体、锌指蛋白(表
1 和图 3)。另外 6 个差异蛋白斑点因为蛋白质含量
少或因序列覆盖率低、匹配不够理想而未能鉴别。
3 讨论
本研究表明, 蛋白质组的变化与小麦抗白粉病
特性相关 , 如在对白粉病具强抗特性的 Brock 中 ,
感染白粉菌 12 h、3 d、5 d的叶子中, 有 24个蛋白
质斑点产生含量或质量(诱导产生新的蛋白)上的变
化, 尤其是在感染 5 d 的叶片中, 至少有 12 个新蛋
白质合成, 2个消失, 而在对白粉病敏感的京 411中,
感染白粉菌后, 则主要表现为蛋白质表达量上的增
加或减少。这一结果与 Curto等[18]豌豆感染白粉病、
Wang等[19]小麦感染赤霉病所得结果相类似。本试验
仅在抗病品种 Brock 中检测到新诱导的蛋白质, 推
测 Brock 在遭受白粉菌侵染后, 开启了抗性基因的
表达, 通过诱导新的蛋白质的合成或抑制某些蛋白
质的表达, 使其与环境相适应而得以生存, 而在易
感病的京 411中, 没有抗病基因的存在, 因此, 只在
蛋白质的表达量上有一定变化 , 没有新蛋白的
合成。
利用质谱技术, 鉴别了 6 种病菌诱导产生的新
蛋白质, 其中 F-box亮氨酸高度重复蛋白、重金属转
运/解毒蛋白、锌指蛋白与抗病害关系, 尤其是与抗
白粉病的关系未见报道。但这些功能与抗逆性相关,
如 F-box 亮氨酸高度重复蛋白, 可以选择性地清除
异常多肽和降解蛋白, 在细胞周期调控、发育、响
应激素和真菌病害防御中具有重要功能[26-27]；重金
属转运/解毒蛋白可以络合毒性金属, 使植株免受重
金属毒害；锌指蛋白在真核生物中可以调控基因的
第 11期 于 振等: 栽培小麦 Brock和京 411感染白粉菌后蛋白质组的变化 2067
图 1 小麦品种 Brock叶片感染白粉菌后叶片蛋白质组的变化
Fig. 1 Changes of proteome pattern in leaves of wheat variety Brock after inoculating B. graminis f. sp. tritici
a: 对照, 12 h; b: 接种处理, 12 h; c: 对照, 3 d; d: 接种处理, 3 d; e: 对照, 5 d; f: 接种处理, 5 d。
a: control, 12 h; b: inoculation treatment, 12 h; c: control, 3 d; d: inoculation treatment, 3 d; e: control, 5 d; f: inoculation treatment, 5 d.
2068 作 物 学 报 第 35卷
图 2 小麦品种京 411感染白粉菌后叶片蛋白质组变化
Fig. 2 Changes of proteome pattern in leaves of wheat variety Jing 411 after inoculating B. graminis f. sp. tritici
a: 对照, 12 h; b: 接种处理, 12 h; c: 对照, 3 d; d: 接种处理, 3 d; e: 对照, 5 d; f: 接种处理, 5 d。
a: control, 12 h; b: inoculation treatment, 12 h; c: control, 3 d; d: inoculation treatment, 3 d; e: control, 5 d; f: inoculation treatment, 5 d.
第 11期 于 振等: 栽培小麦 Brock和京 411感染白粉菌后蛋白质组的变化 2069
表 1 Brock感染白粉菌后差异蛋白的质谱鉴定
Table 1 Identification of differential proteins in Brock after inoculating B. graminis f. sp. tritici using MALDI-TOF-MS
斑点号
Code of spot
蛋白质名称
Protein name
NCBI登录号
NCBI accession number
肽段匹配数
Peptides count
蛋白质分值
Protein score
1 F-box and leucine-rich repeat protein gi|6912466 5 42.7
2 Heavy metal transport/ detoxification protein gi|170723737 3 46.2
3 Endo-beta-1,3-glucanase gi|109150348 12 151.0
4 Endo-beta-1,3-glucanase gi|109150350 10 108.0
5 Beta-1,3-glucanase precursor gi|4741846 7 89.6
6 Zinc finger protein gi|114678826 7 49.9
2070 作 物 学 报 第 35卷
第 11期 于 振等: 栽培小麦 Brock和京 411感染白粉菌后蛋白质组的变化 2071
图 3 感染白粉菌后 Brock叶片中差异蛋白的质谱分析
Fig. 3 Identification of differential proteins in Brock leaves after inoculating B. graminis f. sp. tritici using MALDI-TOF-MS
转录。另外 3 种鉴别出归属的是-1,3-葡聚糖酶(EC
3.2.1.39), 这种酶具有碱性和酸性 3 种同工酶形
式 [28], 其中碱性类型被定位于液泡内, 主要呈组成
型表达, 可以受病原菌诱导, 但表达量少。酸性类型
被定位于细胞间隙, 呈诱导型表达, 受病原菌诱导。
本试验中, 经白粉菌诱导后, 有 2 种同工体和一种
前体存在, 在不经诱导的正常植株中不存在, 被鉴
别的这 3 种酶可能是呈诱导型表达的酸性类型的
-1,3-葡聚糖酶。-1,3-葡聚糖酶参与植物体内的多
种生理生化过程, 其与植物抗病害的关系也早已被
认识[29-33], 它可以分解植物病原菌细胞壁的主要成
分-1,3-葡聚糖, 从而抑制真菌的生长与增殖。抗病
小麦品种 Brock 经白粉菌诱导产生-1,3-葡聚糖酶,
而感病的京 411则没有, 这可能是Brock抗白粉病的
部分原因。虽然-1,3-葡聚糖酶与抗病害机制的研究
已有很多, 但利用蛋白质组技术探讨其抗白粉病机
制的还未见报道。
在蛋白质组研究技术中, 为了表明被鉴别蛋白
质的可靠性 , 每个蛋白质序列覆盖率至少达 15%,
肽片段匹配数不少于 5 个, 因此本实验经白粉菌诱
导产生的新蛋白质中有 6 个没有鉴别出其归属, 也
不能确立它们与白粉病抗性的关系。但该项研究技
术的特点之一是高度依赖数据库。对于这些在数据
库中不能查询到的蛋白质, 有可能是目前尚未认识
的蛋白质。因此, 应开展氨基酸测序和同源序列比
对研究, 分析其可能的生化性质, 这样有可能揭示
这些差异蛋白与白粉病抗性的关系。由于这些新的
蛋白质仅在抗病品种 Brock 中被诱导产生, 所以推
测其与白粉病抗性有密切关系。
4 结论
利用双向电泳和MALDI-TOF MS技术, 从接种
白粉菌 5 d后的抗病品种 Brock的叶片中发现 12种
诱导蛋白, 其中 6种已鉴定功能, 涉及 F-box亮氨酸
高度重复蛋白、重金属转运/解毒蛋白、-1,3-葡聚
糖酶(斑点 3、4呈两个同工体形式)、-1,3-葡聚糖酶
前体和锌指蛋白。推测这 12种蛋白是抗病基因表达
的产物, 与品种抗白粉病有密切关系。
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