全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2009, 35(7): 1188−1193 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由河南省杰出青年基金项目(04120001400), 西北农林科技大学植保资源与病虫害治理教育部重点开放实验室资助项目, 国家“十一五”
支撑计划项目(2006BAD08A05)资助。
*
通讯作者(Corresponding authors): 刘红彦, E-mail: liuhy1219@163.com, Tel: 0371-65730166; 康振生, E-mail: kangzs@nwsuaf.edu.cn, Tel: 029-87091312
第一作者联系方式: E-mail: junmeiwang79@yeah.net
Received(收稿日期): 2009-01-07; Accepted(接受日期): 2009-03-10.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2009.01188
应用基因芯片分析红蚰麦白粉菌胁迫条件下的基因表达谱
王俊美 1,2 刘红彦 1,2,* 徐红明 1 王 飞 1 高素霞 1 康振生 2,3,*
1河南省农业科学院植物保护研究所, 河南郑州 450002; 2西北农林科技大学植保资源与病虫害治理教育部重点开放实验室, 陕西杨凌
712100; 3西北农林科技大学陕西省农业分子生物学重点实验室, 陕西杨凌 712100
摘 要: 小麦农家品种红蚰麦携带 1 对显性抗白粉病新基因, 暂命名为 Pmhym。为了深入了解该品种抗病的分子机
制, 用豫麦 13/红蚰麦的 F3代纯合抗病株系构建抗池, 采用 Affymetrix小麦基因芯片技术, 以白粉菌接种 0 h为对照,
分析白粉菌接种后 24 h的基因表达谱。在 61 127基因微矩阵点中, 有效差异表达 Ratio值≥2或≤0.5的基因共 5 282
个, 其中上调基因 2 553个, 下调 2 729个。对上调序列的分类表明, 功能明确的序列中 39.81%与抗病/防御相关; 下
调表达基因中以能量代谢和抗病/防御相关基因比例最高, 分别占 26.71%和 19.65%。上调表达在 8 倍以上的序列中
81个的功能已知, 其中包括病程相关基因、防卫反应基因、生成或清除活性氧的基因, 以及抗病信号转导基因等。选取
上调和下调表达 8倍以上的共 13个探针序列进行实时定量 PCR验证, 表明基因芯片数据具有良好的重复性。
关键词: 小麦; 抗白粉病基因; 基因芯片; 表达序列标签; 实时定量 PCR
Expression Profile of Landrace Hongyoumai Infected by Blumeria graminis f.
sp. tritici Using Gene Microarray
WANG Jun-Mei1,2, LIU Hong-Yan1,2,*, XU Hong-Ming1, WANG Fei1, GAO Su-Xia1, and KANG Zhen-Sheng2,3,*
1 Institute of Plant Protection, Henan Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450002, China; 2 Key Laboratory of Plant Protection Resources
and Pest Management, Ministry of Education, Northwest A&F University, Yangling 712100, China; 3 Shaanxi Key Laboratory of Molecular
Biology for Agriculture, Northwest A&F University, Yangling 712100, China
Abstract: Wheat landrace Hongyoumai carries one dominant resistance gene for powdery mildew (Blumeria graminis), tenta-
tively designated Pmhym. To further elucidate molecular mechanism of the resistance to powdery mildew in Hongyoumai, a resis-
tant pool was constructed with four homogenous resistant lines from the F3 generation of Yumai 13/Hongyoumai. The wheat seed-
lings were inoculated with single spore isolates of B. graminis f. sp. tritici, and at 0 and 24 h after inoculation the gene expression
profile was analyzed using Affymetrix wheat microarray. There were approximately 5 282 expressed genes (with log ratio ≥ 2
or ≤ 0.5) among total 61 127 genes set in the microarray plate, including 2 553 up-regulated and 2 729 down-regulated genes or
expressed sequence Tags (ESTs). In the up-regulated ESTs whose functions have been known, 39.81% were disease/defense genes.
In the down-regulated ESTs, energy genes and disease/defense genes accounted for 26.71% and 19.65%, respectively. A total of
81 ESTs were up-regulated more than eight times, in which most were related to disease resistance, such as pathogenesis-related
protein, defense genes, genes producing or eliminating reactive oxygen species, and genes involved in signal transduction. Quan-
titative RT-PCR (qRT-PCR) was carried out with 13 probe sets up-regulated and down-regulated more than eight times which
validated a good reproducibility of microarray analysis.
Keywords: Wheat; Powdery mildew resistance gene; Gene chip; Expressed sequence Tag (EST); Real-time quantitative RT-PCR
(q-PCR)
由禾谷类白粉菌 Blumeria graminis f. sp. tritici
引起的小麦白粉病是小麦生产上的一种世界性病
害。研究小麦的抗病机制是寻找抗病育种新方法的
有效途径, 但由于传统研究方法的制约, 从基因表
达整体水平上反映抗病相关基因表达的研究报道较
少。分子生物学技术的发展特别是近几年基因芯片
技术的兴起为从整体的角度研究小麦抗病的分子机
制提供了新的思路和解决方法。
第 7期 王俊美等: 应用基因芯片分析红蚰麦白粉菌胁迫条件下的基因表达谱 1189


基因表达谱芯片(gene expression profiling)是目
前应用最为广泛的基因芯片[1]。表达谱芯片可以分
析 2组或 2组以上不同来源的 mRNA转录杂交的差
异, 通过计算杂交信号的比值和统计分析以获得差
异表达基因的信息[2]。通过比较分析表达谱基因芯
片, 可从整体水平研究代谢机制, 认识基因相互之
间的网络关系, 发现重要基因。美国 Affymetrix 公
司整合 GenBank中已经提交的 EST序列, 开发了小
鼠、水稻、拟南芥、小麦等的 EST 基因芯片, 为从
整体水平研究基因的表达提供了可能。其中小麦上
已经开发出具有 6 万多个 EST 序列的基因芯片, 可
用于小麦基因表达谱的差异分析。
红蚰麦是河南农业科学院植物保护研究所收集
并保存的小麦农家品种, 具有优良的白粉病抗性[3]。
笔者利用传统的遗传分析发现该品种携带 1 对显性
的抗白粉病基因, 并通过 SSR 标记将该抗白粉病基
因定位在小麦的 7BL 染色体上(待发表)。本研究拟
利用基因芯片分析 F3代纯合抗病株系在白粉菌病菌
诱导前后的表达差异, 为揭示红蚰麦抗病的分子机
制提供参考, 为寻找抗病相关基因奠定基础。
1 材料与方法
1.1 抗病池的构建
从豫麦 13/红蚰麦杂种 F3 代中, 通过抗性鉴定
选择 4个纯合抗病株系(河南省农业科学院植物保护
研究所生物防治室提供), 分别种植在 4个营养钵内。
待幼苗长至三叶一心期 , 采用抖落孢子的方法接
菌。小麦白粉菌株由河南省农业科学院植物保护研
究所生物防治室采自郑州市郊区, 经单孢分离培养
后于感病品种豫麦 13上保存。采集接菌后 0 h和 24
h的叶片, 液氮速冻, 于干冰中保存并送往上海晶泰
生物技术有限公司。从 4个 F3纯合抗病株系分别提
取总 RNA后等量混合构成抗池, 以接菌 0 h的抗池
为对照, 以接菌 24 h的抗池为试验方。
1.2 探针合成和基因芯片筛选
利用 TRIzol (Invitrogen)方法抽提各材料的总
RNA, 并采用RNeasy Mini kit (Qiagen)纯化总RNA。
利用 one-cycle cDNA Synthesis Kit (Affymetrix)合成
ds cDNA, 由 GeneChip Sample Cleanup Module (Af-
fymetrix)纯化该 cDNA。以纯化的 cDNA 根据
GeneChip IVT Labeling Kit的实验说明制备生物素
标记的 cRNA, 并于 94℃保温 35 min 将其片段化。
片段化的 cRNA即为杂交用的探针。
Affymetrix 900493芯片包含来自小麦 42条染色
体上的代表 55 052个小麦转录本的 61 127个原位合
成的探针组(http://www.affymetrix.com/)。Affymetrix
网站上 NetAffy 数据分析中心提供了所有探针的详
细信息。
1.3 芯片杂交及数据分析
首先 , 应用检测芯片 (test chip)检测片段化
cRNA 的质量。之后取适量 cRNA 与实验芯片
(experimental chip)在 45℃的 Affymetrix 杂交箱 640
中杂交 16 h, 在 Genechip fluidics station洗涤工作站
450 中进行洗脱和染色。用 GeneArray TM scanner
3000 高分辨率扫描仪对染色后的芯片进行扫描, 利
用 GeneChip Operating Software (GCOS)计算机工作
站对芯片扫描所得数据进行计算和处理。先对每张
芯片的数据进行标准化(将芯片所有探针组的 Signal
从小到大排序, 去掉最大的 2%和最小的 2%后, 将
剩下探针组的平均信号值调整到 500)。根据杂交信
号, 将基因分为表达(present, P), 模糊表达(marginal,
M)和缺失(absent, A) 3种情况。之后对两张芯片的杂
交数据进行比较, 以白粉菌胁迫 0 h 的材料为参照,
白粉菌胁迫 24 h 后基因表达变化的比值≥2.0 为基
因表达明显上调, 比值≤0.5为基因表达明显下调。
1.4 定量 RT-PCR检测
参考说明书 , 采用 Biozol 法提取小麦叶片总
RNA(取样后−80℃保存)。1.0%琼脂糖凝胶电泳检测
总 RNA的完整性, 紫外分光光度计(Eppendorf)测定
其纯度和浓度。利用 M-MLV reverse transcriptase
(Promega)合成 cDNA 第一链, 稀释 50倍做模板。
以组成型表达基因 18S rRNA(GenBank 登录号
为 AY049040)作为内参对照。在已注释的差异表达
基因中, 选取上调表达≥8倍的候选基因 6个, 下调
表达≥8 倍的候选基因 7 个依据其芯片上探针组对
应的代表序列, 利用 Primer5.0 软件设计 13 对定量
PCR引物验证芯片结果, 引物序列见表 1。
根据本实验室优化的 PCR反应条件, 总体积 25
μL其中包含 cDNA 5 μL, MgCl2 4 μL, 10× buffer 2.5
μL, 上、下游引物(10 μmol L−1)各 0.5 μL, dNTPs (10
mmol L−1) 0.5 μL, Taq酶 0.4 μL (MBI Fermentas),
50× SYBR Solution 0.5 μL, ROX 0.1 μL, ddH2O 11
μL。反应在ABI PRISM 实时定量 PCR仪上进行, 程
序为 94℃变性 1 min, 94℃变性 15 s, 55℃退火(依引
物略有变化) 20 s, 72℃延伸 50 s, 42个循环。于 72
℃收集荧光, 反应结束后分析荧光值变化曲线和融
解曲线。每个反应 3次重复, 采用 2−ΔΔCt算法[4]分析
结果。
1190 作 物 学 报 第 35卷

表 1 用于实时定量 RT-PCR分析的引物
Table 1 Primers used in Real time quantitative RT-PCR analysis
探针组
Probe set
功能
Putative function
引物序列
Primer sequence(5′–3′)

Y049040 18S rRNA F: CTGAGAAACGGCTACCACAT
R: CCCAAGGTCCAACTACGAG
Ta.21342.1.S1_x_at Chitinase 3 F: GCCGTTCGCATAGTCAATC
R: CGCACCATTATTCGCTTGT

Ta.25666.1.A1_at MAP kinase homolog F: CACTGGGTCGTGACACTTCT
R: CCTCCTCTTCCTTGTATGCTG

Ta.9226.1.S1_at Pathogenesis-related protein 4 F: ACGGGATGCTGCCTTGTA
R: GATAACCCGTTTGGTCTTTTC

Ta.169.1.S1_x_at Germin-like protein F: ACGAGCACAAACAGAAATAGGA
R: GAAGGAAGGAAGAGGAGGATG

Ta.25053.1.S1_at Thaumatin-like protein F: GACGACCAGACCAGCACCT
R: CCTTGTTCCTTATTGATCCCA

Ta.28233.1.S1_at Glutathione-S-transferase F: TGTCGTTGGTGCTGGTCT
R: GTGTCCCTGTGGCATAAGTG

Ta.28224.2.S1_x_at Cyc07 F: GCTCGGTTTTATTGTGTGGC
R: TCTTGGACTTGGGATTCTATTTGT

TaAffx.27263.1.S1_at Vacuolar proton-inorganic pyrophosphatase F: CAATGTATTCCTCTGCCCC
R: GAAACCTGTGAAAAACCGC

TaAffx.120874.1.S1_x_at 23 kDa oxygen evolving protein of photosystem II F: TCCACCTCCTGCTTCCTCC
R: GCCTCGTCATTCTTCTGCG

Ta.13242.2.S1_x_at Cdpk1 protein F: TTCCTCGCTTCCTTTCTCC
R: ATCAAAACACACGGGCACA

Ta.11386.2.S1_a_at Ascorbate peroxidase F: AGGGATTCTCGCTGGACGC
R: AACGAAGGGCTCTGGCTGTG

Ta.2383.2.S1_x_at HSP80 F: TGGGCAATGTAAACGAGGG
R: AAAGGGGATTTGAGGCAGG

Ta.881.1.S1_at Cytosolic glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase GAPDH F: ACATCTTTCAGACCCGTTCA
R: TTTTTACAGTTCCTCCCACAG

2 结果与分析
2.1 芯片数据可靠性评价
无论是对照组还是试验组, 其基因芯片扫描图
像清晰, 背景平均值(average background)以及噪声
值(noise values) 都在适当范围内, 因而数据可以用
于后续分析。检测到 Poly-A 对照(lys、phe、thr 和
dap)及杂交对照(bioB、bioC、bioD 和 cre), 说明杂
交成功, 芯片检测的结果是可靠的。
2.2 整体水平基因差异表达
在 61 127 个基因微矩阵点中, 有效差异表达
Ratio值≥2或≤0.5的基因共 5 282个, 其中上调表
达基因 2 553个, 下调表达基因 2 729个。上调基因
中包括 2 054个转录位点, 13个假定序列, 64个克隆
序列, 已知 ESTs 序列 422 个(占 16.5%)。下调基因
中包括 2 224个转录位点, 4个假定序列, 48个克隆
序列, 已知 ESTs序列 453个(占 16.6%)。根据 Bevan
等[5]的分类方法对上调的 422 个已知 EST 序列进行
分类 , 其中以抗病 /防御相关基因的比例最大占
39.81%, 其他基因的功能及比例为能量 11.14%、信
号转导 8.06%、细胞结构 7.58%、蛋白合成 5.92%、
蛋白加工和储藏 4.03%、转录 6.64%、初级代谢
4.47%、次级代谢 3.32%、膜运输 3.32%、转运 1.90%、
细胞生长 0.24%, 还有 3.32%的基因未分类。下调的
453个 EST序列中能量代谢及抗病/防御相关基因的
所占的比例较大, 分别是 26.71%、19.65%。其他基
因的功能及比例为: 细胞结构 7.73%、转录 9.05%、
信号转导 6.40%、蛋白合成 6.18%、蛋白加工和储藏
3.97%、初级代谢 4.19%、次级代谢 5.52%、细胞生
长 3.31%、膜运输 2.65%、转运 1.99%, 另有 2.65%
的基因未分类。
2.3 上调表达 8倍以上的 EST序列分析
为了更明确地了解可能在抗病过程中起作用的
关键基因, 着重分析了上调在 8倍以上的 81个已知
EST序列(表 2), 其中多数基因与抗病或防御相关。
在上调表达的基因中, 大多数病程相关蛋白上调表
达, 如病程相关蛋白 4、过氧化物酶、非特异性脂质
转移蛋白 1前体、1型非特异性脂质转移蛋白前体、
脂质转移蛋白 3 和几丁质酶 3。一些与胁迫反应相
关基因上调表达, 包括 wrsi5-1 蛋白、Wali3 蛋白、
Wali2蛋白、wali6蛋白、Wgluc5蛋白、冷适应蛋白
第 7期 王俊美等: 应用基因芯片分析红蚰麦白粉菌胁迫条件下的基因表达谱 1191


表 2 受白粉菌诱导上调表达 8倍以上的已知 EST序列
Table 2 Annotated ESTs induced by Bgt with up-regulated expression at change ratio more than eight times
No. Probe set ID Signal log ratio Putative function No. Probe set ID
Signal
log ratio Putative function

1 Ta.9226.1.S1_at 9.5 Pathogenesis-related protein 4 42 Ta.141.1.S1_x_at 3.8 Gibberellin 20-oxidase
2 Ta.22564.2.S1_a_at 8.5 Peroxidase 43 Ta.87.1.S1_at 3.8 pSBGer1 protein
3 Ta.5810.1.S1_at 7.9 Nonspecific lipid transfer protein 1 44 Ta.1997.1.S1_at 3.8 Sec61p
precursor 45 Ta.7479.1.S1_a_at 3.7 Lt1.1 protein
4 Ta.22564.2.S1_x_at 7.8 Peroxidase 46 Ta.25666.1.A1_at 3.7 MAP kinase homolog
5 Ta.5385.1.S1_at 7.3 Peroxidase 47 Ta.4834.1.S1_at 3.7 Ornithine/acetylornithine
6 Ta.22564.1.S1_at 6.7 Peroxidase 48 Ta.87.1.S1_x_at 3.7 pSBGer1 protein
7 Ta.25053.1.S1_at 6.7 Thaumatin-like protein 49 Ta.27762.1.S1_x_at 3.7 Thaumatin-like protein
8 Ta.30711.1.S1_x_at 6.6 Wrsi5-1 protein 50 Ta.23322.1.S1_s_at 3.5 Beta amylase
9 Ta.21267.1.S1_s_at 6.5 Wali3 protein 51 Ta.5125.3.S1_at 3.5 MRNA transport factor
10 Ta.169.1.S1_x_at 6.4 Germin-like protein 52 TaAffx.106322.1.S1_at 3.4 Catalase
11 TaAffx.24475.1.S1_at 6.3 Glucan endo-1,3-beta-D-glucosidase 53 Ta.1082.3.S1_at 3.4 Delta-type tonoplast
intrinsic protein
12 Ta.13160.1.S1_at 6.2 Ribosomal protein L3
(RPL3) mRNA,
54 Ta.20563.1.S1_x_at 3.4 Germin-like protein
RPL3-A2 allele 55 Ta.5098.2.A1_at 3.4 Guanylyl cyclase
13 Ta.21342.1.S1_x_at 6.1 Chitinase 3 56 Ta.24199.1.S1_a_at 3.4 HBP-1b
14 Ta.24710.1.S1_at 6.1 Peroxidase 57 Ta.22628.1.S1_at 3.4 HSP70
15 Ta.24715.1.S1_at 5.9 Peroxidase 58 Ta.13818.1.S1_at 3.4 Putative xylanase inhibitor
16 Ta.4876.1.A1_x_at 5.6 Peroxidase 59 Ta.7765.1.A1_at 3.3 Geranylgeranylated
protein ATGP1
17 Ta.28.1.S1_at 5.5 Glucan endo-1,3-beta-D-glucosidase 60 Ta.5890.1.A1_at 3.3 Lipid transfer protein 3
18 TaAffx.104648.1.S1_at 5.5 Wali2 protein 61 Ta.24723.1.S1_x_at 3.3 PSBGer1 protein
19 Ta.82.1.S1_at 5.3 Peroxidase 62 Ta.24501.1.S1_at 3.3 Thaumatin-like protein
20 Ta.8574.2.A1_at 5.1 Putative xylanase inhibitor 63 Ta.21262.1.A1_at 3.3 Xylanase inhibitor TAXI-III
21 TaAffx.15327.1.S1_at 5.0 Glucan endo-1,3-beta-
D-glucosidase
64 Ta.3679.1.S1_x_at 3.2 Glutathione transferase
22 Ta.5024.1.S1_x_at 5.0 Wali6 protein 65 Ta.22628.1.S1_x_at 3.2 HSP70
23 Ta.13.1.S1_at 4.9 WIR1, pathogen defense protein 66 Ta.639.1.S1_at 3.2 Peptidylprolyl isomerase
24 Ta.18878.1.S1_at 4.7 Germin-like protein 67 Ta.8304.1.S1_a_at 3.2 Translation elongation factor 1
25 TaAffx.24475.1.S1_x_at 4.7 Glucan endo-1,3-beta-D-glucosidase alpha-subunit
26 Ta.28233.1.S1_at 4.4 Glutathione-S-transferase 68 Ta.9507.2.S1_at 3.1 CesA protein
27 Ta.23322.2.S1_at 4.3 Beta amylase 69 Ta.5098.1.S1_a_at 3.1 Guanylyl cyclase
28 Ta.27751.5.S1_at 4.2 Cdpk1 protein 70 Ta.30802.1.A1_at 3.1 HSP70
29 Ta.8108.2.S1_at 4.2 Cold acclimation protein
WCOR410c
71 Ta.1337.2.S1_x_at 3.1 Type 1 non-specific
lipid transfer
30 TaAffx.29050.1.S1_s_at 4.2 Hypothetical LOC543097 protein precursor
31 TaAffx.86898.1.S1_at 4.2 Phosphoethanolamine
methyltransferase
72 Ta.8584.1.S1_at 3.1 Wgluc5 protein
32 Ta.2784.1.A1_at 4.0 Chitinase 1 73 Ta.21262.1.A1_x_at 3.1 Xylanase inhibitor TAXI-III
33 Ta.141.1.S1_at 4.0 Gibberellin 20-oxidase 74 Ta.304.1.S1_at 3.0 Ald protein
34 Ta.26230.1.S1_x_at 4.0 Glutathione transferase F5 75 Ta.9320.1.S1_x_at 3.0 CCoAMT protein
35 Ta.7479.3.S1_x_at 4.0 Lt1.1 protein 76 Ta.1082.3.S1_x_at 3.0 Delta-type tonoplast
intrinsic protein
36 TaAffx.80336.2.S1_x_at 4.0 Putative high mobility group
protein
77 Ta.28219.1.A1_at 3.0 Glutathione transferase
37 Ta.1997.2.S1_a_at 4.0 Sec61p 78 Ta.25666.1.A1_x_at 3.0 MAP kinase homolog
38 Ta.2690.1.S1_at 3.9 Glutamine-dependent
asparagine synthetase
79 Ta.21137.1.S1_x_at 3.0 Peroxidase
39 Ta.7479.2.S1_x_at 3.9 Lt1.1 protein 80 Ta.29640.1.S1_x_at 3.0 Ribosomal protein L3 (RPL3)
40 Ta.231.1.S1_x_at 3.9 Secretory protein mRNA, RPL3-A2 allele
41 Ta.30501.1.S1_at 3.8 Chitinase 1 81 Ta.231.1.S1_at 3.0 Secretory protein
1192 作 物 学 报 第 35卷

WCOR410c和热休克蛋白 70等。抵抗病原菌的基因
有几丁质酶 1、假定木聚糖酶抑制子、木聚糖酶抑
制子 TAXI-III、WIR1、病原防御蛋白。类萌发素蛋
白和 pSBGer1蛋白与活性氧产生有关。活性氧清除
有关基因谷胱甘肽转移酶、谷胱甘肽转移酶 F5、谷
胱甘肽-硫-转移酶基因、过氧化氢酶等上调表达。上
调 8 倍、与信号传导相关的基因涉及钙信号的钙依
赖蛋白激酶 1 蛋白, 以及促分裂原活化蛋白激酶类
似物等。还有小部分其他功能的基因, 如与蛋白合
成、基础代谢、次生代谢、转运相关的, 如核糖体
蛋白 L3、翻译延伸因子 1 α-亚基、鸟氨酸/乙酰鸟氨
酸氨基转移酶、赤霉素 20-氧化酶和 Sec61p, 及一些
未分类基因。
2.4 差异表达基因的实时定量 PCR验证
为了验证芯片数据的可靠性, 对同样的实验材
料采用相同方法处理后取样, 提取总 RNA, 以反转
录的 cDNA为模板, 利用设计的 13对引物进行实时
定量 PCR验证。13个探针的表达模式均与芯片结果
一致(表 3)。说明芯片数据具有生物学意义上的可重
复性, 结果是可信的。

表 3 13个基因探针在基因芯片和实时定量 PCR的表达率分析
Table 3 Expression ratios of selected probe sets assessed by
GeneChip (Array) and qRT-PCR (qPCR)
定量 PCR qPCR 探针组
Probe set
芯片
Array 对照 Control
(0 h)
诱导株 Induced
plants (24 h)
Ta.21342.1.S1_x_at 6.1 0+/–0.72 6.59+/–0.47
Ta.25666.1.A1_at 3.7 0+/–0.74 1.95+/–0.63
Ta.9226.1.S1_at 9.7 0+/–0.69 3.65+/–0.76
Ta.169.1.S1_x_at 6.7 0+/–0.55 1.43+/–0.82
Ta.25053.1.S1_at 6.7 0+/–0.54 4.20+/–0.88
Ta.28233.1.S1_at 4.4 0+/–0.63 4.99+/–0.20
Ta.28224.2.S1_x_at –4.7 0+/–0.53 –3.62+/–0.61
TaAffx.27263.1.S1_at –3.6 0+/–0.55 –3.44+/–0.47
TaAffx.120874.1.S1_x_at –3.6 0+/–0.43 –2.82+/–0.48
Ta.13242.2.S1_x_at –3.3 0+/–0.52 –1.65+/–0.46
Ta.11386.2.S1_a_at –3.2 0+/–0.86 –1.20+/–0.56
Ta.2383.2.S1_x_at –2.5 0+/–0.86 –3.35+/–0.47
Ta.881.1.S1_at –4.1 0+/–0.72 –1.26+/–0.69
3 讨论
在已有报道中, 对小麦抗白粉病基因及与白粉
病抗性相关基因的分析均集中于接菌 24 h以后, 对
接菌早期的研究则较少。Li等[6]发现, 小麦近等基因
系接白粉菌后, 在 24 h 内过敏性反应差异较大, 进
一步说明研究 24 h以内的早期反应对揭示抗病机制
非常重要。本研究以小麦接白粉菌后 24 h这一特殊
时间点为对象来研究小麦接白粉菌早期的抗白粉病
机理, 获得了较为重要的基因表达信息。骆蒙等 [7]
以抗白粉病品系百农 3217/Mardler BC5F4为材料, 构
建了一个白粉病菌接种 24、48和 72 h 3个时间点混
合的抑制消减杂交 cDNA 文库, 获得了 271 条功能
已知的 EST。在本试验中, 通过基因芯片表达谱分
析接菌后 24 h的差异表达基因, 共获得 5 282个差
异表达基因。可见, 基因芯片在通量上要比抑制消
减杂交高很多, 而且由于基因芯片中的序列信息是
已知的, 后期的数据处理也更快捷。
在白粉菌诱导后的 24 h, 小麦体内与抗病/防御
相关基因上调表达, 而与能量代谢相关的基因下调
表达。表明小麦在受到病原菌的诱导后体内的生理
生化过程积极进行了适应性调节, 降低了能量代谢,
增强了抗病 /防御的能力。与骆蒙等 [7]的报道一致 ,
本试验获得的序列中最多的也是抗病相关 EST。对
上调 8 倍以上基因进行了分析, 发现其中很多可能
涉及抗病的基因上调表达。主要包括一些 PR蛋白、
抗菌物质、活性氧生成及清除基因、胁迫相关基因
和抗病信号传导基因。
由于 PR 蛋白 pathogenesis-related protein 4、
thaumatin-like protein参与了由水杨酸介导的系统获
得抗性, 提示水杨酸信号途径可能与红蚰麦的抗白
粉病具有密切相关性。曹爱忠等[8]利用大麦基因芯
片研究簇毛麦的抗白粉病机制时发现簇毛麦抗白粉
病过程涉及的主要信号传导途径是水杨酸途径。水
杨酸途径是否作为一个普遍存在的信号传递途径参
与植物对病原菌的抗病过程尚待进一步研究。
几丁质和 β-1,3-葡聚糖是真菌细胞壁的重要结
构成分, 在许多真菌的菌丝顶端, β-1,3-葡聚糖和几
丁质暴露在细胞壁表面 , 能够直接受到β-1,3-葡聚
糖酶和几丁质酶的水解 [9-10], 这不仅使真菌菌丝生
长点受到破坏, 而且在水解过程中由真菌细胞壁释放
出来的寡糖能够作为植物多种抗病反应的激发因子,
诱导植物的全面防卫反应[9]。本研究中发现 Germin-
like protein和 pSBGer1 protein基因在白粉菌诱导后
上调表达, 由于 Germin与草酸盐氧化酶具有较高同
源性, 可以氧化草酸盐生成 H2O2, 而 H2O2是一种重
要的活性氧, 在抗病过程中起重要作用。Germin 基
因在抗病过程中的作用可能就是由它氧化草酸盐产
生的 H2O2来介导的。同时也发现一批清除活性氧的
第 7期 王俊美等: 应用基因芯片分析红蚰麦白粉菌胁迫条件下的基因表达谱 1193


基因上调表达 , 如 Glutathione transferase、Gluta-
thione transferase F5、Glutathione-S-transferase 和
Catalase。其原因可能是活性氧爆发后, 必然对细胞
存在一定的危害, 为维持细胞正常的代谢功能, 侵
染点附近会产生很多清除活性氧的酶, 这种现象已
经被很多研究所证实[11-13]。
本试验中还发现有大量 MAPK类似物的表达。
有研究表明信号激酶MAPK可以蛋白磷酸化的形式
把细胞外信号刺激传递到细胞内, 同时特异地放大
信号, 它参与的磷酸化反应在植物抵抗病原菌侵害
中具有重要作用[13-14]。说明外界刺激信号的传递参
与小麦早期抗白粉病反应过程。胁迫相关基因的上
调表达可能是与胁迫诱导后体内一些共同的调节机
制有关。
13个探针的荧光定量 PCR验证表明, 作为一种
高通量研究基因表达的手段, 芯片分析具有良好的
可重复性, 是目前研究多基因表达谱, 筛选植物抗
病相关基因, 揭示植物抗病分子机制的有效方法。
4 结论
利用基因芯片技术分析了豫麦 13/红蚰麦的 F3代
抗病株系受白粉菌胁迫诱导的基因表达谱, 筛选到
一批受白粉菌诱导后差异表达的基因, 为克隆抗白
粉基因、开展抗病育种及探讨小麦抗白粉病的分子
调控机制提供了重要参考。
References
[1] Han J, Lee H, Nguyen N Y, Beaucage S L, Puri R K. Novel mul-
tiple 5-amino-modified primer for DNA microarrays. Genomics,
2005, 86: 252–258
[2] Veerasingham S J, Sellers K W, Raizada M K. Functional ge-
nomics as an emerging strategy for the investigation of central
mechanisms in experimental hypertension. Prog Biophys Mol
Biol, 2004, 84: 107–123
[3] Wang X-F(王锡锋), Zhang Z-S(张忠山), Liu H-Y(刘红彦), He
W-L(何文兰). Evaluation of resistance and slow-mildewing of
some wheat varieties in Henan Province. Acta Agric Univ He-
nanensis (河南农业大学学报), 1996, 30(2): 160–163 (in Chi-
nese with English abstract)
[4] Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression
data using real-time quantitative PCR and the 2−ΔΔCt method.
Methods, 2001, 25: 402−408
[5] Bevan M, Bancroft I, Bent E, Love K, Goodman H, Dean C,
Bergkamp R, Dirkse W, Van Staveren M, Stiekema W, Drost L,
Ridley P, Hudson S A, Patel K, Murphy G, Piffanelli P, Wedler H,
Wedler E, Wambutt R, Weitzenegger T, Pohl T M, Terryn N,
Gielen J, Villarroel R, De Clerck R, Van Montagu M, Lecharny A,
Auborg S, Gy I, Kreis M, Lao N, Kavanagh T, Hempel S, Kotter
P, Entian K D, Rieger M, Schaeffer M, Funk B, Mueller-Auer S,
Silvey M, James R, Montfort A, Pons A, Puigdomenech P, Douka
A, Voukelatou E, Milioni D, Hatzopoulos P, Piravandi E, Ober-
maier B, Hilbert H, Düsterhöft A, Moores T, Jones J D G, Eneva
T, Palme K, Benes V, Rechman S, Ansorge W, Cooke R, Berger C,
Delseny M, Voet M, Volckaert G, Mewes H W, Klosterman S,
Schueller C, Chalwatzis N. Analysis of l.9 Mb of contiguous se-
quence from chromosome 4 of Arabidopsis thaliana. Nature,
1998, 391: 485–488
[6] Li A L, Wang M L, Zhou R H, Kong X Y, Huo N X, Wang W S,
Jia J Z. Comparative analysis of early H2O2 accumulation in com-
patible and incompatible wheat powdery mildew interaction.
Plant Pathol, 2005, 54: 308–316
[7] Luo M(骆蒙), Kong X-Y(孔秀英), Huo N-X(霍纳新), Zhou
R-H(周荣华), Jia J-Z(贾继增). ESTs analysis of resistance to
powdery mildew in wheat at primary infected stage. Acta Genet
Sin (遗传学报), 2002, 29(6): 525–530 (in Chinese with English
abstract)
[8] Cao A-Z(曹爱忠), Li Q(李巧), Chen Y-P(陈雅平), Zou X-W(邹
晓文), Wang X-E(王秀娥), Chen P-D(陈佩度). Screening resis-
tance-related genes to powdery mildew in Haynaldia villosa us-
ing barley genechip and studying its mechanism of resistance.
Acta Agron Sin (作物学报), 2006, 32(10): 1444–1452 (in Chi-
nese with English abstract)
[9] Selitrennikoff C P. Antifungal proteins. Appl Environ Microbiol,
2001, 67: 2883–2894
[10] Klarzynaski O, Plesse B, Joubert J M, Yvin J C, Kopp M,
Kloareg B, Fritig B. Linear β-1,3-glucanase are elicitors of de-
fense responses in tobacco. Plant Physiol, 2000, 124: 1027–1037
[11] Alosi M C, Melroy D L, Park R B. The regulation of gelation of
phloem exudate from cucurbita fruit by dilution, glutathione, and
glutathione reductase. Plant Physiol, 1988, 86: 1089–1094
[12] Walz C, Juenger M, Schad M, Kehr J. Evidence for the presence
and activity of a complete antioxidant defence system in mature
sieve tubes. Plant J, 2002, 31: 189–197
[13] Machida Y, Nishihama R, Kitakura S. Progress in studies of plant
homologs of mitogen-activated protein (MAP) kinase and poten-
tial upstream component in kinase cascades. Crit Rev Plant Sci,
1997, 16: 481–496
[14] Frye C A, Tang D, Innes R W. Negative regulation of defense re-
sponses in plants by a conserved MAPKK kinase. Proc Natl Acad
Sci USA, 2001, 98: 373–378