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Cloning and Expression Analysis of an NBS-LRR Type Gene from Sugarcane

甘蔗中一个NBS-LRR类基因的全长克隆与表达分析



全 文 :作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2009, 35(6): 1161−1166 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2007AA100701), 农业部引进国际先进农业科学技术计划(948计划)项目(2006-G37), 国家自
然科学基金项目(30170639), 福建省科技厅国家科技项目备案(F2007AA100701), 现代农业产业技术体系建设专项资助。
*
通讯作者(Corresponding author): 许莉萍, E-mail: xlpmail@yahoo.com.cn
第一作者联系方式: E-mail: queyouxiong@yahoo.com.cn
Received(收稿日期): 2008-09-13; Accepted(接受日期): 2008-12-13.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2009.01161
甘蔗中一个 NBS-LRR类基因的全长克隆与表达分析
阙友雄 许莉萍* 张木清 徐景升 张积森 陈如凯
福建农林大学 / 农业部甘蔗遗传改良重点开放实验室, 福建福州 350002
摘 要: 采用 RACE技术, 从甘蔗高抗黑穗病品种 NCo376中克隆了一个 NBS-LRR类基因的 cDNA全长序列, 命名
为 SNLR。生物信息学分析显示, 甘蔗 SNLR基因的 cDNA全长为 2 985 bp (GenBank登录号为 EF155654), 包括一个
2 661 bp的完整开放读码框以及一个典型的 29 bp poly-A。同时, 还具有 NBS-LRR类抗病基因的所有保守结构域, 包
括 4个 NBS区域保守结构域和 6个潜在 LRR结构域; 蛋白疏水性分析和二级、三级结构分析表明, 该基因编码的蛋
白质为弱碱性蛋白, pI为 7.76, 无明显的疏水结构域, 以卷曲结构和螺旋结构为骨架, 三级结构未见明显的跨膜信号
蛋白区。定量 PCR分析表明, 甘蔗 SNLR基因的表达受到黑穗病菌、水杨酸和过氧化氢的影响, 分别表现出“抑-扬”、
“全程抑制”和“扬-抑”的表达模式, 也具有抗病基因组成型和组织特异性表达的特点。推测甘蔗 SNLR 基因可能为抗
病相关基因。
关键词: 甘蔗; 分子克隆; 抗病基因; 定量 PCR
Cloning and Expression Analysis of an NBS-LRR Type Gene from Sugarcane
QUE You-Xiong, XU Li-Ping*, ZHANG Mu-Qing, XU Jing-Sheng, ZHANG Ji-Sen, and CHEN Ru-Kai
Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement, Ministry of Agriculture / Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China
Abstract: In the present study, a non-TIR-NBS-LRR type disease-related gene was cloned by rapid amplification of cDNA ends
(RACE) using the high-resistant sugarcane variety NCo376. This gene was termed as SNLR, with the GenBank accession No. of
EF155648. The full-length cDNA sequence of SNLR is 2 985 bp, including an open reading frame (ORF) of 2 661 bp and the
typical 29 bp poly-A. The SNLR gene contained all the four typical conserved motifs of the NBS: P-loop (GMGGVGGKTT),
Kinase-2 (LIVLDD), Kinase3a (GSR/KILVIIR) and hydrophobic region (GLPLAL), plus six putative LRR regions. It can be
deduced from the hydrophobic character, secondary structure and 3D model analysis of the corresponding coding protein that the
SNLR protein was alkalescent, with pI of 7.76 and without any obvious hydrophobic domain; coil and helices were the framework
of secondary structure; no transmembrane region was found in its protein 3D model. The gene expression profile under the treat-
ment of U. scitaminea, SA and H2O2 were investigated by Real-time qPCR. The results showed that expression of sugarcane
SNLR gene was influenced by the fungus, SA and H2O2, with the expression patterns of “down-up”, “down in the whole process”
and “up-down”, respectively. It was inferred that expression of SNLR gene occurs both via an H2O2- and SA-dependent pathway.
At the same time, SNLR gene was found to be expressed highly in leaves, mildly in stalks and slightly in roots, which indicated its
relation to resistance in this aspect.
Keywords: Sugarcane; Molecular cloning; Disease resistance gene; Real-time quantitative PCR
植物在长期的进化过程中 , 与病原菌相互作用 , 协
同进化, 形成了复杂的抗病机制。现在普遍认为, 在分子
水平上植物的抗病性是由抗病基因 (tesistance gene, R
gene)介导的防御反应。因此, 植物抗病基因的克隆和功能
分析是深入了解植物抗病机制以及利用基因工程技术对
植物进行性状定向改良的基础。
大量研究表明, RGA 与 R 基因之间的关系主要有 3
种, 即 RGA 是 R 基因或假基因(pseudogene)的一部分,
RGA 与 R 基因紧密连锁或 RGA 与 R 基因无关。R 基因
存在保守区, 这为克隆抗病基因提供了相对便捷的途径。
核苷酸结合位点(nucleotide binding site, NBS)存在于真核
生物的许多蛋白中 , 如 ATPase、延伸因子 (elongation
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factors)异质三聚体、GTP 结合蛋白(G proteins)和 R 基因
编码蛋白等[1]。在植物中, NBS类 RGA主要存在于植物抗
病基因中 , 参与植物抗病信号转导和抗病作用的发挥
[1-4]。但是, NBS与基因的抗病功能没有必然联系, 并非只
有抗病基因才具有 NBS结构域, 具有 NBS结构域的基因
也不一定就是抗病基因。许多蛋白家族 , 包括 RAS(rat
sarcoma)族蛋白、ATPase延伸因子、G蛋白、ATP和 GTP
的结合蛋白都含有 NBS 位点 [1-2]。除了 NBS 结构域 ,
NBS-LRR 类抗病基因还应具有其他一些重要的结构域,
如 TIR (toll or interluken-1-receptor)、LRR (leucine-rich
repeats)或 LZ (leucine zipper)等。利用已知植物抗病基因
类似物 RGA 序列, 设计 PCR 引物, 结合 RACE 技术, 将
有望从那些暂时还无法利用图位克隆和转座子标签技术
分离目的基因的作物中克隆目标抗病基因。
本研究是在前期研究的基础上 [5], 选取其中一条编
号为 EF155648, 经数据库检索仅与玉米抗病基因(GenBank
登录号为 AY986485)高度同源的 RGA, 以高抗黑穗病甘蔗
品种 NCo376 为材料, 克隆 cDNA 全长, 分析该基因在黑
穗病菌、水杨酸和过氧化氢胁迫下的表达特点及其在甘蔗
不同组织部位(根、茎、叶)的表达情况, 为甘蔗抗黑穗病
的分子生物学研究提供依据。
1 材料与方法
1.1 植物材料
甘蔗热带种和割手密杂交后代 NCo376(高抗黑穗病
菌小种 1和 2)来自福建农林大学甘蔗综合研究所。取生长
健壮、长势一致的蔗茎, 50℃热水脱毒处理 2 h后, 进行带
菌检测, 采用托盆种植, 沙培, 共 6 盆, 每盆 21 株, 置赛
福 PGX-380C光照培养箱中, 在光照强度 275 μmol m−2 s−1,
光照 13 h, 黑暗 11 h, 温度 27℃条件下培养。待长至 5叶
期时, 分别进行每毫升 5×105个黑穗病菌孢子的悬浮液针
刺接种蔗芽, 并以 5 mmol L−1 SA和 10 mmol L−1 H2O2喷
射叶面处理, 用蒸馏水进行同样处理作为对照[5]。在处理
0、6、12、24、48、60和 72 h后剪取完全展开的功能叶,
每次取 3 株, 立即用液氮固定, 置–80℃冰箱保存, 用于
SNLR基因表达分析。前期的研究显示, 处理 36 h后甘蔗
PIC 基因的表达量最高, 取该处理的材料提取 RNA 用于
编号为 EF155648 RGA的 RACE扩增。
1.2 RNA的提取和 cDNA第一链的合成
参考 Que 等[6]方法提取甘蔗叶片总 RNA。取黑穗病
菌处理 36 h后甘蔗叶片提取的 RNA用于第一链 cDNA的
合成, 方法参照 BD SMARTTM RACE cDNA Amplification
Kit 说明书。
1.3 甘蔗 SNLR基因 3′和 5′端克隆
根据笔者所克隆的登录号为 EF155648 的 RGA 序列
信息, 分别设计 5′RACE 和 3′RACE 特异引物(5′RACE
primer: 5′-TCACAACACGGAAGAATC-3′, 退火温度 60℃;
3′-RACE primer: 5′-GGCTGCTCTTGCTCACCCAACACG-
3′, 退火温度 65℃)。
参照 BD SMART RACE cDNA Amplification Kit说明
书, 进行 5′和 3′RACE-PCR 扩增。而后, 根据 UNIQ-10
柱式 DNA 胶回收试剂盒(上海生工生物工程技术有限公
司)和 pMD18-T(TaKaRa)相关试剂盒说明书, 进行目的片段
的回收、克隆。委托上海捷瑞生物工程技术有限公司测序。
1.4 序列分析
利用 DNAMAN 和 Primer 6.0 软件进行 5′RACE 和
3′RACE测序产物的拼接, 获得 SNLR基因全长。而后, 对
获得的目的基因核苷酸序列及其推演的氨基酸序列于
NCBI上进行 Blast检索。用 NCBI的 ORF Finder分析基
因的开放读码框 , 在 NCBI 上分析基因的功能区。用
DNAMAN6.0 软件分析所克隆基因的疏水性和二级结构,
同时结合有代表性的 18 个不同来源 NBS-LRR 基因推演
氨基酸序列 , 进行 SNLR 基因的系统进化分析。使用
ESyPred3D Web Server 1.0 预测候选基因蛋白结构, DS
ViewerPro 6.0 Trial绘制预测候选基因蛋白结构图[7]。
1.5 甘蔗 SNLR基因的表达分析
甘蔗叶片总 RNA 的提取方法同 1.2。除退火温度为
60℃外, 定量 PCR 的反应体系、反应程序以及数据处理
同阙友雄等[5]采用的方法, 试剂盒为 TaKaRa RNA PCR
Kit (AMV) Ver.3和 EX Taq SYB GREEN I (TaKaRa)。定量
PCR引物如下, 甘蔗 SNLR基因正向引物 5′-GAAAACAA
CACAGCGGAGGAG-3′, 反向引物 5′-GCAACAGCAAG
GGCAAGA-3′; 内参基因 25S rRNA正向引物 5′-GCAGCC
AAGCGTTCATAGC-3′, 反向引物 5′-CCTATTGGTGGG
TGAACAATCC-3′。
2 结果与分析
2.1 甘蔗 SNLR基因 cDNA全长克隆及序列分析
采用所设计 3′和 5′RACE 引物进行 PCR 扩增, 扩增
产物经克隆、测序、拼接, 获得甘蔗 SNLR 基因的 cDNA
全长序列。该基因的 cDNA全长为 2 985 bp (GenBank 登
录号为 EF155654)。包括一个 2 661 bp的完整开放读码框
(open reading frame, ORF)和一个典型的 29 bp poly-A序
列。结构分析表明, SNLR 基因编码 886 个氨基酸的残基
ORF 中, 具有 NBS 类抗病基因 4 个典型的结构域, P-loop
(GMGGVGGKTT)、Kinase-2(LIVLDDVW)、Kinase3a (GSR/
KILVIIR)和疏水性区段(GLPLAL), 具有 6 个典型的亮氨
酸重复结构域 (leucine-rich repeat, LRR)(图 1), 并且在
Kinase-2 (LIVLDDVD/W)区的最后一个氨基酸为天冬氨
酸(W)。CDS (conserved domain sequence)分析显示, SNLR
基因编码的蛋白具有 NB-ARC、LRR和 CC结构域。甘蔗
SNLR 基因亮氨酸结构域符合胞质类型 LRR 典型结构
“LXXLXLXX(X/C)XXXXXaXXXaXXXX”, 推测本文所
克隆的 SNLR基因为胞质类型, 在甘蔗某种抗性中发挥作
用。同源性比对显示, 甘蔗 SNLR 基因与 NCBI 数据库中
已有基因同源性不高, 可能为一个新基因。
第 6期 阙友雄等: 甘蔗中一个 NBS-LRR类基因的全长克隆与表达分析 1163




图 1 SNLR基因的氨基酸序列
Fig. 1 Amino acid sequence of sugarcane SNLR gene
图中框中部分为 NBS的 4个保守结构域; 下划线部分为 LRR结构域。
Four typical motifs of NBS-LRR type gene and one hydrophobic domain are boxed and the putative LRRs domains are underlined.

2.2 甘蔗 SNLR基因所编码蛋白质的特性分析
甘蔗 SNLR 基因编码的氨基酸残基为弱碱性, pI 为
7.76, 含有 110个强酸性氨基酸残基(Glu 63个, Asp 47个),
132个强碱性氨基酸残基(His 21个, Lys 59个, Arg 52个),
315个疏水氨基酸残基(Ala 44个, Ile 56个, Leu 131个,
Phe 23个, Val 61个)和 225个极性氨基酸残基(Cys 12个,
Asn 44个, Gln 37个, Ser 62个, Thr 44个, Tyr 26个)。
DNAMAN分析显示, SNLR基因编码的蛋白产物中, 疏水
氨基酸含量不高 , 仅占约 44.5%, 并无明显的疏水结构
域。二级结构中, 35.67%为螺旋结构(Helices), 16.25%为线
状结构(Strands), 48.08%为卷曲结构(Coils), 卷曲结构和
螺旋结构是该蛋白质二级结构的骨架 (图 2)。采用
ESyPred3D 进行蛋白三级结构预测, 结果显示, 两端分别
是 N-端和 C-端结构域, 无明显的跨膜结构域和特定磷酸
化位点, C端也未见明显的跨膜信号蛋白区(图 3)。
2.3 甘蔗 SNLR基因的系统进化分析
从图 4可以看出, 19个 NBS-LRR类基因主要可以分
为 4大组, 甘蔗 SNLR基因与双子叶植物芥蓝头(Arabidopsis
lyrata) RPM1 基因的亲缘关系最近 , 其次是水稻(Oryza
sativa) Pib 基因, 这 3 个基因同马铃薯(Solanum tuberosum)
Gpa2和 rx基因以及拟南芥(Arabidopsis thaliana) RPP8基
因一起聚类为一组。其中 RPM1在芥蓝头对白斑病菌的抗
性中起重要作用, Pib基因是水稻抗稻瘟病基因, Gpa2是
马铃薯抗胞囊线虫基因, 而 rx基因在马铃薯 PVX病毒病
(potato virus X, PVX)抗性中发挥作用。另外拟南芥 RPP8
基因的表达可以增强其对霜霉病的抗性。根据这些基因之
间存在的系统进化关系, 推测本实验所克隆的 non-TIR-
NBS-LRR 类基因 SNLR, 可能在甘蔗对某种病害(如甘蔗
黑穗病)的抗性机制中起作用。该基因具体的功能有待进
一步研究。另外, 克隆自拟南芥的 6个基因可以根据亲缘
关系分为 3 类, 同时每一类所包含的 NBS-LRR 抗病基因
之间具有不同的同源性, 这也暗示了 NBS-LRR 类抗病基
因可以在植物抵御不同病害的侵染中起作用。



图 2 甘蔗 SNLR基因编码产物的二级结构分析图
Fig. 2 Protein secondary structure of sugarcane SNLR gene
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图 3 甘蔗 SNLR基因编码蛋白三级结构预测图
Fig. 3 3D structure prediction of sugarcane SNLR protein



图 4 不同来源的 NBS-LRR类基因的系统进化分析
Fig. 4 Phylogenetic tree of NBS-LRR type genes from different
plant species

2.4 不同外源因素胁迫对甘蔗 SNLR基因表达的影响
从图 5 可以看出, 甘蔗接种黑穗病菌后, SNLR 基因
的表达一定程度上呈现“抑-扬”趋势。首先, SNLR 基因的
表达受到至少长达 24 h的抑制, 在胁迫 36 h后, 表达量略
有上升, 但仍然低于处理起始阶段的表达量, 在 48~60 h
表达量下降并维持受抑制状态。在处理 72 h后, 表达量上
升 , 处于一个较高水平。总的说来 , 接种黑穗病菌后 ,
SNLR基因呈现先抑后扬的表达模式, 即处理起始至 60 h
表达受到抑制, 而后表达上调, 在处理 72 h后维持高量表
达状态。可能的一种解释是, 本实验中接种所用的甘蔗黑
穗病菌的生活力较弱, 接种初期, 病原菌侵入蔗芽, 但在
芽体中繁殖速度较慢 , 甘蔗品种受到黑穗病菌的胁迫较
轻, 抗病相关基因 SNLR 的诱导表达也较弱; 而后, 增殖
的黑穗病菌对甘蔗的胁迫增强, 在处理 72 h后, 甘蔗和黑
穗病菌协调作用, 启动了 SNLR 基因对病原的响应, 促使
SNLR上调表达, 从而提高了甘蔗对黑穗病的抗性。
从图 6可以看出, 甘蔗 SNLR基因在受到水杨酸胁迫
后, 呈现较明显的“全程抑制”表达模式。水杨酸处理后,
甘蔗 SNLR基因的表达下调; 在整个 72 h处理中, 表达虽
有小量的波动, 但都表现出受抑制的状态。推测原因有 2
个, 第 1是 SNLR基因仅在水杨酸胁迫早期发挥抗性作用,
而后水杨酸传递胁迫信号 , 诱导下游抗性相关基因的表
达, 启动抗性响应机制, 完成使命后, 在其他抗性基因级
联反应过程中仅维持较低的表达量。第 2是 SNLR基因具
有一种不依赖于水杨酸的抗性作用途径。
从图 7 可以看出 , 在受到过氧化氢胁迫后 , 甘蔗
SNLR 基因的表达不同于接种黑穗病菌或水杨酸处理后的
情况, 呈现“扬-抑”的表达模式。在处理早期的 12~24 h时
间段内, 该基因表达上调, 而后, 表达量下降并维持在一
个较低的水平。推测在处理早期, 过氧化氢胁迫起着信号
因子的作用, 传递胁迫信号, 诱导抗性相关基因 SNLR 的
表达; 而后, 在 SNLR 基因的抗性作用下, 胁迫得到缓解
甚至解除, 表达也随之减弱, 表达量下降。



图 5 甘蔗 SNLR基因在黑穗病菌胁迫下的表达特性
Fig. 5 Expression of SNLR gene under U. scitaminea treatment



图 6 甘蔗 SNLR基因在水杨酸胁迫下的表达特性
Fig. 6 Expression of SNLR gene under SA treatment



图 7 甘蔗 SNLR基因在过氧化氢胁迫下的表达特性
Fig.7 Expression of SNLR gene under H2O2 treatment

2.5 甘蔗 SNLR基因在甘蔗根、茎和叶片中的表达
图 8显示, SNLR基因在甘蔗根、茎和叶中组成型表
达, 并具有表达部位的特异性, 表达量在叶片中的最高,
茎中次之, 根中最低。黑穗病菌对甘蔗的侵染从蔗芽开始,
病原菌入侵后, 在芽体增殖, 而后刺激生长点, 并以黑穗
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鞭子的形式抽出, 若甘蔗 SNLR 基因与抗黑穗病性相关,
则这可能正是造成抗性相关基因 SNLR在叶片中表达量最
高的原因; 另外, 有关甘蔗黑穗病菌的研究, 尚未发现黑
穗病菌可以从根部侵染, 其传播也主要是风传, 这也许是
SNLR基因在根部仅有微量表达的原因。



图 8 甘蔗 SNLR基因在根、茎和叶片中的表达
Fig. 8 Tissue-specific expression of SNLR gene in sugarcane root,
stalk, and leaf
3 讨论
NBS 结构域是植物抗病基因中最重要的保守结构域
之一, 由结合 ATP或 GTP的磷酸结合环(P-loop)、激酶-2
(Kinase-2)、与 DNA 中嘌呤或核糖结合相关的激酶-3a
(Kinase-3a)以及一个疏水结构域组成。迄今, 已从 9 种植
物中克隆到编码含有 NBS序列的抗病基因。NBS存在于
抗病基因产物中 , 说明抗病基因行使抗病功能时需要
ATP或 GTP提供能量[8]。一些研究也证明, NBS对抗病防
御反应的形成很重要, 特别是这一区域某些关键氨基酸,
与植物抗病信号传递密切相关。Bent[8]和 Baker 等 [9]对
Rps2 基因和 N 基因进行定点缺失突变实验, 发现有几个
关键部位氨基酸残基缺失后, 植物不能产生 HR 反应, 暗
示这一区域对植物抗病防御反应形成有重要作用 , 可能
与病原激发子(elicitor)以及抗病基因信号传导的下游蛋白
相互作用的特异性有关[2]。本研究中, 甘蔗 SNLR 基因具
有完整的 NBS 结构域, 若该基因与甘蔗黑穗病抗性有关,
则该结构域可能在甘蔗对黑穗病的抗性中参与病原识别,
或与 ATP(GTP)结合, 提供能量, 最终激活激酶或 G蛋白,
参与蛋白质磷酸化, 放大抗病反应信号, 使甘蔗对病原产
生过敏反应。
LRR 结构域是富含亮氨酸的一段氨基酸序列, 一般
由 24个氨基酸残基组成, 并在某些位置上有规律地分布其
他疏水氨基酸残基。该结构域不仅可以参与蛋白质之间的
互作或蛋白与配体的结合 , 还能促进基因产物和防卫反
应中信号的传递[3]。在植物中, 已克隆的绝大多数抗病基
因都含有 LRR, LRR 是识别病原无毒基因(Avr)和抗病信
号传递所必需的。Bent等[4]通过研究发现, 在 RPS2、RPM1
和 N 基因中, LRR 结构域单个氨基酸的改变会导致抗病
能力的丧失, 并指出 LRR 能促进抗病基因产物与植物抗
病反应信号传导过程中其他蛋白质之间的互作 , 参与识
别后的信号传导[8,10]。另外, 根据其在细胞内的定位, 抗
病基因编码蛋白所含的 LRR 结构域, 可以分为胞外和胞
质两种类型[11]。本实验中克隆的甘蔗 SNLR基因为胞质型
non-TIR-NBS-LRR 基因, 但是否具有识别病原无毒基因
和识别后抗病信号传递的作用 , 是否能够促进抗病相关
蛋白之间的相互作用, 有待进一步研究。
前人研究发现, 大部分病原菌对植物的侵染会使植
物组织发生局部过敏性反应(hypersensitive reaction, HR),
诱导植物抗毒素等物质的合成, 激发下游 PR (pathogenesis-
related)蛋白基因的表达, 使植物获得系统获得抗性(systemic
acquired resistance, SAR)[12-13]。本研究中, 黑穗病菌胁迫
影响了甘蔗 SNLR 基因的表达, 前期抑制, 后期诱导。其
次, 水杨酸(salicylic acid, SA)是许多植物 R基因特异抗病
反应的重要信号分子, 涉及并参与植物的 HR和 SAR反应,
在植物的抗病信号转导中起着关键作用 [11], 同时外源水
杨酸处理, 也可以直接诱导植物抗病性反应[13]。SA 作为
SAR 信号转导途径的一个内源信号分子, 其作用已在烟
草、拟南芥和黄瓜等植物中得到证实, 提高 SA 水平可以
使这些植物产生 SAR[14-15]。但是本研究的结果却显示, 水
杨酸处理抑制 SNLR基因的表达, 或仅在胁迫早起发挥作
用, 或者具有不受水杨酸胁迫诱导的抗性作用途径。有研
究报道, H2O2可以作为信号因子, 在胁迫早期启动植物中
某些防御机制, 提高植物对病害的抵抗能力[16]。在具黑曲霉
(Aspergillusniger)转葡萄糖氧化酶(GO)基因的马铃薯植株
内 , H2O2 的积累明显增强马铃薯对黑胫病菌 (E. caro-
tovava)的抗性 [17]。与前人研究结果类似, 本研究中外源
H2O2同样诱导抗病相关基因 SNLR在早期的上调表达, 抑
制病原生长, 而后维持在一个较低的表达量。已有的研究
表明, 除水稻 Xa1基因和 Pib等少数几个基因受病原菌接
种诱导外, 抗病基因大多为低丰度组成型表达[18]。本研究
中, 甘蔗 SNLR 基因具有抗病基因组成型表达的特性, 叶
中表达量最高 , 茎中次之 , 而根部最低 , 也暗示着甘蔗
SNLR基因与甘蔗的某种抗性有关, 比如抗黑穗病性。
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