全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2012, 38(4): 606−613 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家现代农业产业技术体系建设项目(CARS-09)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 王述民, E-mail: smwang@mail.caas.net.cn, Tel: 010-82108567
第一作者联系方式: E-mail: xuerf@yahoo.cn, Tel: 010-82109609
Received(收稿日期): 2011-09-22; Accepted(接受日期): 2011-12-19; Published online(网络出版日期): 2012-02-13.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20120213.1108.020.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2012.00606
普通菜豆镰孢菌枯萎病抗病相关基因 PvCaM1 的克隆及表达
薛仁风 朱振东 王晓鸣 王兰芬 武小菲 王述民*
中国农业科学院作物科学研究所 / 农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程, 北京 100081
摘 要: 钙调素蛋白(calmodulin, CaM)作为植物细胞内介导多种功能的 Ca2+结合蛋白, 在调节植物的生长发育和抗
病性方面具有重要作用。利用普通菜豆(Phaseolus vulgaris L.)表达序列标签(EST)克隆了含有编码普通菜豆 CaM基因
的 cDNA序列。序列分析表明, cDNA片段长 713 bp, 命名为 PvCaM1, 具有一个 453 bp的开放阅读框(ORF), GenBank
登录号为 JN418801, 该基因编码 150个氨基酸, 预测蛋白质分子质量为 17.16 kD。蛋白质结构分析表明, PvCaM1蛋
白含有 4个 Ca2+结合结构域(EF-hand)。同源分析结果显示, PvCaM1基因与百脉根、西瓜的 CaM基因亲缘关系最近,
分别达到 77%和 76%。荧光定量 PCR分析表明, PvCaM1基因受尖镰孢菌菜豆专化型 FOP-DM01菌株诱导表达, 接
种病原菌 96 h, 抗病品种 260205根中 PvCaM1基因的表达量达到最高, 而感病品种 BRB-130达到最低, 260205叶中
PvCaM1基因的表达量均高于 BRB-130, 而且叶中的表达量高于根和茎中的表达量。PvCaM1基因表达量也受外源植
物激素脱落酸、茉莉酸甲酯和乙烯利诱导上调, 在根、茎、叶中均有不同程度的表达。本研究表明, PvCaM1基因可
能通过脱落酸、茉莉酸和乙烯等信号途径参与菜豆对 FOP-DM01菌株的防御反应, 推测菜豆 PvCaM1 基因与镰孢菌
枯萎病的抗病性有一定关联。
关键词: 普通菜豆; 镰孢菌枯萎病; PvCaM1基因; 基因表达分析
Cloning and Expression Analysis of Fusarium Wilt Resistance-Related Gene
PvCaM1 in Common Bean (Phaseolus vulgaris L.)
XUE Ren-Feng, ZHU Zhen-Dong, WANG Xiao-Ming, WANG Lan-Fen, WU Xiao-Fei, and WANG
Shu-Min*
Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences / National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement,
Beijing 100081 China
Abstract: Calmodulin (CaM) is a multifunctional Ca2+-binding protein in plant cells. It plays important roles in regulating the
growth, development and disease resistance in plants. A full-length cDNA sequence coding for CaM in common bean was cloned
based on expressed sequence tags from common bean. Sequence analysis showed that the isolated fragment was 713 bp, it con-
tained an open reading frame (ORF) of 453 bp encoding 150 amino acids with a theoretical molecular weight of 17.16 kD, desig-
nated PvCaM1 (GenBank accession number JN418801). Online ScanProsite tool analysis showed that PvCaM1 had four
Ca2+-binding domains with the function of combining with free Ca2+. Homology analysis indicated that PvCaM1 gene was similar
to CaM genes in other plant species including Lotus japonicus (CAB63264.3), watermelon (BAI52955.1), Populus (ADC80735.1)
and castor bean (XP_002533357.1)．Phylogenetic analysis based on the amino acids sequence of PvCaM1 with other nine species
showed that the protein encoded by this gene had the closest relationship with the CaM in Lotus japonicus and watermelon, the
homology were 77% and 76%, respectively. Real time-PCR analysis indicated that the expression level of PvCaM1 in the interac-
tions between the resistant cultivars and Fusarium wilt pathogen FOP-DM01 (Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli) increased
significantly and reached the peak at 96 h, however, the susceptible one touched the bottom under the same conditions. The ex-
pression level of PvCaM1 in 260205 leaves was higher than that in BRB-130 at all different time points. PvCaM1 expressed dif-
ferently in the leaves, stems and roots, the expression level in leaves was higher than that in roots and stems. Transcriptional level
of PvCaM1 was up-regulated by exogenous abscisic acid, methyl jasmonate and ethephon, but not increased significantly by
第 4期 薛仁风等: 普通菜豆镰孢菌枯萎病抗病相关基因 PvCaM1的克隆及表达 607


salicylic acid and 3-indoleacetic acid. These results suggested that PvCaM1 is probably involved in the abscisic acid, jasmonic
acid and ethylene-regulated resistant response pathways, but not closely related to the salicylic acid and 3-indoleacetic acid path-
way. The study indicated that the function of PvCaM1 should be closely related to the resistant response pathways against Fusa-
rium wilt pathogen FOP-DM01 with involvement of abscisic acid, jasmonic acid and ethylene in common bean.
Keywords: Common bean; Fusarium wilt; PvCaM1 gene; Expression analysis
菜豆镰孢菌枯萎病是由尖镰孢菌菜豆专化型
(Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli)引起的危害维管
束组织的重要土传病害。在世界范围内大部分菜豆
种植地均发现该病原菌, 其中拉丁美洲、非洲和美
国西部尤为严重, 造成巨大的经济损失[1-3]。实践证
明, 选育和合理利用抗病品种是防治普通菜豆病害
最安全、经济、有效的方法[4]。植物受生物胁迫和
环境刺激过程中, 产生一系列防御反应机制。钙离
子(Ca2+)、活性氧(ROS)、水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)、
乙烯(ET)等均是植物防御反应发生过程中重要信号
分子 , 是细胞应答外界刺激反应中重要的第二信
使。钙调素(calmodulin, 简称 CaM)是植物细胞内结
合 Ca2+的小分子蛋白质, 不同来源的 CaM在结构和
功能上都具有很高的同源性, 说明 CaM类蛋白具有
决定功能的保守结构域, CaM 在传导生物反应信号
过程中首先结合其识别的靶蛋白, 通过改变空间结
构而改变生物活性以应答细胞内 Ca2+浓度的变化 ,
从而调控生理代谢及基因表达 [5], 这些生物反应过
程与 Ca2+介导的信号传导途径存在着功能上的密切
联系。植物中存在多种 CaM 亚型(isoform), 它们编
码相同或相似的蛋白, 不同亚型 CaM基因的表达具
有器官、组织和细胞特异性[6], 这些蛋白都具有能够
与 Ca2+结合的 EF-手型结构域(EF-hand)[7]。目前, 在
苹果、藻类、苜蓿、拟南芥、马铃薯、大豆、小麦、
玉米、豌豆、蚕豆、粟等植物中都克隆到不同 CaM
基因家族[6, 8-17]。Lee等[12]从大豆中分离到 4个 CaM
亚型; Duval 等[11]从豌豆种子中鉴定了 3 个 CaM 亚
型, Ling和 Assmann[13]从蚕豆中分离纯化 CaM蛋白,
并对 CaM 在蚕豆不同组织中的分布情况做了研究,
但目前在菜豆中还未见有 CaM 基因的报道。此外,
CaM 具有多种生物学功能, 除了参与植物对病原菌
的响应, 还参与植物本身的生长发育、对渗透胁迫、
盐害、冻害等环境刺激的应答[18-19]。因此, 对 CaM
蛋白的深入研究为揭示和理解 Ca2+介导的植物抗
病、抗逆机理奠定理论基础。
我们前期以普通菜豆感病品种 BRB-130和抗病
品种 260205 为材料构建了普通菜豆抗尖镰孢菌菜
豆专化型 FOP-DM01 菌株的 cDNA-AFLP 差异表达
文库, 从中获得了大量表达序列标签(EST), 经过测
序、比对和信息注释, 获得一条与百脉根 CaM 基
因(AJ251808)相似性高达 77%的 EST 序列。本研究
以该 EST 序列为基础, 利用 RT-PCR 和 Race 技术,
克隆获得普通菜豆钙调素基因 cDNA 片段, 命名为
PvCaM1, 其开放阅读框长 453 bp (GenBank登录号
为 JN418801), 利用生物信息学方法分析 PvCaM1的
核苷酸序列及其编码蛋白质的结构特征, 采用实时
荧光定量 PCR技术揭示其在菜豆与枯萎病菌互作中
不同时间点和不同器官中的诱导表达特征, 为明确
PvCaM1 在普通菜豆与枯萎病菌互作中的功能奠定
了基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
普通菜豆(Phaseolus vulgaris L.)品种 BRB-130
和 260205, 对 FOP-DM01菌株分别表现感病和抗病,
接种病原菌 14 d后, 前者植株 80%以上表现出叶片
枯萎、褪绿等发病症状, 后者叶片正常或只有轻微
坏死症状。尖镰孢菌菜豆专化型 FOP-DM01 菌株
(Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli)由本实验室保
存。将菜豆种子播种于灭菌的营养土(黏土∶蛭石,
1∶3, V/V)中, 23~28℃温室条件下, 每日补充光照
12 h, 光照强度约 300 μmol m−2 s−1, 培养 7~10 d的
幼苗用于病原菌的接种。病原菌首先接种于含 PDA
(potato dextrose agar)培养基的培养皿(直径 9 cm)中,
25~28℃培养 7 d备用。
1.2 接种体繁殖
将玉米粉与蛭石按 1∶2 (V/V)的比例制成混合
物, 取 400 mL混合物于 1 000 mL三角瓶中, 121℃,
0.2 MPa条件下 30 min, 灭菌 2次。向玉米粉混合物
中加入 50 mL 灭菌蒸馏水, 混合均匀后接入一皿病
原菌, 25~28℃条件下培养 7~10 d, 每天摇晃三角瓶
使病原菌生长均匀。
1.3 接种方法
将接种体与灭菌的营养土按照 1∶10 的比例混
合, 取 0.01 g接种混合土悬浮于 1 mL灭菌水, 用血
球计数板计算接种混合土中病原菌的含量, 使接种
终浓度达到 5.0×106 cfu g–1, 取 50 µL悬浮液按 1∶
10、1∶100比例稀释后涂布于酸性 PDA培养基(pH
5.0)上 , 通过培养基上生长的菌落数目和相应的稀
608 作 物 学 报 第 38卷

释倍数计算每克接种土中含有病原菌的量, 进一步
验证血球计数板计算接种浓度的准确性。将 7~10 d
的菜豆幼苗移栽至上述接种混合土中, 实验条件不
变, 分别在接种后 24、48、72、96和 120 h的根部
以及 24、72 和 120 h 的茎和叶取样 , 用于检测
PvCaM1 基因在不同器官中的表达量, 以移栽于未
接种病原菌混合土相应时间点的菜豆根、茎、叶为
对照。参照 Brendan等[20]和 Leon-Reyes等[21]的方法
用 100 µmol L–1吲哚乙酸(IAA)、100 µmol L–1脱落
酸(ABA)、100 µmol L–1茉莉酸甲酯(MeJA)、100 µmol
L–1水杨酸(SA)、0.01% (W/V)乙烯利(ETH)浸泡生长
7~10 d的菜豆 BRB-130的根组织 2~3 min, 将处理
后的菜豆幼苗移栽至灭菌营养土中, 分别在处理后
0、3、6、12、24、48 和 96 h 从根部取样, 以分别
浸泡于 0.001% (W/V)乙醇溶液和 0.015% (V/V) Sil-
wet L77的菜豆根为对照。将剪取的样品迅速置液氮
中, −80℃保存备用。
1.4 总 RNA的提取与 cDNA合成
采用 Trizol试剂(TianGen, China)提取处理和对
照各时间点样品的总 RNA, 按照 Reverse Trans-
criptase System试剂盒(Promega, USA)操作说明书合
成第一链 cDNA, 反转录引物采用 Oligo d(T)15。
1.5 PvCaM1基因的克隆
从本实验室构建的 cDNA-AFLP 差异表达文库
中获得的一条 EST序列 CBFi59, 片段长 187 bp, 位
于 PvCaM1基因开放阅读框(ORF)第 236~422位, 不
具有完整的 5′末端和 3′末端序列。以此为模板设计
基因特异引物进行 3′cDNA 末端快速扩增(3′-Full
RACE Kit, TaKaRa, Japan), 使用 5′-Full RACE Kit
(TaKaRa, Japan)克隆 PvCaM1 基因的 5′末端 cDNA
序列。基因特异引物 3′-GSP1 (5′-TGAGTCCTGAGT
AACGTCTTCG-3′)和 3′-GSP2 (5′-ACGTCTTCGAT
CAGAACCGC-3′)作为上游引物 , 试剂盒中的
3′RACE Outer Primer和 3′RACE Inner Primer作为下
游引物。3′-GSP1 用于 3′末端的第一轮 PCR 扩增,
3′-GSP2 用于第二轮 PCR 扩增。将 3′RACE 获得的
序列送上海生工生物工程有限公司测序, 将得到的
序列与原有的 EST序列拼接。根据拼接序列设计引
物 5′-GSP1 (5′-AGTGATGAATGGATTCGGAT-3′)和
5′-GSP2 (5′-AACAGAGTAATGAAGGAAGA-3′), 以
菜豆根组织所提 RNA反转录的 cDNA为模板, 进行
5′cDNA 末端的快速扩增, PCR 程序为 94℃ 3 min;
94℃ 30 s, 53℃ 30 s, 72℃ 1 min, 30个循环; 72℃延
伸 10 min。将回收的 PCR产物克隆至 pDM18-T载
体(TaKaRa, Japan), 送上海生工生物工程有限公司
测序, 将扩增序列与已知序列拼接, 获得含有完整
开放阅读框的 cDNA 序列, 根据预测的开放阅读框,
设计引物 CAM1 (5′-ATGGAGGCGGTGGAGCTGAA-
3′)和CAM2 (5′-TTAACCAAGACCAGAGAATC-3′),
采用相同的 PCR程序获得完整的 PvCaM1基因开放
阅读框序列, 将回收的 PCR 产物克隆至 pDM18-T 载
体, 送上海生工生物工程有限公司测序。
1.6 PvCaM1序列分析
利用 NCBI 中 Blastn 程序(http://www.ncbi.nlm.
nih.gov/BLAST/)、氨基酸序列翻译工具 (http://au.
expasy.org/tools/dna.html)、蛋白质理化参数计算工
具 (http://expasy.org/tools/protparam.html), 蛋白质一级
结构分析工具 (http://www.expasy.org/tools/scanpro-
site/)、信号肽预测工具 SignalP (http://www.cbs.dtu.
dk/services/SignalP/)、蛋白质跨膜结构域预测工具
(http://gen-ome.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)、蛋白
质疏水结构预测工具(http://us.expasy.org/tools/protsc-
ale.html)、二级结构预测工具(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/
psipred)、三级结构预测工具(http://swissmodel.expasy.
org/workspace/index.php?func=modelling_imple1)等在
线软件对PvCaM1进行序列分析。根据推测的 PvCaM1
氨基酸序列, 利用ClustalX 1.83和MEGA4.0软件分别
进行氨基酸序列同源性比对和进化树分析。
1.7 实时荧光定量 PCR分析基因表达量
根据 PvCaM1的 cDNA序列设计定量 PCR引物
(F: 5′-ACGTCTTCGATCAGAACCGC-3′; R: 5′-GTC
CACTTTCACGATCATCT-3′)。以普通菜豆的 Actin
基因作为内参 , 扩增引物 (F: 5′-GAAGTTCTCTTC
CAACCATCC-3′; R: 5′-TTTCCTTGCTCATTCTGT
CCG-3′)。用 SuperReal PreMix (SYBR Green, Tian-
Gen, China)荧光定量 PCR 试剂和 ABI PRISM7300
实时定量 PCR仪以各个取样点的 cDNA为模板进行
PvCaM1基因的 Real-time PCR分析。反应体系与程
序参照试剂说明。反应结束后分析荧光值变化曲线
和融解曲线, 以 PCR 产物电泳确认扩增产物特异
性。采用 2−ΔΔCT 法分析数据, 确定基因的相对表达
量。每个取样点设 3个重复, 在同一个批次完成内参
基因和目标基因的 PCR反应, 试验重复 3次。
2 结果与分析
2.1 PvCaM1基因的克隆和序列分析
利用 RT-PCR 和 RACE 技术克隆到一条长为
第 4期 薛仁风等: 普通菜豆镰孢菌枯萎病抗病相关基因 PvCaM1的克隆及表达分析 609


713 bp 的 cDNA 片段, 并命名为 PvCaM1。经 ORF
finder预测, 该片段具有一个完整的开放阅读框。利
用 CAM1和 CAM2引物扩增得到一个完整的普通菜
豆 CaM 基因开放阅读框序列。结果显示, 该 cDNA
片段第 208~660 个核苷酸组成 PvCaM1 基因的开放
阅读框, 长 453 bp, 编码 150个氨基酸组成的蛋白质
(图 1)。



图1 PvCaM1的核苷酸序列及其推测的氨基酸序列
Fig. 1 Analysis of nucleotide and predicted amino acid
sequences of PvCaM1
粗斜体字示起始密码子、终止密码子; 阴影部分为EF-hand结构
域; 矩形代表酪蛋白激酶II的磷酸化位点; 下画线表示N端十四
酰基化位点。
Initiation and the stop codons of PvCaM1 are shown by bold and
italic letters. Shadow regions are EF-hand domains. Rectangles
indicate Casein kinase II phosphorylation site. N-myristoylation
sites are underlined.

2.2 PvCaM1编码蛋白质序列的分析
PvCaM1 所编码蛋白质的预测分子量为 17.16
kD, 理论 pI 值为 4.27, 含有 4 个 EF-hand 保守结构
域, 分别在 14至 25位、50至 61位、88至 98位和
125至 136位氨基酸, 每个 EF-hand内都有 Ca2+结合
位点。蛋白质结构预测结果表明, 该蛋白不含跨膜
区 , 无明显的疏水结构域 , 无信号肽序列 , 不属于
分泌蛋白。PvCaM1 的氨基酸序列与百脉根(CAB-
63264.3)、西瓜(BAI52955.1)、胡杨(ADC80735.1)、
蓖麻(XP_002533357.1)等植物的 CaM 基因所编码蛋
白质的氨基酸序列均具有较高的相似性, 二级结构
预测表明 PvCaM1 含有 8 个 α-螺旋结构, 其余为
Loop 结构, 不具有 β-折叠结构, 三级结构预测结果
显示 PvCaM1主要是以 α-螺旋结构为主, α-螺旋之间
以 Loop 相连。系统进化树分析结果表明 (图 2),
PvCaM1 与百脉根的 CaM 基因的亲缘关系最近, 达
到 77%, 与西瓜次之, 达到 76%。目前在大豆、豌豆
等豆类作物中都克隆了不同 CaM基因家族[11-12], 但
在普通菜豆中尚无 CaM基因的报道。
2.3 PvCaM1基因的诱导表达分析
2.3.1 病原菌诱导 PvCaM1 基因表达分析 在菜
豆与尖镰孢菌菜豆专化型 FOP-DM01菌株互作的过
程中, 接种后 24 h抗病品种 260205根中 PvCaM1表
达量上调至 1.5 倍, 显著高于感病品种 BRB-130;
PvCaM1 在 48 和 72 h 表达受到抑制, 在 BRB-130
和 260205中表达量均下调; BRB-130在 96 h表达量
达到最低, 而在 260205 中的表达量却迅速升高, 达
到对照的 3 倍左右, 之后表达量有所下降, 约为 1.5
倍, 但仍显著高于 BRB-130中的表达量(图 3-A); 在
接种病原菌后的各时间点 , PvCaM1 在抗病品种
260205 叶中的表达量均高于感病品种 BRB-130, 其
中在 96 h 达到最高, 上调约 6.5 倍, 而在 BRB-130
叶中的表达量在各时间点上调均在 2倍以下(图 3-B),
结果表明, PvCaM1基因的转录表达受 FOP-DM01菌
株的诱导。
2.3.2 外源激素诱导 PvCaM1 基因表达分析 利
用不同外源激素处理 BRB-130 菜豆根 , 荧光定量
PCR 分析结果表明 (图 4), 乙烯利处理 48 h 前 ,
PvCaM1表达量无明显的变化, 48 h表达量迅速上升
至最大值, 上调约 5倍, 随后 96 h急剧下降; 茉莉酸
甲酯处理 12 h使其表达量迅速上升, 达到 4倍左右,
之后迅速下降, 96 h 再次迅速升高, 达到 5 倍左右;
脱落酸处理仅 3 h, 其表达量就达到最大值, 上调约
6.8倍, 此后各时间点 PvCaM1的表达量一直维持在
较低的水平, 直到 48 h再次迅速上升, 达到 4.8倍。
水杨酸和吲哚乙酸处理后, 所有时间点的表达量均
无显著变化, 表明 PvCaM1 基因可能通过茉莉酸、
乙烯和脱落酸介导的信号传导途径诱导菜豆的防御
反应, 而水杨酸和吲哚乙酸可能并非是 PvCaM1 基
因参与调节的防御反应中关键的信号分子。
2.3.3 PvCaM1 基因组织表达分析 采用荧光定
量 PCR 技术分析表明, 该基因在根、茎、叶中均有
不同程度的表达(图 5), 抗病品种 260205只是在 72 h
根中的表达量略低于 BRB-130, 其余样品中的表达
量均高于感病品种 BRB-130, 其中 PvCaM1 基因在
叶中表达量最高, 差异也最显著。
610 作 物 学 报 第 38卷



图 2 PvCaM1 蛋白质与 9 个其他来源的 CaM 的进化关系分析
Fig. 2 Phylogenesis of PvCaM1 protein and 9 CaM from other species
进化树分支处的数字代表 Bootstrap值(重复抽样次数为 500)。直线标尺代表 5%序列差异。
Numbers on branch nodes are bootstrap values (500 resamplings). Bar represents 5% sequence divergence.



图 3 PvCaM1 在菜豆与 FOP-DM01 菌株互作中不同时间点的表达
Fig. 3 Expression level of PvCaM1 in interaction between beans and FOP-DM01 at different times post inoculation
A: PvCaM1在根中的表达; B: PvCaM1在叶中的表达; 不同字母代表 BRB-130与 260205之间的表达水平差异显著(P < 0.05)。
A: expression degree of PvCaM1 in roots; B: expression degree of PvCaM1 in leaves; different letters above bars indicate a significant difference of
expression (P < 0.05) between BRB-130 plants and 260205 plants.

3 讨论
CaM 是植物细胞内高度保守的 Ca2+结合蛋白,
是植物细胞中 Ca2+介导的信号传导途径中的主要
组分 , 它通过结合并调控许多下游蛋白的活性或
功能来调节细胞的生理功能 , 如蛋白激酶 , Ca2+通
道等[22-23]。不同的研究者已经从多种植物中分离或
克隆出 CaM基因, 植物中的 CaM存在多种亚型, 不
同 CaM 亚型分别介导不同生物功能的信号传导途
径, 从而使得 CaM在生物体复杂多样的代谢途径中
发挥重要的作用[6,8-17]。为研究普通菜豆镰孢菌枯萎
病抗病相关基因, 本研究从普通菜豆中分离出 1 个
与菜豆抗病性相关的 CaM基因, 该基因编码的蛋白
质具有 4 个完整 Ca2+结合域, 相对于已经鉴定或克
隆到的不同来源的 CaM 基因在核苷酸和氨基酸水
平上都有较大的差异 , 因此可以确定为一个新的
CaM基因, 定名为 PvCaM1。
病原与寄主互作过程中植物 CaM 基因都可以
被诱导表达。例如大豆细菌性斑点病原菌(Pseudo-
monas syringae pv. glycinea)诱导大豆 SCaM-4 和
SCaM-5基因表达[24]。烟草花叶病毒(tobacco mosaic
virus, TMV)侵染烟草叶片后可引起 NtCaM1、
NtCaM2 和 NtCaM13 基因的表达上调, 同时诱导
PR-1 和 PR-3 等防御基因的表达[25]。小麦受叶锈病
菌侵染过程中, 钙调素 TaCaM2-3、TaCaM 4-1、
CaMSF-1 和 CaMSF-4 表达量明显上调 , 可能
第 4期 薛仁风等: 普通菜豆镰孢菌枯萎病抗病相关基因 PvCaM1的克隆及表达分析 611




图 4 不同外源激素诱导普通菜豆根中 PvCaM1 基因表达水平分析
Fig. 4 Expression analysis of PvCaM1 in roots of common bean induced by different hormones in vitro
SA: 水杨酸; ETH: 乙烯利; MeJA: 茉莉酸甲酯; IAA: 吲哚乙酸; ABA: 脱落酸; 不同字母代表不同激素处理后的
表达水平差异显著(P < 0.05)。
SA: salicylic acid; ETH: ethephon; MeJA: methyl jasmonate; IAA: 3-indoleacetic acid; ABA: abscisic acid; different letters above bars
indicate a significant difference of expression (P < 0.05) after treatments by different hormones.



图 5 PvCaM1 在普通菜豆不同器官中表达水平
Fig. 5 Transcription level of PvCaM1 in different organs of
common bean
不同字母代表BRB-130与260205之间的表达水平差异显著(P < 0.05)。
Different letters above bars indicate a significant difference of
expression (P < 0.05) between BRB-130 plants and 260205 plants.

参与了小麦抗叶锈病相关应答途径[26], TaCaM5 亚
型则是与小麦抗条锈病菌相关的基因[27]。玉米在大
斑病菌产生的HT毒素胁迫下, CaM基因参与了玉米
的防卫应答反应[17]。Herman等[28]利用绿色荧光蛋白
(green fluorescence protein, GFP)技术研究了枯萎病
菌在甜瓜中的侵染过程, 抗病反应大约在第 3 天被
激发 , 即病菌侵入根部 , 通过皮层 , 试图到达木质
部时被激发。本研究表明, 病原菌侵染 96 h 后, 诱
导寄主产生的抗病反应最强烈, 研究结果与甜瓜相
似, 因此推测 PvCaM1 参与了细胞内由 Ca2+介导的
抗病反应, 细胞内 Ca2+可能是枯萎病抗病途径中很
重要的信号分子。植物的系统获得抗性(systematic
acquired reaction, SAR)是植物体抵抗外界病原物侵
染非常重要的抗病机制 , 主要通过水杨酸或茉莉
酸、乙烯、脱落酸等激素信号分子介导抗病信号在
抗病途径中的传导[29-32]。CaM是介导植物细胞内多
种信号传导途径的重要分子, 本研究中 PvCaM1 对
茉莉酸甲酯、乙烯利和脱落酸均有明显的响应, 可能
参与了茉莉酸、乙烯和脱落酸介导的抗病相关反应。
植物 CaM 基因的表达具有组织和各种发育时
期的特异性。CaM广泛地分布于几乎所有已知的真核
生物中, 但在不同组织、器官和原生质体中, 或不同的
生长期, 含量都不同, 分布也存在差异[12,15,33-34]。研究
表明, 大豆[12]、马铃薯[15]和小麦[33]发育过程中不同
器官 CaM 基因的表达有差异。黄花梨 CaM 基因在
子房和幼果中大量表达, 表达的部位主要集中在果
皮、果肉、胚珠、维管束、细胞间隙及胞间层, 可
能与果实钙的增加有一定关系[34]。本研究表明 Pv-
CaM1在普通菜豆根、茎、叶中均有表达, 表达量在
叶部最高, 茎部和根部较低, 抗、感品种间有很明显
的差异 , 叶部差异最显著 , 因此推测在菜豆受
FOP-DM01 菌株侵染的过程中叶部发生的抗病反应
可能比根和茎更强烈[20]。
本研究结果表明, PvCaM1基因的表达能够被尖
镰孢菌菜豆专化型 FOP-DM01 菌株显著诱导, 作为
普通菜豆细胞内 Ca2+信号转导的重要信使, PvCaM1
基因可能具有十分重要的功能, 关于其在菜豆与病
原菌的互作中如何发挥抵抗病原菌侵染的功能, 我
们将通过转基因技术和 RNAi技术进一步验证。
4 结论
从普通菜豆中克隆出一个编码钙调素蛋白的基
因, 命名为 PvCaM1。PvCaM1蛋白是在普通菜豆中
612 作 物 学 报 第 38卷

首次报道的植物钙调素蛋白。PvCaM1 基因能够被
尖镰孢菌菜豆专化型 FOP-DM01 菌株诱导表达, 而
且在不同器官中表达量不同, 叶片中的表达量显著
高于茎和根中的表达量, 推测 PvCaM1 参与调控菜
豆抗枯萎病的抗性反应。PvCaM1 受枯萎病菌诱导
表达 , 不依赖水杨酸和吲哚乙酸介导的信号通路 ,
可能通过茉莉酸、乙烯和脱落酸等信号途径参与了
防御反应。
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