全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2012, 38(5): 791−799 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-09)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 王述民, E-mail: smwang@mail.caas.net.cn, Tel: 010-82108567; 朱振东, E-mail: zhuzd115@caas.net.cn, Tel:
010-82109609
第一作者联系方式: E-mail: xuerf@yahoo.cn, Tel: 010-62175628
Received(收稿日期): 2011-11-14; Accepted(接受日期): 2012-01-19; Published online(网络出版日期): 2012-03-05.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20120305.1037.005.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2012.00791
应用荧光定量 PCR技术分析普通菜豆品种中尖镰孢菜豆专化型定殖量
薛仁风 1 朱振东 1,* 黄 燕 1,2 王晓鸣 1 王兰芬 1 王述民 1,*
1中国农业科学院作物科学研究所 / 农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程, 北京 100081; 2河北科技师范学院生命科技学院,
河北昌黎 066600
摘 要: 尖镰孢菜豆专化型(Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli)引起的菜豆枯萎病是菜豆生产中最严重的维管束类病
害之一, 防治该病害有效方法是利用抗病品种。因此, 一种能够从菜豆受侵染组织中准确鉴定并定量检测枯萎病原菌
含量的方法将有助于筛选抗性品种, 应用于普通菜豆枯萎病抗病育种。本研究基于荧光定量 PCR技术开发出一种能
够对定殖于菜豆组织中的枯萎病原菌准确定量的新方法。该技术对根、茎组织中病原菌DNA的最低检测量为 1 pg, 能
在接种病原菌 6 d 后明显区分抗病性不同的品种, 可在菜豆植株表现出明显发病症状前准确鉴定不同品种抗性水平
的差异。经验证参试的感病品种 BRB-130和 A0640-1根、茎组织中定殖的病原菌 DNA量显著高于抗病品种 260205
和黑芸豆, 与表型鉴定的结果完全符合。利用荧光定量 PCR技术能够在病原菌侵染早期快速、准确、高效定量菜豆
组织中定殖的病原菌, 这对指导菜豆抗病育种和植物病害传播的研究都具有非常重要价值。
关键词: 普通菜豆; 镰孢菌枯萎病; 荧光定量 PCR; 定量分析
Quantification of Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli Detected by Real-time
Quantitative PCR in Different Common Beans Cultivars
XUE Ren-Feng1, ZHU Zhen-Dong1,*, HUANG Yan1,2, WANG Xiao-Ming1, WANG Lan-Fen1, and WANG
Shu-Min1,*
1 Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences / National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement,
Beijing 100081, China; 2 College of Life Science and Technology, Hebei Normal University of Science & Technology, Changli 066600, China
Abstract: Fusarium wilt, caused by Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli, is one of the most devastating vascular diseases of
common bean. A efficient way to prevent and control the disease is to use resistant cultivars, so it is necessary to develop a rapid
accurate method for detecting the pathogens. In this study, we developed a real-time quantitative polymerase chain reaction
(qRT-PCR) protocol that quantified F. oxysporum f. sp. phaseoli DNA to a minimum of 1 pg in the plant roots and stems. More-
over, the qRT-PCR protocol asymptomatically distinguished resistant level of different bean cultivars challenged by the wilt
pathogen FOP-DM01 at 6 d post inoculation. The result indicated FOP-DM01 DNA quantifications in the roots and stems of sus-
ceptible BRB-130 and A0640-1 were significantly higher than those in resistant 260205 and Heiyundou, which absolutely
matched with the phenotypic identification. The use of this protocol for fast, reliable, and cost-effective quantification of F. ox-
ysporum f. sp. phaseoli in asymptomatic tissues at early stages of the infection process is of great value for common bean breed-
ing and studies of phytopathology and epidemiology.
Keywords: Common bean; Fusarium wilt; Real time-PCR; Quantitative analysis
普通菜豆(Phaseolus vulgaris L.)是全球最重要
的食用豆类之一, 是人类摄取蛋白质(约占 22%)、维
生素(叶酸为主)和矿质元素(Ca、Cu、Fe、Mg、Mn、
Zn)的重要来源 [1]。由尖镰孢菜豆专化型(Fusarium
oxysporum f. sp. phaseoli)引起的普通菜豆镰孢菌枯
萎病是最严重的维管束类病害之一, 大部分菜豆种
植地均能分离到该病原菌, 在非洲、拉丁美洲和美
国西部都引起了很大的经济损失[2]。
792 作 物 学 报 第 38卷

寄主组织中定殖的病原菌的检测和定量分析是
研究寄主抗性机制及水平的重要手段。传统的病害级
别评价方法通常是记录植物所表现出的发病严重程度
或通过记录植物存活的比例来反映植物的抗性水
平[3]。然而, 这些方法在病级评价水平上都存在缺陷,
通常以观察到的发病症状作为病级评价的依据, 某种
程度上限制了在病原侵染早期没有明显症状情况下对
寄主抗病性的评价, 其次观察者的主观性也是影响评
价结果的重要因素。病原在寄主内部侵染的程度也并
不总是与寄主所表现出的发病症状直接相关[4-5], 有些
材料虽然不能显著抑制病原在受侵染组织中的生长,
但也不表现出典型的发病症状[6-7]。因此, 在抗病资源
的筛选及抗病性鉴定中迫切需要一种更准确、直接评
价病原菌在寄主组织内生长情况的方法。
近年来, PCR 技术已经成功地应用于病原菌的
检测和鉴定[8]。在众多 PCR 技术中, 荧光定量 PCR
是一种操作简单而且可信度高的定量技术, 该技术
被广泛应用于病毒、细菌、真菌等植物病原微生物
的定量分析[9-13], 核心是在 PCR 扩增过程中通过检
测荧光信号的强弱对模板进行定量分析。未知样品
中的 DNA可以通过与平行反应的比较相对定量[14]。
因此, 荧光定量 PCR技术是一种更准确、效率更高
的定量分析方法, 尤其是在检测差异很小的样本时
优势更加突出[15]。
Alves-Santos 等[16]开发出一个 SCAR 标记 B310/
A280 用于鉴定强致病力的 F. oxysporum f. sp.
phaseoli 菌株。这个标记位于 F. oxysporum f. sp.
phaseoli 基因组中 ftf1 基因启动子(promoter)的序列
内部。研究表明, F. oxysporum f. sp. phaseoli中的 ftf1
基因编码一个新型的转录因子, 该转录因子仅在 F.
oxysporum f. sp. phaseoli与菜豆互作的过程中被显
著诱导表达 , 其表达水平与 F. oxysporum f. sp.
phaseoli 致病力密切相关[17-18]。因此, ftf1 基因是开
发 F. oxysporum f. sp. phaseoli鉴定和检测引物的一
个很好的参考基因。本研究根据 ftf1 基因开放阅读
框(ORF)序列设计特异性检测引物 , 开发出一种将
荧光定量 PCR技术用于检测被侵染寄主组织中病原
菌定殖量的方法, 为其应用于病原菌的鉴定和抗性
资源的筛选打下基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试普通菜豆品种 BRB-130、A0640-1、260205、
黑芸豆由中国农业科学院作物科学研究所提供。我们
前期研究表明, 这 4 个品种对尖镰孢菜豆专化型 FOP-
DM01 菌株具有不同的抗性, 其中 BRB-130、A0640-1
为感病品种, 260205和黑芸豆为抗病品种。将菜豆种
子播种于灭菌的营养土(黏土∶蛭石为 1 3, ∶ V/V)中,
23~28℃条件下, 每日补充 12 h 光照, 培养 7~10 d
的幼苗用于接种。
供试菌株均由本实验室保存(表1), 其中FOPDM01
菌株用于接种。病原菌首先接种于 PDA 平板上 ,
25~28℃培养 7 d备用。
1.2 接种与 DNA样品的采集
参照薛仁风等[19]方法接种, 分别在接种后 2、4
和 6 d于根、茎取样 400~500 mg, 剪取的组织样品
经 0.5% (V/V) NaClO表面灭菌 1.5 min, 灭菌蒸馏水
冲洗 , 灭菌滤纸擦干 , 用液氮研磨成粉末 , 置于
−80℃条件下保存用于 DNA 的提取, 每个处理重复
3 次。另取各供试菌株的菌丝 100 mg 冻存于−80℃
条件下用于 DNA的提取。
1.3 引物设计及其特异性检测
根据 F. oxysporum f. sp. phaseoli与致病力紧密
相关的 ftf1 基因(DQ280313)的开放读码框(ORF)序
列 [17], 利用引物在线设计软件 Primer 3.0 (http://
simgene.com/Primer3)设计 1对病原菌检测引物并由英潍
捷基(上海)贸易有限公司合成, 命名为 QFopA/QFopB。
利用本实验室保存的 50 个供试菌株(表 1)验证引物
QFopA/QFopB 的特异性, 以引物 ITS1 (5′-TCCGT
AGGTGAACCTGCGG-3′)和 ITS4 (5′-TCCTCCGC
TTATTGATATGC-3′)扩增产物作为对照鉴定 DNA
模板的质量。PCR 反应采用 20 µL 反应体系, 含
100 ng真菌 DNA、2 mmol L–1 Mg2+、0.25 mmol L–1
dNTPs、上下游引物各 0.25 µmol L–1、0.5 U Taq DNA
聚合酶(Dingguo, 中国); PCR 程序为 94℃ 3 min;
94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 1 min, 30个循环; 72℃延
伸 10 min。
1.4 DNA 标准曲线的绘制和特异性引物灵敏度
的测定
参照 Silvar 等[20]的方法, 略有修改, 提取供试
菌株和菜豆组织 DNA。用 Nanodrop 2000 Spectro-
hotometer (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA)
测定 DNA 样品的浓度 , 并于 −20℃保存。将
FOP-DM01菌株DNA制备成 50 ng μL–1浓度的溶液,
并按照 1 1∶ 、1 10∶ 、1 10∶ 2、1 10∶ 3、1 10∶ 4、1 10∶ 5
的浓度梯度稀释, 分别用灭菌去离子水、根 DNA溶
第 5期 薛仁风等: 应用荧光定量 PCR技术分析普通菜豆品种中尖镰孢菜豆专化型定殖量 793


液、茎 DNA溶液将 FOP-DM01菌株 DNA溶液分别
稀释成 50、5、5×10–1、5×10–2、5×10–3和 5×10–4 ng
μL–1共 6个梯度浓度。以 2 μL各个梯度的 DNA溶
液作为模板, 用ABI PRISM7900实时定量 PCR仪进
行荧光定量 PCR 扩增, 每个浓度重复 3 次, 背景分
别为灭菌去离子水和 100 ng 菜豆根、茎 DNA。以
CT值为纵坐标, DNA样品浓度的对数值为横坐标作
图, 绘制 DNA标准曲线及计算回归方程、确定特异
性检测引物的灵敏度及优化 PCR 反应的扩增效率
(AE=10–1/s–1, s为斜率) [21-22]。PCR反应体系含 2 µL
DNA溶液、10 µL SuperReal PreMix (SYBR Green,
TIANGEN, 中国)、上下游引物各 0.2 µmol L–1、2 µL
ROX溶液, 补水至 20 µL。反应程序如下, 95℃反应
15 min, 40次循环包括 95 ℃ 反应 10 s、60℃反应
30 s、85℃反应 31 s, 反应结束后绘制溶解曲线, 程
序如下, 95℃反应 15 s, 60℃反应 30 s, 以 0.5℃/10 s
的速度缓慢升温至 95℃反应 15 s, 各反应均在波长
520 nm处测定荧光吸收值。
1.5 荧光定量 PCR 技术检测菜豆组织中病原菌
的定殖量
将不同品种菜豆根和茎的 DNA 样品均制备成
浓度为 50 ng μL–1的溶液, 以 2 μL DNA溶液为模板,
通过荧光定量 PCR测定 DNA样品的 CT值, 根据回
归方程的公式计算出 100 ng 菜豆组织中的病原菌
DNA 含量, 反应体系和程序与 1.4 相同。为了确定
扩增反应的效率和特异性, 绘制溶解曲线并将荧光
定量 PCR 反应产物通过 1.0%TBE 琼脂糖凝胶电泳
鉴定, 并以灭菌去离子水和等量菜豆不同组织 DNA
模板作为对照, 验证扩增产物的特异性。
1.6 发病情况调查与评价
采用 1~9级的病级评价标准[23]。在接种后每天记
录发病植株的病级, 实验共设 3个重复, 每个重复 4~5
棵菜豆幼苗, 计算平均发病级别和病情指数。平均发
病级别=∑发病级别/调查总株数; 病情指数=∑(发病级
数×相应的发病植株数)/(9×植株总数)×100。
1.7 数据分析
采用 SAS 统计分析软件[24]中 LSD 法进行单因
素方差分析, 采用 Microsoft Excel 2003软件绘制标
准曲线和计算回归方程。
2 结果与分析
2.1 引物设计及特异性检测
根据 ftf1 基因的开放读码框序列设计引物
QFopA/QFopB, 利用供试的 50个菌株(表 1)验证设计
引物的特异性 , 结果表明所设计的引物 QFopA/
QFopB (5′-ACATAGCGGTCTACCGTTCG-3′/5′-GGTT
ACAGGAAGCCAAACCA-3′)只能在对菜豆具有致
病性的菌株中扩增出 149 bp的条带, 而在非致病菌
株及其他对照真菌菌株中均没有特异性扩增条带
(图 1), 说明引物 QFopA/QFopB具有很好的特异性,
可以用于菜豆枯萎病原菌的鉴定及定量检测。
2.2 绘制 DNA 标准曲线及测定特异性引物的灵
敏度
以灭菌去离子水和菜豆根、茎 DNA为背景的回
归方程 R2值均在 0.98 以上(图 2), 表明结果可信度
很高, 扩增效率 1.1~1.2, 接近于 1 (扩增效率 100%),
表明扩增效率接近理想状态。
在本实验设计的 PCR 扩增条件下 , QFopA/
QFopB引物能够最低检测到 1 pg的病原菌DNA, 其
CT值均在 35左右, 因此CT=35被认为是适合定量检
测病原菌 DNA的阈值, 因为具有过大 CT值 PCR体
系扩增效率是较低的。
2.3 不同菜豆品种间病原菌定殖量的检测
利用荧光定量 PCR技术测定 100 ng DNA样品
的 CT值, 并根据相应组织背景下的回归方程计算出
100 ng DNA 样品中病原菌 DNA 的含量, 推算出
1 ng菜豆 DNA中含有的病原菌 DNA量, 即定殖的
病原菌 DNA 的含量(图 3)。结果表明, 接种病原菌
后 2 d和 4 d FOP-DM01菌株在 4个品种菜豆根中的
定殖量没有明显的差异, 抗病品种 260205和黑芸豆
中的定殖量约为 0.15 pg ng–1, 略高于感病品种
BRB-130和 A0640-1中的定殖量 0.08 pg ng–1, 而茎
中的定殖量, 2 d后 BRB-130中达到 0.06 pg ng–1, 显
著高于其他 3个品种, 4 d后 BRB-130和 A0640-1中
的定殖量分别达到 0.07 pg ng–1和 0.06 pg ng–1, 均高
于 260205 和黑芸豆。接种病原菌 6 d 后, BRB-130
和 A0640-1 根中的定殖量分别达到 1.04 pg ng–1和
0.85 pg ng–1, 茎中分别达到0.14 pg ng–1和0.09 pg ng–1,
均显著高于病原菌在 260205和黑芸豆中的定殖量。
2.4 不同品种普通菜豆发病级别的调查
图 4 表明, 接种 FOP-DM01 菌株初期 4 个品种
均未表现出明显的发病症状或仅有轻微的枯萎病
斑。接种 7 d后, 感病品种 BRB-130和 A0640-1表
现出明显的叶片枯萎, 褪绿变黄等发病症状, 而抗
病品种 260205 和黑芸豆仅少数植株表现出轻微的
发病症状。接种 23 d后, BRB-130和 A0640-1的平
794 作 物 学 报 第 38卷

表 1 供试菌株
Table 1 Fungal strains used in this work
菌株编号
Accession
菌株
Isolate
寄主
Host
来源
Source
致病性 1)
Pathogenicity 1)
PCR鉴定 2)
PCR assay 2)
FOP-DM01 F. oxysporum f. sp. phaseoli Phaseolus vulgaris 黑龙江 Heilongjiang, China + +
FOP-DM02 F. oxysporum f. sp. phaseoli P. vulgaris 黑龙江 Heilongjiang, China + +
FOP-DM03 F. oxysporum f. sp. phaseoli P. vulgaris 黑龙江 Heilongjiang, China + +
FOP-DM04 F. oxysporum f. sp. phaseoli P. vulgaris 黑龙江 Heilongjiang, China + +
FOP-DM05 F. oxysporum f. sp. phaseoli P. vulgaris 黑龙江 Heilongjiang, China + +
FOP-DM06 F. oxysporum f. sp. phaseoli P. vulgaris 黑龙江 Heilongjiang, China + +
FOP-DM07 F. oxysporum f. sp. phaseoli P. vulgaris 黑龙江 Heilongjiang, China + +
FOP-DM08 F. oxysporum f. sp. phaseoli P. vulgaris 黑龙江 Heilongjiang, China + +
FOP-DM09 F. oxysporum f. sp. phaseoli P. vulgaris 黑龙江 Heilongjiang, China + +
FOP-DM10 F. oxysporum f. sp. phaseoli P. vulgaris 黑龙江 Heilongjiang, China + +
FOP-DM11 F. oxysporum f. sp. phaseoli P. vulgaris 黑龙江 Heilongjiang, China + +
FOP-HN01 F. oxysporum f. sp. phaseoli P. vulgaris 黑龙江 Heilongjiang, China + +
FOP-S1 F. oxysporum f. sp. phaseoli P. vulgaris 黑龙江 Heilongjiang, China + +
FOP-S9 F. oxysporum f. sp. phaseoli P. vulgaris 黑龙江 Heilongjiang, China + +
FOP-BCH01 F. oxysporum f. sp. phaseoli P. vulgaris 吉林 Jilin, China + +
FOP-BCH02 F. oxysporum f. sp. phaseoli P. vulgaris 吉林 Jilin, China + +
FOP-BCH03 F. oxysporum f. sp. phaseoli P. vulgaris 吉林 Jilin, China + +
FOP-YN02 F. oxysporum f. sp. phaseoli P. vulgaris 中国云南 Yunnan, China + +
FOP-YN03 F. oxysporum f. sp. phaseoli P. vulgaris 中国云南 Yunnan, China + +
FOP-YN04 F. oxysporum f. sp. phaseoli P. vulgaris 中国云南 Yunnan, China + +
FOP-YN05 F. oxysporum f. sp. phaseoli P. vulgaris 中国云南 Yunnan, China + +
FOP-YN06 F. oxysporum f. sp. phaseoli P. vulgaris 中国云南 Yunnan, China + +
FOP-YN07 F. oxysporum f. sp. phaseoli P. vulgaris 中国云南 Yunnan, China + +
FOP-YN08 F. oxysporum f. sp. phaseoli P. vulgaris 中国云南 Yunnan, China + +
FOP-YN09 F. oxysporum f. sp. phaseoli P. vulgaris 中国云南 Yunnan, China + +
FOP-KL01 F. oxysporum f. sp. phaseoli P. vulgaris 中国山西 Shanxi, China + +
FOP-KL02 F. oxysporum f. sp. phaseoli P. vulgaris 中国山西 Shanxi, China + +
FOP-KL03 F. oxysporum f. sp. phaseoli P. vulgaris 中国山西 Shanxi, China + +
FOP-BSH01 F. oxysporum f. sp. phaseoli P. vulgaris 中国河北 Hebei, China + +
FOP-BSH02 F. oxysporum f. sp. phaseoli P. vulgaris 中国河北 Hebei, China + +
FOP-WSH01 F. oxysporum f. sp. phaseoli P. vulgaris 北京 Beijing, China + +
FOP-WSH02 F. oxysporum f. sp. phaseoli P. vulgaris 北京 Beijing, China + +
FOP-SHY01 F. oxysporum f. sp. phaseoli P. vulgaris 北京 Beijing, China + +
FOP-SHY02 F. oxysporum f. sp. phaseoli P. vulgaris 北京 Beijing, China + +
NP-DM02 F. oxysporum P. vulgaris 黑龙江 Heilongjiang, China － －
NP-S4 F. oxysporum P. vulgaris 黑龙江 Heilongjiang, China － －
NP-YN05 F. oxysporum P. vulgaris 中国云南 Yunnan, China － －
NP-KL05 F. oxysporum P. vulgaris 中国山西 Shanxi, China － －
FO F. oxysporum Zea mays 来源不明 Unkown －
FOC F. oxysporum f. sp. ciceris Cicer arietinum 中国新疆 Xinjiang, China －
FSP1 F. solani f. sp. pisi Pisum sativum 中国宁夏 Ningxia, China －
FSP2 F. solani f. sp. pisi P. sativum 中国甘肃 Gansu, China －
FSG F. solani f. sp. glycines Glycine max 中国安徽 Anhui, China －
FV1 Fusarium verticillioides Z. mays 中国河南 Henan, China －
FV2 Fusarium verticillioides Z. mays 中国山东 Shandong, China －
FG1 Fusarium graminearum Z. mays 中国山东 Shandong, China －
FG2 Fusarium graminearum Z. mays 中国河南 Henan, China －
FC Fusarium culmorum Z. mays 中国陕西 Shaanxi, China －
PS Phytophthora sojae G. max 美国 USA －
MP Macrophomina phaseolina G. max 北京 Beijing, China －
1) 致病性测定以感病品种 BRB-130为材料, +: 有致病力, –: 无致病力; 2) PCR鉴定以 QFopA/QFopB作为扩增引物, +: 阳性扩增,
–: 阴性扩增。
1) Virulence assay was carried out using the susceptible cultivar BRB-130, +: pathogenic, –: nonpathogenic; 2): PCR assay was carried
out using primers QFopA/QFopB, +: with expected PCR band pattern, –: without expected PCR band pattern.
第 5期 薛仁风等: 应用荧光定量 PCR技术分析普通菜豆品种中尖镰孢菜豆专化型定殖量 795



图 1 引物 QFopA/QFopB对 F. oxysporum f. sp. phaseoli的特异性检测
Fig. 1 Speciality of QFopA/QFopB primers to F. oxysporum f. sp. phaseoli
M: DNA分子标准; 1~12: FOP-DM01, FOP-DM02, FOP-S1, FOP-BCH01, FOP-BCH02, FOP-YN02, FOP-YN03, FOP-KL01, FOP-KL02,
FOP-BSH01, FOP-WSH01, FOP-SHY01; 13~20: NP-DM02, NP-YN05, NP-KL05, FOC, FSP1, PS, 菜豆基因组 DNA, 阴性对照(水)。
M: DNA marker; 1–12: FOP-DM01, FOP-DM02, FOP-S1, FOP-BCH01, FOP-BCH02, FOP-YN02, FOP-YN03, FOP-KL01, FOP-KL02,
FOP-BSH01, FOP-WSH01, FOP-SHY01; 13–20: NP-DM02, NP-YN05, NP-KL05, FOC, FSP1, PS, common bean DNA, negative
control (water).

图 2 F. oxysporum f. sp. phaseoli DNA标准曲线的绘制及 QFopA/QFopB灵敏度的测定
Fig. 2 Standard curve of F. oxysporum f. sp. phaseoli DNA and sensitivity determination of QFopA/QFopB
A: 根据不同 F. oxysporum f. sp. phaseoli DNA浓度绘制的标准曲线; B: 以灭菌去离子水梯度稀释DNA模板; C: 以 100 ng菜豆根DNA
梯度稀释 DNA模板; D: 以 100 ng菜豆茎 DNA梯度稀释 DNA模板; M: DNA分子标准; 1~6: 100、10、1、0.1、0.01和 0.001 ng F.
oxysporum f. sp. phaseoli DNA。
A: standard curve based on different concentrations of F. oxysporum f. sp. phaseoli DNA; B: F. oxysporum f. sp. phaseoli DNA diluted in
sterile ultrapure water; C: F. oxysporum f. sp. phaseoli DNA diluted in common bean roots DNA (100 ng); D: F. oxysporum f. sp. phaseoli
DNA diluted in common bean stems DNA (100 ng); M: DNA marker; 1–6: 100, 10, 1, 0.1, 0.01, and 0.001 ng F. oxysporum f. sp.
phaseoli DNA.

均病级数分别达到 6.4 和 6.5, 病情指数分别为 66.7
和 67.4; 而 260205 和黑芸豆平均病级数仅为 2.5 和
2.4, 病情指数分别为 28.1和 26.7。表型鉴定结果表
明, 260205和黑芸豆对 FOP-DM01菌株的抗病性要
强于 BRB-130和 A0640-1。
3 讨论
普通菜豆镰孢菌枯萎病是严重危害菜豆生产的
真菌性维管束类病害[2,25-26]。我国绝大部分菜豆种植
地一般发生率为 30%~50%, 严重时达到 90%[27], 近
年引起越来越多育种家和植物保护工作者的关注。
实践证明选育和合理利用抗病品种是防治普通菜豆
病害最安全、经济、有效的方法[28]。
荧光定量 PCR技术是一种准确定量植物组织中
定殖的病原菌含量的方法, 应用该项技术能够帮助
我们更加准确地鉴定和筛选出优良的抗性资源, 为
培育新的抗病品种提供依据。本研究即采用该技术
检测和定量了菜豆组织中定殖的病原菌含量。近些
年, 荧光定量 PCR技术已经广泛应用于很多真菌病
原菌的检测和定量分析[8,29-30]。
796 作 物 学 报 第 38卷


图 3 应用荧光定量 PCR技术定量 4个不同普通菜豆品种根和茎中的 F. oxysporum f. sp. phaseoli DNA含量
Fig. 3 F. oxysporum f. sp. phaseoli DNA amount in the roots and stems of four common bean cultivars detected by real time quanti-
tative PCR
A: 菜豆根中 FOP-DM01菌株定殖量的检测; B: 菜豆茎中 FOP-DM01菌株定殖量的检测。相同时间点中不同字母代表不同品种菜豆
组织中病原菌的定殖量具有显著性差异(P < 0.05)。
A: quantification of F. oxysporum f. sp. phaseoli in common bean roots inoculated with FOP-DM01; B: quantification of F. oxysporum f. sp.
phaseoli in common bean stems inoculated with FOP-DM01. Different letters indicated a significant difference (P < 0.05) was detected
among four common bean cultivars at the same time point.

图 4 4个菜豆品种接种 FOP-DM01菌株的病情评价
Fig. 4 Disease assessment of four common bean cultivars inoculated with FOP-DM01
A: 接种 FOP-DM01菌株后 4个菜豆品种发病情况; B: 接种 FOP-DM01菌株 23 d后 4个菜豆品种病情指数。不同字母代表不同品种
菜豆的病情指数具有显著性差异(P < 0.05)。
A: disease progress of different common bean cultivars inoculated with FOP-DM01; B: disease index of different common bean cultivars
plants at 23 d post inoculation with FOP-DM01. Different letters indicate that a significant difference (P < 0.05) was detected among common
bean cultivars.

目前已经开发出用于鉴定 F. oxysporum不同专
化型的特异性引物有很多, 结合荧光定量 PCR技术
可以准确地鉴定被侵染植物组织中的病原菌。例如,
用基于 F. oxysporum中转座子 Fot1序列开发出的引
物 Mg5/Mg6 可以准确地鉴定 F. oxysporum f. sp.
chrysanthemi, 并能够检测到巴黎菊花根和茎中定
殖的病原菌, 最低检测量达到 300 fg[31-32]; 用 Fusa-
rium oxysporum f. sp. vasinfectum 的特异性引物
Fov1-Eg-f/Fov1-Eg-r, 最低可以检测到 200 fg 病原
菌 DNA[33]; Zhang 等[34]通过比较 55 种不同专化型
F. oxysporum的 ITS序列设计的引物 Fn1/Fn2能够特
异性地检测到最低 1 fg的 F. oxysporum f. sp. niveum
第 5期 薛仁风等: 应用荧光定量 PCR技术分析普通菜豆品种中尖镰孢菜豆专化型定殖量 797


基因组 DNA; 用 F. oxysporum f. sp. basilici特异性
引物 Bar 3/Bal 3能够从受侵染的罗勒植株根和种子
中最低检测到 1 pg F. oxysporum f. sp. basilici基因
组 DNA[35]; Pasquali等[36]利用 IR-SCAR技术设计的
引物 Hani3′/Hanilatt3rev 能够鉴定出 Fusarium ox-
ysporum f. sp. lactucae Race 1; Jiménez-Fernández
等[37]设计的 F. oxysporum f. sp. ciceris 特异性检测
引物 FOCP1最低可以检测到 1 pg病原菌 DNA, 结
合荧光定量 PCR技术能够准确地鉴定病原菌在鹰嘴
豆受侵染组织中的定殖量, 区分不同品种的抗性水
平以及比较 F. oxysporum f. sp. ciceris不同生理小种
间致病力的差异。此外, Inami 等 [38]根据 F. oxys-
porum f. sp. lycopersici中 SIX1基因序列设计的特异
性引物 L1 可以用于鉴定该病原菌, 根据 SIX4 和
rDNA-IGS的序列设计的特异性引物 P1和 R1、P2、
P3可以分别鉴定 F. oxysporum f. sp. lycopersici 3个
不同的生理小种。本研究根据普通菜豆枯萎病原菌
(F. oxysporum f. sp. phaseoli)中与其致病力密切相关
的 1个转录因子基因(ftf1基因)设计了 1对特异性引
物 QFopA/QFopB, 该引物组合能够特异性地从具有
致病力的病原菌株中扩增出大小约 149 bp 的条带,
有效地将菜豆枯萎病原菌与其他病原菌区分开, 并
且在寄主DNA存在的条件下, 其扩增的效率和灵敏
度均不受影响, 采用荧光定量 PCR技术最低能够检
测到 1 pg的病原菌DNA, 可以用来定量鉴定和筛选
抗性较好的菜豆资源, 这在其他病原菌的检测中也
得到相似的结果[35,37]。
本研究通过荧光定量 PCR技术能够在菜豆表现
出明显发病症状前定量鉴定寄主组织内定殖的病原
菌。尽管在接种病原菌第 7 天后菜豆叶片才有轻微
的典型枯萎病病斑出现, 但病原菌的定量检测在菜
豆没表现出任何发病症状的时候就可以进行, 而且
针对反应中可能出现的非特异性扩增产物干扰实验
结果这一问题可以通过分析特异性扩增产物的溶解
曲线, 在特定的反应温度下收集荧光信号而得到解
决[39], 显著地提高了这项技术的实际应用价值。本
研究结果表明, 在接种病原早期, 无论是否可以从
菜豆植株表型上观察到明显的发病症状, 寄主内定
殖的病原菌DNA的含量已经可以被检测到, 并随着
时间推移迅速升高, 变化明显。目前很多研究结果
已经证明荧光定量 PCR技术能够有效地区分抗性水
平不同的植物寄主[13,20,37]。与普通菜豆镰孢菌枯萎
病抗病性表型鉴定不同, 本研究是通过荧光定量 PCR
技术定量鉴定不同菜豆品种的抗病性水平, 而不是单
纯通过植株外部病症严重程度进行评价[25,40-41], 这使
得该技术克服了传统病级评价方法中耗时长、受环
境影响大、准确性不高等缺陷, 为菜豆镰孢菌枯萎
病抗性资源的准确鉴定和筛选提供了新思路, 在抗
病品种分子辅助选择中有很好的应用前景。
4 结论
本研究设计出 1 对鉴定普通菜豆枯萎病原菌
(Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli)的特异性引物
QFopA/QFopB, 应用荧光定量 PCR技术定量分析普
通菜豆根和茎组织中定殖的病原菌的含量, 用于准
确鉴定不同菜豆品种间抗病性差异, 同时结合传统
的菜豆镰孢菌枯萎病抗病性评价的标准, 为更准确
地鉴定抗性资源和培育优良的菜豆枯萎病抗病品种
奠定了基础。
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