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Effects of Aluminum on Mitochondrial membrane Physiological Characteristics in Peanut Root Tips

铝胁迫对花生根尖线粒体膜生理特性的影响



全 文 :作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2009, 35(6): 1059−1067 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(30560070)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 何龙飞, E-mail: lfhe@gxu.edu.cn
第一作者联系方式: E-mail: may2399@163.com
Received(收稿日期): 2008-11-24; Accepted(接受日期): 2009-02-17.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2009.01059
铝胁迫对花生根尖线粒体膜生理特性的影响
詹 洁 1 寇瑞杰 1 李创珍 1 何虎翼 2 何龙飞 1,*
1 广西大学农学院, 广西南宁 530005; 2 广西农业科学院经济作物研究所, 广西南宁 530007
摘 要: 线粒体在植物生命活动中发挥重要作用, 以花生为材料, 研究了在铝胁迫条件下, 花生根尖细胞线粒体膜
生理变化。结果表明, 通过根长试验、苏木精染色和根尖铝离子含量测定, 筛选到耐铝品种鲁花 11(LH11), 铝敏感品
种 R1549。铝胁迫后, 两个品种根尖线粒体 MDA含量增加, R1549的 MDA含量均高于 LH11, 在处理浓度是 20 μmol
L−1 和 100 μmol L−1 时, 两品种的 MDA 含量差异显著, 但在 400 μmol L−1 时, 差异不显著; 两品种根尖线粒体
Ca2+-ATP酶活性和 Ca2+含量呈下降趋势, 且随铝溶液浓度增加而加快, R1549的线粒体 Ca2+含量下降较 LH11快; 随
处理铝溶液浓度增加, 线粒体光密度持续下降, MPT不断增大, ΔΨm明显降低, 线粒体中 Cyt c/a减少, R1549较 LH11
下降更明显。试验结果说明在较高铝浓度胁迫下, 两品种线粒体透性转换孔开放, 膜透性增加, 跨线粒体膜 Ca2+转运
系统活性降低, 使胞质 Ca2+超载, 细胞色素 C释放到细胞质中, 诱导根尖细胞发生程序性死亡, 从而抑制根生长; 在
低铝浓度下, 与铝敏感品种相比, 耐铝品种吸收铝少, 脂质过氧化水平低, 线粒体膜 Ca2+-ATPase 活性、MPTP 和
ΔΨm调控能力强, 不易发生细胞程序性死亡, 从而表现出较强的耐铝能力。
关键词: 铝胁迫; 花生; 根尖; 线粒体; 透性生理
Effects of Aluminum on Physiological Characteristics of Mitochondrial Mem-
brane in Peanut Root Tips
ZHAN Jie1, KOU Rui-Jie1, LI Chuang-Zhen1, HE Hu-Yi2, and HE Long-Fei1,*
1 College of Agronomy, Guangxi University, Nanning 530005, China; 2 Institute of Economic Crops, Guangxi Academy of Agricultural Sciences,
Nanning 530007, China
Abstract: Mitochondria play a vital role in plant life. Peanut (Arachis hypogaea L.) culitivars LH11 (Al-resistant) and R1549
(Al-sensitive) were selected through root elongation experiment, hematoxylin dying and Al3+ concentration detection in root tips.
The concentration of mitochondrial MDA in two cultivars root tips increased after Al3+ treatment, that of R1549 was higher than
that of LH11. The difference between two cultivars in mitochondrial MDA concentration was very significant in 20 and 100 μmol
L−1 Al3+ treatment, but not significant in 400 μmol L−1 treatment. With the increase of Al3+ concentration, mitochondrial
Ca2+-ATPase activity and Ca2+ concentration in two cultivars root tips decreased, and Ca2+ concentration of R1549 decreased
faster than that of LH11. Under Al3+ stress, mitochondrial optical density decreased continuously, (mitochondrial permeability
transition pore MPTP) enlarged, mitochondria ΔΨ decreased significantly, mitochondrial Cyt c/a ratio reduced, which was more
obvious in R1549 than in LH11 with Al3+ concentration increasing. To sum up, high Al3+ concentration treatment induced mito-
chondrial permeability transition pore opening, increased mitochondrial membrane permeability, decreased mitochondrial mem-
brane Ca2+ transit system activity so that cytoplasm Ca2+ concentration increased, cytochrome c released into the cytoplasm,
which might induce PCD (programmed cell death) in root tip, and inhibit root growth. Compared with Al-sensitive cultivar,
Al-resistant cultivar has less Al3+ absorption and membrane lipid peroxidation level, higher control ability of Ca2+-ATPase activity,
MPTP opening and ΔΨm maintaining so that is not easy to produce PCD under low Al3+ concentration stress. It may be one of
reasons for Al resistance mechanism in plant.
Keywords: Aluminum stress; Peanut (Arachis hypogaea L.); Root tip; Mitochondria; Permeability physiology
1060 作 物 学 报 第 35卷

花生是世界上重要的油料作物, 是重点开发的
富含油脂和挥发油类的能源植物, 全国栽培面积达
500 万公顷 , 在南方大片红黄壤地区 , 花生种植面
积占全国 30%左右, 由于红黄壤大部分呈酸性或强
酸性反应, 交换性铝占阳离子交换量 20%~80%, 花
生生长发育在很大程度上受到铝毒危害, 这是该区
域长期以来花生单产一直低于全国平均水平的重要
原因[1]。因而, 研究花生对铝毒的反应与耐性, 通过
遗传改良筛选耐铝毒品种, 对提高酸性土壤的花生
生产力具有重要意义。关于花生铝毒害研究主要涉
及铝毒害筛选指标[2-3]、3 种耐铝基因型的生物学标
定[4]、铝对花生根系生长以及生长发育过程的影响[2,5]、
铝对 N、P、Ca等离子吸收等[6], 但对铝毒害及耐性
机制的研究和认识较少[7]。
线粒体在细胞代谢中扮演着重要的角色, 是生
物体的能量供应站, 富含不饱和脂肪酸, 高效率利
用氧, 是易产生活性氧和易脂质过氧化的细胞器[8],
活性氧可破坏线粒体的结构和功能[9]。在小麦、茶
树等植物中, 铝离子进入细胞质[10]和线粒体, 进入
线粒体的量占根系匀浆中铝的 10%~20%[11], 降低
小麦根呼吸速率和线粒体膜结合酶活性[12], 导致线
粒体呼吸功能受损, 氧化磷酸化解耦联[13], 从而抑
制根生长。在花生中, 何龙飞等[14]发现铝诱导花生
线粒体膜脂过氧化 , 促进柠檬酸和琥珀酸的分泌 ,
而包括柠檬酸和琥珀酸等有机酸的生物合成和降解
主要发生在线粒体内的三羧酸循环, 有机酸向外运
输必须经过线粒体膜 , 柠檬酸载体抑制剂 PP 和
PITC 强烈抑制铝化物诱导的黑麦根系柠檬酸的分
泌[15]。由此可见, 线粒膜的通透性在铝毒害和耐性
机制中扮演重要角色。为此, 我们以花生为材料, 研
究了铝胁迫对线粒体膜透性生理的影响, 为阐明植
物铝毒害和耐性机制提供进一步证据。
1 材料与方法
1.1 供试材料
花生(Arachis hypogaea L.)品种鲁花 11 (LH11)
购于山东省莱西市新玉种子公司, R1549 由中国农
业科学院油料作物研究所廖伯寿研究员提供。
1.2 花生幼苗的培养
于粗沙中 26℃催芽 4 d, 将有芽的花生去掉种
皮后移栽到改良的 Hoagland 营养液中培养, 每 2 d
更换一次营养液。花生幼苗抽出第 2 片真叶后, 在
含有 pH 4.2~4.3的 0.5 mmol L−1的 CaCl2溶液中预处
理 24 h。
1.3 根长生长量测定
在测量前作好测量的基点, 小心测量从标记点
到根尖顶端的距离, 然后将根置于 pH 4.2~4.3含 0.5
mmol L−1 CaCl2的不同浓度(0、20、40、60、80 和
100 μmol L−1, 其中 0 μmol L−1为对照) AlCl3溶液中
处理 24 h, 第 2 次测量标记点到根尖顶端的距离,
两次测量值之差即为幼苗根生长的伸长量。每个品
种每个浓度处理 15株幼苗, 3次重复。
相对伸长率(%)=处理的根伸长量/对照的根伸
长量×100%。
1.4 苏木精染色
将铝溶液处理 24 h的根尖在去离子水中浸洗 15
min, 洗去表面残留的铝离子后, 以 0.1%苏木精(含
0.01% KIO3)染色 20 min, 再将染色后的根尖在去离
子水中浸洗 10 min, 照相。
1.5 根尖铝含量的测定
参考何斌等[16]的方法, 将铝溶液处理 24 h的根
尖在去离子水中浸洗 15 min, 切取根尖, 称重, 放
入 2 mol L−1 HNO3 1.5 mL浸泡 24 h, 将浸泡液全部
转入 25 mL容量瓶中, 依次加入 0.1 mol L−1 HNO3
1.0 mL, 5×10−3 mol L−1 CTMAB (溴化十六烷基三甲
胺) 2.0 mL, 0.05 mol L−1 EDTA-Zn 2.0 mL摇匀, 放
置 2 min, 加入 0.05%铬天青 S显色剂 2.0 mL, 40%
六次甲基四胺溶液 4.0 mL, 加去离子水稀释至刻度,
摇匀。20~30℃下静置 20 min。以试剂空白为对照,
于 635 nm处测定吸光度。同时, 配制铝标准液, 制
作标准曲线, 计算铝离子含量。
1.6 线粒体的提取
花生幼苗分别用 0、20、100和 400 μmol L−1铝
溶液处理 4 d, 参照王金胜等[17]的方法提取根尖细
胞线粒体。花生根系用蒸馏水洗净, 剪取 0.3 g根尖
于研钵中 , 加入线粒体提取液 (0.4 mo1 L−1 蔗糖 ,
0.05 mo1 L−1 pH 7.4 Tris-HCl缓冲液, l mmol L−1
EDTA) 2 mL冰浴研成匀浆, 1 500×g离心 15 min, 上
清液于 14 000 ×g离心 15 min, 沉淀则为线粒体, 洗
涤 3 次, 用线粒体悬浮液(除不加 EDTA 外, 其余同
制备液)悬浮。线粒体浓度以线粒体蛋白含量表示。
用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量。
1.7 线粒体丙二醛(MDA)含量的测定
取 0.2 mL线粒体提取液(对照为蒸馏水)于试管,
加 1 mL 0.6%的硫代巴比妥酸(TBA), 沸水浴 15 min,
冷却后 1 500×g离心 10 min, 分别测定各管在 532、
第 6期 詹 洁等: 铝胁迫对花生根尖线粒体膜生理特性的影响 1061


600和 450 nm的吸光值(ABS值), 按赵世杰等[18]的
方法计算 MDA含量。
1.8 线粒体 Ca2+含量和 Ca2+-ATP酶活性测定
参考张婷等[19]的方法。取线粒体悬液 1.5 mL,
置 10 mL加盖刻度试管中, 加浓硝酸 5 mL, 于阴暗
处消化 1周, 烘箱加热, 使硝酸尽量分解蒸发, 再加
1%氯化镧至 10 mL, 混匀, 用火焰原子分光光度计
测定吸光值, 据标准曲线计算 Ca2+浓度。
参考《现代植物生理学试验指南》[20]中的方法。
0.5 mL反应体系中含有 30 mmol L−1 Hepes-Tris (pH
8.0), 0.1 mmol L−1 Na3VO4, 50 mmol L−1 NaN03, 50
mmol L−1 KCl, 0.1 mmol L−1钼酸铵, 膜蛋白 20~40
μg, 加或不加 3 mmol L−1 Ca(NO3)2引起的酶活性之
差为线粒体 Ca2+-ATP 醉活性。用 30 mmol L−1的
ATP-tris (pH 8.0) 50 μL 启动反应, 37℃下反应 30
min, 用 55% (W/V) TCA 50 μL终止反应。按 Ohnishi
等[21]方法测定释放无机磷量。
1.9 线粒体膜通透性和线粒体膜电位的测定
分离的线粒体用线粒体悬浮液悬浮, 悬浮液蛋
白质浓度为 0.3 mg mL−1, 于 20℃保温 2 min。用紫
外分光光度计检测 540 nm处的吸光度变化。
参照 Braidot等[22]的方法。分离的线粒体用线粒
体悬浮液悬浮 , 悬浮液蛋白质浓度约为 0.3 mg
mL−1。加入罗丹明 123 (Rhodamine 123, Rh123) 10
μg mL−1, 在 25℃下孵育 30 min, 然后用线粒体悬浮
液洗 3 次。在荧光分光光度计上检测荧光强度, 激
发波长为 505 nm, 发射波长为 534 nm。
1.10 线粒体细胞色素(Cytochrome, Cyt) c/a 比
值的测定
参照 Tonshin 等 [23]的方法。分离的线粒体用
0.2% (W/V) BSA悬浮, 调整悬浮液所含线粒体蛋白
浓度约为 0.5 mg mL−1。紫外分光光度计检测 550 nm
和 630 nm处的吸收值, 两种波长的吸收值之比即为
Cyt c/a。
1.11 统计分析
采用 Microsoft Excel 处理试验数据 , 采用
DPS3.1数据统计系统软件, 以 LSD法检验差异显著
性。
2 结果与分析
2.1 铝对花生根尖生长的影响
从表 1 可知, 对照中 R1549 生长速度较 LH11
快。与对照相比, 铝溶液处理后, LH11和 R1549的
根长均显著下降, 但 R1549 的伸长量下降快、幅度
大, 其根伸长生长半抑制浓度在 20~40 μmol L−1之
间; LH11约为 80 μmol L−1, 此时, R1549的根长仅为
对照的 1/5。可见 LH11 具有较强的耐铝性, R1549
对铝较敏感。

表 1 铝离子对花生品种 LH11和 R1549根伸长的影响
Table 1 Effect of Al3+ on root elongation of peanut cultivars LH11 and R1549
LH11 R1549 铝浓度 Al3+
Al3+concentration 根伸长量
Root elongation (mm)
% 根伸长量
Root elongation (mm)
%
0 μmol L−1 11.44±2.08 a 100.0 15.45±1.92 a 100.0
20 μmol L−1 9.51±1.62 b 83.2 9.39±1.38 b 60.8
40 μmol L−1 7.76±1.54 c 67.9 5.09±1.21 c 33.0
60 μmol L−1 5.74±0.94 d 50.2 4.46±1.01 c 28.9
80 μmol L−1 6.01±1.15 d 52.6 3.07±0.80 d 19.9
100 μmol L−1 4.96±1.14 d 43.5 2.60±0.96 d 16.8
不同字母表示同一品种不同铝溶液处理根伸长的差异显著。
Values followed by different letters in same column are significantly different at the 0.05 probability level.

铝溶液处理后, 根尖苏木精染色差异较大, 铝
离子浓度越大, 根尖的染色越深, 表明进入根内铝
越多, 受害越严重。经 24 h处理, 当铝浓度 40 μmol
L−1时, R1549根尖染色加深, 而 LH11根尖颜色没有
什么变化; 60 μmol L−1时, R1549根尖完全被染为黑
色, 根表皮受损; 100 μmol L−1时, 被染色的 R1549
根尖, 与 60 μmol L−1的根尖相近, LH11在离根尖顶
端较远处表现出轻微的表皮受损, 整条根染色仍较
浅(图 1)。结果进一步说明 LH11比 R1549具有较强
的耐铝害的能力, 与根伸长试验结果一致。
2.2 铝溶液处理后 LH11和 R1549根尖的铝含量
变化
不同浓度铝溶液处理下, R1549 根尖铝离子量
均高于 LH11。铝出来浓度 20 μmol L−1时, LH11和
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图 1 不同浓度铝溶液处理 24 h后经苏木精染色的花生根尖
Fig. 1 Hematoxylin-stained peanut root tips treated by dif-
ferent Al3+concentrations for 24 h
A~F: 0、20、40、60、80和 100 μmol L−1铝溶液处理 LH11后根
尖的染色变化; G~L: 0、20、40、60、80和 100 μmol L−1铝溶液
处理 R1549后根尖的染色变化。
A–F: LH11 root tips treated with 0, 20, 40, 60, 80, and 100 μmol
L−1 Al3+, respectively; G–L: R1549 root tips treated with 0, 20, 40,
60, 80, and 100 μmol L−1 Al3+, respectively.

R1549 根尖铝含量差异不显著; 40 μmol L−1和 60
μmol L−1时, 差异极显著; 80 μmol L−1和 100 μmol
L−1 时, 差异不显著(图 2)。结果说明, 铝离子进入
根是造成铝毒害的原因之一 , 推测耐铝品种在一
定范围内能够减少铝离子进入根内 , 而铝敏感品
种抵制铝进入的能力较弱, 吸入铝离子多, 使毒害
更严重。

图 2 LH11和 R1549根尖铝离子含量
Fig. 2 Al3+ concentration of root tips in LH11 and R1549
图中不同的大小字母分别表示在 0.01、0.05水平上差异显著。
Al concentrations in root tips with a different small or capital let-
ters are significantly different at the 0.01 or 0.05 probability levels
on the basis of LSD test, respectively.
2.3 铝溶液处理后 LH11和 R1549根尖线粒体丙
二醛(MDA)的铝含量变化
图 3 表明, 随着处理铝浓度的提高, 两个品种
根尖线粒体 MDA含量也随之升高, 膜通透性增加。
当处理浓度 400 μmol L−1时, 两品种MDA的含量最
高, 与对照相比差异达极显著水平, 说明两品种均
受到铝的严重伤害, 两品种间表现已没有显著差异;
20 μmol L−1和 100 μmol L−1时, 两品种与对照差异
不显著, 但两品种间差异显著, 表明耐铝品种耐膜
脂过氧化能力强于铝敏感品种。在同一铝处理浓度,
R1549的 MDA含量均高于 LH11, 说明 R1549的线
粒体膜被氧化程度和通透性更高。

图 3 对花生根尖线粒体 MDA含量的影响
Fig. 3 Effect of Al3+ on MDA concentration in mitochondria of
peanut root tips
图中不同的大小字母分别表示在 0.01、0.05水平上差异显著。
MDA concentrations in root tips with a different small or capital
letters are significantly different at the 0.01 or 0.05 probability
levels on the basis of LSD test, respectively.

2.4 铝溶液处理后对 LH11和 R1549根尖线粒体
Ca2+-ATP酶活性和 Ca2+含量的影响
Ca2+-ATPase 是由 ATP(腺苷三磷酸)提供能量,
主动把 Ca2+从胞质运输到胞外或细胞器中的蛋白
体。由于跨质膜或内膜 Ca2+梯度很大, 所以低胞质
Ca2+主要靠 Ca2+-ATPase的作用来维持。从图 4可知,
随着处理铝浓度的提高 , 两品种根尖线粒体膜
Ca2+-ATPase活性呈下降趋势, 在不同的铝处理浓度
下, 两品种间差异不显著。以 20 μmol L−1 处理时,
LH11和 R1549的酶活性分别下降 6%和 17%, 与对
照差异不显著; 100 μmol L−1时, LH11和 R1549的酶
活性分别下降 35.3%和 21.7%, 与对照差异不显著;
400 μmol L−1时, LH11和 R1549的酶活性分别下降
52.5%和 54.2%, 与对照差异显著。在两品种之间,
在 对 照 和 20 μmol L−1 铝 溶 液 时 , LH11 的
Ca2+-ATPase 活性均高于 R1549, 20 μmol L−1 时 ,
第 6期 詹 洁等: 铝胁迫对花生根尖线粒体膜生理特性的影响 1063


LH11的活性下降也较 R1549小; 在 100 μmol L−1和
400 μmol L−1时, 两品种差别不大。说明低铝浓度处
理下, LH11 线粒体膜 Ca2+-ATPase 活性维持能力强
于 R1549, Ca2+从胞质运输到线粒体能力强。

图 4 铝离子对花生根尖线粒体 Ca2+-ATPase活性的影响
Fig. 4 Effect of Al3+ on Ca2+-ATPase activity of mitochondria
in peanut root tips
图中不同的大小字母分别表示在 0.01、0.05水平上差异显著。
Ca2+-ATPase activity in root tips with a different small or capital
letters are significantly different at the 0.01 or 0.05 probability
levels on the basis of LSD test, respectively.

从图 5 可知, 随着处理浓度的提高, 两品种的
线粒体 Ca2+含量呈下降趋势, R1549较 LH11降幅更
大, 但两品种间差异不显著。在对照和 20 μmol L−1
铝处理时, R1549线粒体 Ca2+含量高于 LH11。在 100
和 400 μmol L−1 时, R1549 的 Ca2+含量分别下降
75.8%和 80.8%, 与对照差异显著; LH11的 Ca2+含量
分别下降 31.0%和 35.3%, 但与对照差异不显著。
Ca2+含量的变化趋势与 Ca2+-ATPase 的变化基本一
致。结果表明, R1549维持正常生长需要线粒体 Ca2+
含量高于 LH11, 铝溶液处理后, 两品种的线粒体

图 5 铝离子对花生根尖线粒体 Ca2+含量的影响
Fig. 5 Effect of Al3+ on Ca2+ concentration of mitochondria in
peanut root tips
图中不同的大小字母分别表示在 0.01、0.05水平上差异显著。
Ca2+ concentrations in root tips with different small or capital let-
ters are significantly different at the 0.01 or 0.05 probability levels
on the basis of LSD test, respectively.
Ca2+-ATPase 活性下降, 线粒体 Ca2+含量降低, 由于
R1549 铝溶液处理线粒体膜透性高于 LH11, Ca2+从
线粒体 Ca2+通道进入胞质增多, R1549 线粒体 Ca2+
含量下降较 LH11 迅速, 从而较 LH11 易造成胞质
Ca2+超载, 引发细胞程序性死亡。
2.5 铝胁迫对 LH11和 R1549根尖线粒体MPTP
开放、ΔΨm、Cyt c/a的影响
线粒体膜通透性转变(mitochondrial permeabil-
ity transition, MPT)主要决定于其通道 MPTP (mito-
chondrial permeability transition pore)的开放程度。
MPTP的过度开放不仅使 MPT增大, 也导致呼吸链
解耦联, 线粒体膜电位(ΔΨm)下降甚至消失, ROS增
加, 线粒体 Ca2+外流, 释放 Cyt c和程序性死亡诱导
因子(apoptosis-inducing-factor, AIF)产生等[24-26]。从
图 6 可知, 随着处理铝浓度的增加, 两品种的线粒
体膜吸光度呈下降趋势, 表明 MPT在不断增大。在
20 μmol L−1铝时, LH11的线粒体膜吸光度几乎没有
变化, R1549 的线粒体膜吸光度下降 9.6%, 两品种
间差异显著, 表明 R1549 的 MPT 已增大, LH11 的
MPT则没有变化; 100 μmol L−1时, LH11的吸光度下
降 12.8%, 差异显著, 而R1549的吸光度下降 12.8%,
差异显著, 两品种间差异不显著; 400 μmol L−1 时,
LH11和 R1549的吸光度下降 19.6%和 28.9%, 差异
极显著, 两品种间差异显著。结果说明在低铝浓度
时, R1549 的 MPT 已增大, 透性增加, 而 LH11 的
MPT 没有变化 ; 随着处理浓度的提高 , 两品种的
MPT均增大, 但 R1549的增幅大于 LH11, 线粒体功
能受损更严重。

图 6 铝离子对花生根尖线粒体 MPTP的影响
Fig. 6 Effect of Al3+ on MPTP of mitochondria in peanut root
tips
图中不同的大小字母分别表示在 0.01、0.05水平上差异显著。
MPTP in root tips with different small or capital letters are signifi-
cantly different at the 0.01 or 0.05 probability levels on the basis of
LSD test, respectively.
1064 作 物 学 报 第 35卷

对线粒体具有特异性选择的阳离子荧光探针
Rh123 能够顺着线粒体膜电位(ΔΨm)梯度进入线粒
体基质中, ΔΨm 越高, 进入基质内的荧光探针就越
多, 检测到的荧光强度也就越强; 反之 ΔΨm 下降,
荧光强度也会随之减弱, 因此, 可用 Rh123 高低来
检测线粒体 ΔΨm的变化。从图 7 可知, 随着铝溶液
浓度的提高 , 两品种的线粒体荧光强度呈下降趋
势。在 20 μmol L−1时, LH11的荧光强度下降 3.7%,
R1549的荧光强度下降 25.3%, 差异显著, 两品种间
差异显著; 100 μmol L−1时, LH11的荧光强度下降
12.7%, 差异不显著, R1549 的荧光强度下降 25.5%,
差异显著; 400 μmol L−1时, LH11的荧光强度下降
29.1%, 差异极显著, R1549 的荧光强度下降 42.4%,
差异极显著。表明铝处理后, 线粒体 ΔΨm明显降低,
R1549的 ΔΨm下降更快, 说明其线粒体受损较 LH11
严重。

图 7 铝离子对花生根尖线粒体 ΔΨm的影响
Fig. 7 Effect of Al3+ on ΔΨm of mitochondria in peanut root
tips
图中不同的大小字母分别表示在 0.01、0.05水平上差异显著。
ΔΨ in root tips with different small or capital letters are signifi-
cantly different at the 0.01 or 0.05 probability levels on the basis of
LSD test, respectively.

细胞色素 c (Cyt c)和细胞色素 a (Cyt a)是线粒
体内膜上电子传递链的组成成分。Cyt c松散地结合
在线粒体内膜上, Cyt a则是紧密结合在线粒体内膜
上。当 MPTP不断增大, ΔΨm不断下降, 线粒体膜的
完整性被破坏时, Cyt c就会从内膜上脱落下来。同
时 MPTP过度开放, Cyt c就有可能穿过线粒体膜进
入细胞质。所以 Cyt c/a的比值能够反映出线粒体内
膜上 Cyt c 量的变化[25-26]。从图 8 可知, 铝处理后,
两品种的 Cyt c/a值呈下降趋势, R1549下降略快于
LH11。在 20 μmol L−1时, LH11的 Cyt c/a值较对照
下降 7.3%, R1549的 Cyt c/a值下降 8.1%, 差异均不
显著; 100 μmol L−1时, LH11的 Cyt c/a下降 11.0%,
差异极显著, R1549的 Cyt c/a下降 12.9%, 差异显著;
400 μmol L−1时, LH11和 R1549的 Cyt c/a值分别下
降 24.5%和 30.6%, 差异均极显著。在同一处理浓度,
两品种间差异均不显著。表明在 ΔΨm不断下降的过
程中, 线粒体内膜上的 Cyt c也在不断流失, 铝敏感
的 R1549快于耐铝的 LH11。

图 8 铝离子对花生根尖线粒体 Cyt c/a的影响
Fig. 8 Effect of Al3+ on Cyt c/a of mitochondria in peanut root
tips
图中不同的大小字母分别表示在 0.01、0.05水平上差异显著。
Cyt c/a in root tips with different small or capital letters are sig-
nificantly different at the 0.01 or 0.05 probability levels on the
basis of LSD test, respectively.

3 讨论
3.1 花生的耐铝能力差异
不同的作物或同一作物不同的基因型存在抗铝
性的遗传差异, Armiger等[27]首次报道大豆品种间存
在抗铝差异。Foy[28]对不同作物的抗铝性进行比较,
发现水稻、小麦、燕麦、玉米、甘薯、甜菜、苜蓿、
菜豆、大豆和番茄等作物品种间的抗铝性差异显著。
黎晓峰[29]比较了几种禾本科植物的耐铝性, 发现水
稻和黑麦>大麦和小麦>玉米和高粱, 小麦和玉米对
铝的敏感性具有显著差异。根据铝对花生根系及其
他农艺性状的影响, 进行了耐铝毒的花生种质评价,
把花生划分为高耐、中耐和敏感型 3 种耐铝基因
型[2-4]。何龙飞等[30]研究表明花生品种桂花 21 的耐
铝性显著高于桂花 23。本研究也证实不同花生品种
的耐铝能力差异较大 , LH11 有较强的抗铝性 , 而
R1549 对铝较敏感。推测耐铝基因型花生可能在通
过根际形成 pH障碍[2], 在一定范围内能够抵制铝离
子进入根表皮, 而铝敏感品种抵制铝离子的能力较
弱。
第 6期 詹 洁等: 铝胁迫对花生根尖线粒体膜生理特性的影响 1065


3.2 铝胁迫对花生根尖线粒体 Ca2+-ATP 酶活性
和 Ca2+含量的影响
何龙飞等 [12]认为在线粒体膜上存在 Ca2+-ATP
酶, 该 Ca2+转运途径能利用呼吸作用释放的 ATP,
把胞质 Ca2+迅速转运到线粒体内, 参与胞质 Ca2+调
节。该酶活性在铝胁迫下迅速下降, 并随处理浓度
上升而加快, 与铝离子对呼吸速率影响一致。本试
验中, 铝溶液处理后, 两花生品种的 Ca2+-ATP 酶活
性呈下降趋势 , 且随处理浓度增加而进一步降低 ,
这与何龙飞等[12]和何虎翼等[13]得到的结果一致。同
时, 铝胁迫后, 线粒体 Ca2+含量也迅速下降, 变化
趋势与 Ca2+-ATPase 的变化基本一致。这可能是
Ca2+-ATPase活性降低, 从胞质转运 Ca2+进入线粒体
的能力减弱, 和铝胁迫导致线粒体膜 MPTP 开放,
透性增加, 线粒体内 Ca2+顺化学势梯度流入细胞质
内所致, 结果使得胞内出现 Ca2+超载, 而胞质 Ca2+
的升高能直接激活依赖钙的核酸内切酶, 使之作用
于 DNA, 产生 DNA降解[31], 诱导细胞程序性死亡。
耐铝品种线粒体膜 Ca2+-ATPase 活性维持能力强于
铝敏感品种, Ca2+从胞质运输到线粒体能力强, 而铝
敏感品种维持正常生长需要线粒体 Ca2+含量高于耐
铝品种, 铝处理后易发生线粒体膜脂过氧化, 线粒
体膜透性高于耐铝品种, Ca2+从线粒体 Ca2+通道进
入胞质增多, 从而线粒体 Ca2+含量下降较耐铝品种
迅速, 更容易发生 Ca2+超载, 在低铝浓度下产生细
胞程序性死亡, 表现铝敏感。我们通过 DNA梯、显
微结构、TUNEL检测、超微结构等研究, 发现在高
浓度铝胁迫下, 根尖细胞发生了程序性死亡, 敏感
品种根尖细胞程序性死亡更容易在较低铝浓度下发
生(资料待发表)。
3.3 铝胁迫对花生根尖线粒体 MPTP开放、ΔΨm
和 Cyt c/a的影响
线粒体通透性转换孔增大能够使线粒体膜通透
性发生改变, 造成线粒体膜电位降低、ATP 衰竭、
氧化磷酸化去偶联、线粒体大幅度肿胀、外膜破裂、
内外膜间促凋亡因子释放等, 从而细胞发生凋亡或
坏死[25]。
多种逆境胁迫能导致细胞内 ROS含量激增, 引
起生物膜脂质过氧化, 膜通透性增大等。本试验结
果显示, 铝溶液处理后, 两品种根尖线粒体MDA升
高, MPTP 开度增加, ΔΨm下降, 随着处理浓度的提
高导致线粒体光密度持续下降, 表明 MPTP 在不断
增大。随着 MPTP 的增大, 线粒体 ΔΨm也随之明显
降低。说明线粒体膜的完整性被破坏, 从而影响到
线粒体膜上的电子传递链的功能。由于线粒体是根
细胞中的动力供应者, 线粒体膜通透性的增大和膜
电位下降会在细胞中产生一系列的连锁反应。而在
低铝浓度时, 与耐铝品种相比, 铝敏感品种的 MPT
已增大, 透性增加, ΔΨm下降更快, 说明其线粒体受
损较耐铝品种严重 , 从而影响线粒体膜结合酶活
性[13], 可以引起线粒体电子传递中泄露的电子增加,
活性氧的爆发导致细胞内氧化损伤从而抑制根伸长
生长[32]。
Cyt c 是线粒体内膜中呼吸链上的电子传递载
体, 它可从线粒体释放到细胞质中, 激活半胱氨酰
天冬氨酸特异性蛋白酶(caspase), 诱导细胞的程序
性死亡[33]。本试验中, 在检测到 MPTP 和 ΔΨ 发生
变化的同时, 也发现根细胞线粒体中Cyt c含量在减
少, 且随着铝处理浓度的提高, 线粒体内的 Cyt c含
量呈下降趋势。结合铝能够促进 Cyt c释放[33]、Cyt
c 对细胞程序性死亡关键酶 caspase 具有激活作用[34],
推测铝可以诱导 MPT 的开放和增大, 降低线粒体
ΔΨm, 促进 Cyt c 的释放进入细胞质, 激活 caspase,
启动 PCD。已有报告认为没有线粒体的原生质体不
能诱导 PCD的发生, 然而在没有细胞核而有线粒体
存在的原生质体中, 则可以诱发 PCD[35-36]。这表明
线粒体在 PCD 诱导过程中起重要作用。在 ΔΨm不
断下降的过程中, 铝敏感品种线粒体内膜上的 Cyt c
流失快于耐铝品种, 进一步说明其更易诱导 PCD,
表现出铝敏感性。
综上所述 , 脂质过氧化可能降低 Ca2+-ATPase
活性, 进而使胞质转运 Ca2+进入线粒体的能力减弱,
胞内出现 Ca2+超载。大量活性氧的持续堆积和胞内
Ca2+的升高可触发MPTP开放, PTP的持续开放使的
线粒体 ΔΨm耗散, Cyt c等一些凋亡诱导因子从线粒
体中释放出来 , 并激活半胱氨酸酶或其他蛋白酶 ,
从而启动 PCD 机制, 诱导根尖细胞发生程序性死亡,
抑制根长生长。与铝敏感品种相比, 铝溶液处理后,
由于耐铝品种吸收铝少, 脂质过氧化水平低, 线粒
体膜 Ca2+-ATPase 活性、MPTP 和 ΔΨm调控能力强,
在低铝浓度下不易发生 PCD, 表现出较强的耐铝能
力。
4 结论
铝胁迫影响花生根尖细胞线粒体膜生理状态 ,
PCD诱导因子细胞色素 c、Ca2+等从线粒体中释放
1066 作 物 学 报 第 35卷

到细胞质中, 从而启动 PCD。
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