全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(10): 17631770 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家烟草专卖局科技项目(110201002002, 110200902044)和山东省烟草专卖局科技项目(200837)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 王元英, E-mail: wyytob@126.com, Tel: 0532-88703857
第一作者联系方式: E-mail: szhg521@163.com
Received(收稿日期): 2011-03-15; Accepted(接受日期): 2011-06-25; Published online(网络出版日期): 2011-07-28.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20110728.1003.018.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.01763
黑胫病菌诱导的烟草 SSH文库构建及其分析
苏振刚 1 杨爱国 1 孙玉合 1 罗成刚 1 刘贯山 1 周 佳 2 李元元 1
杨 帆 1 赵百英 1 王元英 1,*
1 中国农业科学院烟草研究所 / 烟草遗传改良与生物技术重点开放实验室, 山东青岛 266101; 2 云南瑞升烟草技术(集团)有限公司,
云南昆明 650106
摘 要: 黑胫病是危害严重的世界性烟草主要病害之一, 探究烟草对黑胫病的抗病机制, 可以为该病的综合防治提
供理论依据。本研究以烟草黑胫病抗性品种革新 3号为材料, 利用黑胫病 0号生理小种诱导其水平抗性, 分别在接种
后 0.5、1、3、6、10 和 16 d 取样, 通过抑制差减杂交技术(SSH)构建 cDNA 文库, 获得了 960 个阳性克隆。利用反
向 Northern斑点杂交技术对其中 240个阳性克隆进行杂交筛选, 筛选出 57个表达差异明显的基因, 序列拼接后获得
33 条高质量 EST, 测序及其比对分析表明, 革新 3 号对烟草黑胫病抗性相关基因主要涉及抗病防卫、光合作用、信
号传导和能量代谢等方面。进一步基因功能分析显示, 病程相关 PR1b 蛋白、半胱氨酸蛋白、延伸因子 1-α、α-微管
蛋白、细胞色素 P450、精胺合成酶、水通道蛋白、过氧化物酶体膜蛋白、甘氨酸延伸因子等可能参与了烟草与黑胫
病菌非亲和互作过程。
关键词: 烟草; 黑胫病病菌; 抑制差减杂交; 反向 Northern斑点杂交; 非亲和互作
Construction and Analysis of Tobacco SSH Library Induced by Phytophthora
parasitica var. nicotianae
SU Zhen-Gang1, YANG Ai-Guo1, SUN Yu-He1, LUO Cheng-Gang1, LIU Guan-Shan1, ZHOU Jia2,
LI Yuan-Yuan1, YANG Fan1, ZHAO Bai-Ying1, and WANG Yuan-Ying1,*
1 Tobacco Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Tobacco Genetic Improvement and Biotechnology,
Qingdao 266101, China; 2 Yunnan Reacend Tobacco Technology (Group) Co. Ltd, Kunming 650106, China
Abstract: Black shank of tobacco is one of the major disease which harmful to tobacco in the world, the incompatible interaction
between tobacco and Phytophthora parasitica var. nicotianae was studied to provide more information for integrated control. A
cDNA-SSH library was established by suppression subtractive hybridization using roots and stems sampled at 0.5, 1, 3, 6, 10, and
16 d after inoculation of Gexin 3, a horizontal resistant cultivar to race 0 of Phytophthora parasitica var. nicotianae, and 960
positive clones were picked out. Among them, 240 positive clones were verified by Reverse Northern dot-blot. A total of 57 dif-
ferentially expressed EST sequences were screened out, and 33 high quality non-redundant ESTs were obtained by cluster analy-
ses of the ESTs sequencing. The results of BlastN showed that the resistant genes of tobacco mainly related to disease defense,
photosynthesis, signal transduction, and energy metabolism. Further analysis of gene function indicated that PR1b protein, cys-
teine proteinase, EF1-α, α-tubulin, cytochrome P450, putative spermine synthase, aquaporin, peroxisomal membrane protein,
glycine for the elongation factor-1α may be involved in the process of the incompatible interaction between tobacco and Phy-
tophthora parasitica var. nicotianae.
Keywords: Tobacco; Phytophthora parasitica var. nicotianae; Suppression subtractive hybridization (SSH); Reverse Northern
dot-blot; Incompatible interaction
烟草是我国重要的经济作物之一 , 由黑胫病菌
引起的病害是一种分布广泛、危害严重的世界性烟
草主要病害[1-2]。中国最早于 1934 年在山东鉴定出
烟草黑胫病[3], 此后, 在全国多个地区均有发现。0号
1764 作 物 学 报 第 37卷
生理小种是北方烟区的优势小种。长期以来, 主要依
赖于化学药剂和田间管理措施的改进防治; 一旦染
病, 整个植株衰萎凋亡, 特别是阴雨天易造成病菌
的大面积传播。以往主要依赖传统方法选育适应现
代化生产推广的抗病品种, 现在转抗逆基因已经成
为遗传资源和品种改良的热点[4]。从分子水平上探
究烟草与黑胫病菌的互作关系, 有利于烟草抗黑胫
病材料的高效利用, 为该病害的综合防治提供重要
的理论依据。
近年来, 国内外学者对烟草黑胫病抗性的研究
主要涉及病原菌特性、拮抗细菌的互作、组织学和
生物化学等方面。抑制差减杂交 (suppression sub-
tractive hybridization, SSH)技术[5]是依据差减杂交和
抑制 PCR发展起来的一种分离差异表达基因的新方
法。许多实验室已成功地利用该技术进行基因的克
隆。Botha 等[6]用抗虫性不同的小麦品系构建 SSH
文库, 结合基因芯片技术获得 29个与抗虫性有关的
EST 序列, 并认为小麦在受到蚜虫侵害后, 存活下
来的决定因素是其能否维持光合作用以及制造足够
的能量。李艳军等[7]构建了一个棕色棉纤维色素差
异表达基因 cDNA 文库, 随机挑选 400 个克隆进行
反向 Northern 杂交检测, 发现一个与合成色素连接
酶(4CL)基因同源性较高的片段。彭琦等[8]构建了甘
蓝型油菜湘油 15发育种子特异表达基因的 SSH文库,
获得 452条高质量的表达序列标签, 发现在 20 d SSH
文库中参与糖代谢的基因出现频率较高, 在 35 d SSH
文库中参与油脂代谢相关基因出现频率较高。Tian
等[9]构建了一个富集晚疫病抗性相关基因的 SSH 文
库, 应用反向 Northern 杂交技术进行斑点杂交筛选,
筛选出 150个病原菌诱导后信号明显增强的克隆。为
了研究烟草抗黑胫病菌 0号生理小种病原菌的机制,
本研究基于有效富集低丰度差异表达 mRNA的差减
杂交技术和反向 Northern 杂交技术探究二者互作过
程中的基因表达情况, 筛选烟草抗黑胫病关键基因,
以期为该病的持续控制奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 烟草材料及处理
由中国农业科学院烟草研究所烟草种质资源库
提供高抗黑胫病烟草品种革新 3 号, 播种于温室, 选
取 8~10片真叶期长势一致的烟苗, 于根基部人工接种
黑胫病 0号生理小种菌液[10]。于人工气候箱光照培养
接菌烟苗, 箱温白天 30℃, 夜晚 25℃, 湿度≥80%。分
别在接种后第 0.5、1、3、6、10和 16 d取植株根茎, 液
氮速冻后于–70℃保存备用 , 以无菌水处理的同龄
植株作为对照。
1.2 病原菌材料
烟草黑胫病 0 号生理小种病原菌由中国农业科
学院烟草研究所植物保护研究室分离纯化, 用 0.1%
KNO3和 1%葡萄糖混合液浸泡 21 d菌龄的菌丝, 经
26℃培养 72 h后, 置 14℃处理 0.5 h, 诱导孢子囊释
放游动孢子, 镜检、调整游动孢子的浓度为每毫升
1×103~104个。
1.3 植株根茎总 RNA的提取, mRNA的分离、纯
化与 cDNA的合成
参照 EASY Spin RNA Rapid Isolation Kit for
Plant (盖宁)操作规程, 选用直接加裂解液冰浴研磨
法, 分别提取接种和对照材料 6 个时间段的根茎总
RNA, 用紫外分光光度计检测 RNA 浓度。将接种和
对照各时间段的总 RNA 分别混合, 用 PolyA Tract
mRNA Isolation System III Kit (Promega)分离、纯化
mRNA。凝胶电泳检测mRNA质量, 用M-MLV RTase
cDNA Synthesis Kit (TaKaRa)合成 cDNA。
1.4 差减杂交与抑制 PCR产物回收
以接种材料为 Tester, 对照材料为 Driver, 依照
Clontech PCR-Select cDNA Subtraction Kit操作规程
进行差减杂交, 选用 QIAquick PCR Purification Kit
对二次 PCR扩增产物纯化回收, 用1%琼脂糖凝胶电
泳检查。
1.5 cDNA文库的构建
将纯化后的二次 PCR 产物与 pGEM-T Easy
Vecter (Promega)连接, 取 1 μL连接产物于 100 μL
Top 10 F′ 感受态中, 1 KV、25 μF、400 Ω电击转化。
在含 Amp、X-gal和 IPTG的 LB固体培养基上 37℃
倒置培养 16~24 h, 挑取白色克隆摇菌培养 24 h, 加
入 50%甘油后–70℃保存备用。文库菌液以巢式引物
(nested PCR primer 1: 5-TCG AGCGGCCGCCCGG
GCAGGT-3, nested PCR primer 2R: 5-AGCGTGGT
CGCGGCCGAGGT-3)进行 PCR 扩增, 1%的琼脂糖
凝胶电泳检查。
1.6 反向 Northern斑点杂交
1.6.1 DIG探针的制备 以DIG High Prime DNA
Labeling and Detection Starter Kit II (Roche)提供的
Control DNA 为标准来标定 Tester 和 Driver 材料的
cDNA 浓度。将稀释好的梯度标记点在 Hybond-N+
尼龙膜上, 80℃烤膜 2 h, 洗膜、平衡、涂布 CSPD、
轻赶气泡、封闭四周、37℃温浴 10 min。将上述
第 10期 苏振刚等: 黑胫病菌诱导的烟草 SSH文库构建及其分析 1765
Hybond-N+膜和 X 胶片放入带感光卡的暗盒压片,
显影、定影。根据 Control和样品杂交点的大小和感
光信号强弱, 计算 DIG探针的浓度。
1.6.2 斑点杂交 从 SSH文库中随机选取 240个
阳性克隆, 扩增外源片段, 将 5 μL PCR产物移入 96
孔板中, 加等体积 0.6 mol L–1 NaOH, 吸取 1 μL变
性的 DNA点膜, 80℃烤膜 2 h。按照 10 mL 100 cm–2
的比例加入 DIG Easy Hyb, 42℃预杂交 1~3 h。将
DIG标记好的探针(25 ng mL–1杂交液)沸水变性, 按
照 3.5 mL 100 cm–2的比例加入杂交袋中, 50℃循环
水浴杂交 4~6 h。严格洗膜后, X胶片压片、显影、
定影。
1.7 差异斑点测序及分析
根据反向 Northern 斑点杂交结果, 挑取差异显
示的克隆, 由 Invitrogen技术服务部测定序列。将获
得的非冗余 ESTs 进行同源比对分析(http://blast.ncbi.
nlm.nih.gov/Blast.cgi)。
2 结果与分析
2.1 总 RNA与 mRNA的质量检测
图 1为接种和对照材料各时期根茎总 RNA电泳
检测图, RNA条带清晰。紫外分光光度计检测结果,
RNA的 OD260/OD280值在 1.72~2.11之间, 表明 RNA
的完整性和浓度均适于后续试验。
图 1 烟草根茎总 RNA的电泳检测
Fig. 1 Electrophoretic profile of total RNA of
tobacco root and stem
2.2 差减杂交结果分析
2.2.1 双链 cDNA 及酶切效果检测 根据图 2, 分
离纯化后的 mRNA 经凝胶电泳检测呈弥散带, 主要
集中在 400~1 500 bp, mRNA的浓度约为 0.6 μg μL–1,
可用于后续差减杂交。合成的 cDNA弥散分布在 200~
2 000 bp之间, 高丰度则主要集中于 300~1 400 bp。经
Rsa I酶切后, cDNA片段相对集中, 主要分布在 300~
1 500 bp之间, 最高丰度集中于400~1 200 bp (图2-B)。
2.2.2 cDNA 文库的构建与检测 经 PCR
Primer1 和烟草 Actin 基因引物检测的接头连接效率
显示(图 3), 以连接接头(adaptor)的 cDNA 为模板的
PCR扩增产物较明显(泳道 1、3、5和 7); 而以不加
接头的 cDNA 为模板的 PCR 扩增产物条带较弱(泳
道 2、4、6 和 8), 加接头的条带约是未加接头条带
亮度的 3~5 倍, 说明连接接头的模板有效作用于反
应体系, 试验中接头连接成功。
图 2 mRNA检测及 cDNA的 Rsa I酶切结果
Fig. 2 Results of mRNA and Rsa I digested cDNA
A: 1~2分别为处理和对照的 mRNA;
B: 1~4分别为酶切前后处理和对照的 cDNA。
A: 1: treated mRNA; 2: control mRNA; B: 1: treated cDNA before
digestion; 2: treated cDNA after digestion; 3: control cDNA before
digestion; 4: control cDNA after digestion.
图 3 接头连接效率检测
Fig. 3 Detection of the adaptor linkage effect
泳道 1、3、5和 7: 以连接接头的 cDNA为模板的 PCR产物; 泳
道 2、4、6和 8: 以不加接头的 cDNA为模板的 PCR产物。
Lane 1, 3, 5, 7: PCR products amplificated according cDNA with
adaptor; Lane 2, 4, 6, 8: PCR products amplificated according
cDNA without adaptor.
经两次差减和两轮抑制 PCR 扩增后, 烟草黑胫
病菌 0 号生理小种诱导产生的上调表达基因富集于
正向文库(SF)中, 而下调表达基因则富集于反向文
库(SR)中, 1-C和 2-C的作用是对比鉴定接头连接效
率的检测。其中, 上调、下调以接无菌水处理的烟
草为参照对象。
经过 30 个循环的第 1 次差减后, 以差减 cDNA
为模板的 PCR产物凝胶电泳条带较暗, SR出现 2条
明显的主带, 证明差异表达基因在此有明显富集。
二次 PCR 扩增后的条带亮度均明显提高, 条带分布
范围更广, 主要集中在 250~2 000 bp之间(图 4)。表
明经过正、反向差减杂交和 2 轮抑制 PCR, 同源基因
被有效消减, 丰度低的差异表达基因被明显富集, 差
减效果较明显。回收二次 PCR产物表明, SF、SR的回
收效率很高(图5), 测得 OD260/OD280比值为 1.95, 说
明 SF、SR的浓度满足连接转化要求。
1766 作 物 学 报 第 37卷
图 4 差减效率检测
Fig. 4 Detection of the subtraction efficiency
M: DNA 5000 bp ladder; 1: 一次 SF产物; 2: 二次 SF产物; 3: 一
次 SR产物; 4: 二次 SR产物; 5: 一次 1-C产物; 6: 二次 1-C产物;
7: 一次 2-C产物; 8: 二次 2-C产物。
M: DNA 5000 bp ladder; 1: the first PCR products of SF; 2: the
second PCR products of SF; 3: the first PCR products of SR; 4: the
second PCR products of SR; 5: the first PCR products of 1-C; 6: the
second PCR products of 1-C; 7: the first PCR products of 2-C;
8: the second PCR products of 2-C.
图 5 二次 PCR回收
Fig. 5 Products of the second PCR
M: DNA 2000 bp ladder; 1: 二次 SF产物; 2: 二次 SR产物。
M: DNA 2000 bp ladder; 1: the second PCR products of SF; 2: the
second PCR products of SR.
将纯化回收的二次 PCR 产物与 PGEM-T Easy
Vecter 连接后, 共获得 1 500 多个克隆, 其中 SF 库
白斑率约 72%, SR库白斑率约为 80%。挑取全部阳
性克隆摇菌扩繁, 将菌液经 PCR扩增, 95%以上的克
隆均能扩增出产物, 插入片段大小主要集中在 500~
1 100 bp之间(图 6), 分别将选取的 SF和 SR各 480
个阳性克隆菌液于–70℃保存备用。
2.3 反向 Northern 斑点杂交筛选
图 7 表明, 编号 1~8 的斑点直径由大到小、颜
色由深到浅, 代表了探针浓度的由大到小。接菌材
料 cDNA 的探针第 5 个点与标准样品第 2 个点的杂
交信号强度近似, 因此, 根据相应点的稀释比例计
算出接菌材料 cDNA探针浓度为 1.25×1 000/3=416.7
ng μL–1, CK 材料 cDNA探针第 5个点与标准样品的
第 3 个点的杂交信号强度近似 , 同理 , CK 材料
cDNA探针浓度为 0.625×1 000/3 =208.3 ng μL–1。
图 7 探针标记效率和浓度检测
Fig. 7 Results of the probe effect and concentration detection
Control: 对照材料 cDNA探针; Treated: 处理材料 cDNA探针;
CK: 标准 DNA探针。
Control: cDNA probe of control material; Treated: cDNA probe of
treated material; CK: DNA probe of standard sample.
根据计算出的探针浓度, 确定相应探针的使用
量, 杂交结果如图 8。对应位置的信号强弱代表差异
基因的上调或下调表达, 信号有无则代表诱导是否
产生了差异基因, 信号强弱无差异代表该基因在正
向库和反向库中均表达。正、反向杂交中的斑点信
号弱或没有信号, 表明 SSH 文库中含有很多低丰度
或极低丰度的基因。正向库中, 用 Tester探针杂交的
斑点信号强, 而与之对应位置用 CK 探针杂交的斑
点信号弱, 则强信号表示差异基因上调表达; 同理,
反向库在 CK 探针作用下, 斑点信号强代表差异基
因下调表达。根据该原理, 筛选出差异表达的阳性
克隆 , 如 SF-T 中紫色箭头所示为上调表达基因 ,
SR-CK中紫色箭头所示为下调表达基因。
2.4 差异基因测序及分析
根据反向 Northern 斑点杂交筛选结果, 挑选差
异明显的 57个阳性克隆测序, 获得了 54条 EST, 去
非重复序列与已知基因具有很高的同源性 , 占
48.5%。在已知功能的 EST 中, 42.4%的序列与来源
于烟草、茄、番茄、马铃薯等茄科植物的序列同源
图 6 菌液 PCR扩增检测插入片段
Fig. 6 PCR detection of the inserted fragments
第 10期 苏振刚等: 黑胫病菌诱导的烟草 SSH文库构建及其分析 1767
图 8 cDNA文库反向 Northern杂交结果
Fig. 8 Reverse-Northern blot results of the clones from the SSH cDNA library
SF-T: 正向文库处理; SF-CK: 正向文库对照; SR-CK: 反向文库对照; SR-T: 反向文库处理; SF-T中紫色箭头所示为上调表达基因;
SR-CK中紫色箭头所示为下调表达基因。
SF-T: clones from the forward-library of treated material; SF-CK: clones from the forward-library of control material; SR-CK: clones from
the reverse-library of control material; SR-T: clones from the reverse-library of treated material; Purple arrow shown the up-regulated genes
in SF-T; Purple arrow shown the down-regulated genes in SR-CK.
性匹配较高。按照 Bevan等[11]的植物基因功能分类
标准, 对来源于 cDNA 文库已知功能的基因进行分
析。比对结果显示, 参与免疫应答和能量代谢的相关
基因最多, 包括烟草病程相关 PRs蛋白、半胱氨酸蛋
白、精胺合成酶、延伸因子 1-α、细胞色素 P450、α-
微管蛋白、蛋白激酶 2、过氧化物酶体膜蛋白、磷酸
丝氨酸磷酸酶、核糖体蛋白 S4等。编号为 A2-25的
序列与已知烟草抗黑胫病基因重叠群具有较高的同
源性。54条 ESTs中, 病程相关蛋白出现频率最高(达
9次), 细胞色素 P450出现了 4次, 衰老相关蛋白出现
了 3 次。说明烟草在受到黑胫病病原菌的侵染后, 植
物体内抗病免疫程序启动系列应答反应, 在基因上表
现为 mRNA 应答的多样性; 同时, 也表明烟草对黑胫
病的抗病机制是一个由多基因协同调控的复杂过程。
如表 1所示, 涉及信号传导、转录调节的 ESTs共 4个,
编号为 A1-62、B1-45、B2-78 和 A2-88; 涉及光合作
用的相关基因有 2个, 为 B2-93和 B2-74; 涉及跨膜转
运的基因有 5个, 为 B2-81、B2-80、B2-76、B2-73和
A2-82; 涉及结构功能代谢酶类基因有 6 个, 分别为
A1-44、A2-24、A2-79、A3-4、B2-90和 B2-8; 编码保
护、胁迫耐受基因的 13个, 占差异表达基因的 39.4%;
另外, 编号为 A2-33、A2-39和 A2-69的 3个 EST功
能不详。
3 讨论
SSH 技术广泛应用于差异表达 cDNA 文库的构
建及抗性基因领域的研究, 该技术可以富集差异表
达基因 , 要求供试材料的背景尽可能一致 , 同时
mRNA必须达到足够的量(一般不少于 2 μg)以避免低
丰度表达的差异基因漏选[12]。8~10片真叶的烟草, 根
茎中含有大量的木质化组织, 研磨是否充分将影响
RNA 的提取质量。本实验选用直接加裂解液冰浴研
磨法, 有效地降低了多糖和其他杂质的污染。运用
SSH 技术结合反向 Northern 杂交技术来探究烟草黑
胫病 0 号生理小种与其抗性基因非亲和互作过程所
涉及的生理应答反应, 获得了在烟草中多个差异表
达或优先表达的 cDNA 片段, 初步分析了病菌侵染
后的调控机制。
近年来相关植物的抗病研究表明, 抗、感品种生
化特性的差异在抗性方面发挥着重要作用, 诱导反应
产生的氨基酸种类与数量存在明显差异。氨基酸与蛋
白交联, 有助于提高植物对病原菌的抵抗力, 王雪
等[13]、刘素萍等[14]和潘凯等[15]对大豆抗胞囊线虫病、
棉花枯萎病和黄瓜抗枯萎病的研究中发现, 甘氨酸与
病情指数呈负相关; 而精氨酸和半胱氨酸与病情指数
呈正相关, 富含半胱氨酸的蛋白酶是一种抑制剂, 可
以抑制真菌生长。本研究获得了编码半胱氨酸、甘氨
酸、丝氨酸等的基因, 可能属于烟草抗性调控基因,
病菌侵染后烟草抗病植株的甘氨酸含量可能会升高,
主要因素是植株迅速启动免疫应答系统, 甘氨酸发挥
抗病作用, 富含半胱氨酸的蛋白酶可能具有侵害真菌
细胞壁的作用, 从而破坏膜的完整性, 抑制菌丝活性。
本研究发现的细胞色素 P450在植物体中担当重
要的功能, 可形成传递电子的酶。茄科类 P450 主要
分属 14 个家族, 能够催化调控固醇合成途径[16]、次
生代谢物的合成[17]、单萜或吲哚生物碱的合成[18]、
烟草的抗病性[19]等 50多种次级代谢反应。植株受侵
染时, 细胞色素 P450 可能催促胁迫信号的产生、活
化植保素的分泌来增强植株的抗病性, 从而抑制病
原菌的生长。由此, 这些与植物防御反应相关基因优
表 1 差异片段与 GenBank中已知基因的同源性比较结果
Table 1 Homology of the fragments with the function identified genes in GenBank
克隆编号
Sample code
登录号
Accession No.
长度
Length (bp)
同源基因
Homology identification
种属
Species and genus
同源性
Identity (%)
E值
E-value
A1-44 BAE97401.1 876 Mitogen-activated protein kinase 2 Nicotiana tabacum 99 6.00E–88
A1-57 CAA45103.1 1008 Eukaryotic initiation factor 5A Nicotiana plumbaginifolia 97 5.00E–71
A1-62 BAA09709.1 1079 Elongation factor-1 alpha Nicotiana tabacum 97 3.00E–102
A1-68 BAA14220.1 978 PR1a protein precursor Nicotiana tabacum 81 4.00E–51
B1-12 BAA10929.1 1059 Cytochrome P450 like_TBP Nicotiana tabacum 92 3.00E–46
B1-29 ACA04850.1 1037 Senescence-associated protein Picea abies 100 1.00E–30
B1-45 CAO02550.1 966 Ribosomal protein S4 Vigna unguiculata 98 5.00E–24
A2-11 AK339714.1 1031 Solanum lycopersicum cDNA Solanum 95 0.0
A2-24 CAE55204.1 1010 Protein kinase 2 Nicotiana tabacum 80 6.00E–47
A2-25 FP929133.1 1009 Leptosphaeria maculans v23.1.3 lm_Super Contig_15_v2 genomic supercontig, whole genome Nicotiana tabacum 98 1.00E–19
A2-33 XP_002281075.1 1010 Hypothetical protein Vitis vinifera 75 7.00E–22
A2-39 ACU20548.1 964 Unknow Glycine max 95 2.00E–45
A2-55 AY608405.1 1029 Cysteine protein Unknown 99 0.0
A2-60 AJ420893.1 1043 Entandrophragma cylindricum Unknown 96 0.0
A2-69 AM229059.1 1029 RAPD markers tea Camellia sinensis 98 2.00E–175
A2-79 CAE54353.1 1041 Spermine synthase Solanum 96 5.00E–99
A2-81 U04633.1 988 Wisconsin 38 vitronectin-like adhesion protein mRNA Nicotiana tabacum 100 0.0
A2-82 XM_002510869.1 1029 Protein PPLZ12 Ricinus communis 86 3.00E–111
A2-83 AY607406.1 1013 Glycine for the elongation factor-1α Solanum 89 4.00E–53
A2-88 AM412177.1 1008 Phytophthora cinnamomi tub1 gene for alpha-tubulin, strain Pr120 Phytophthora cinnamomi 96 3.00E–48
A2-89 AC215459.2 1034 Solanum lycopersicum chromosome 2 clone C02SLe0089P21 Solanum tuberosum 60 4.00E–131
A2-91 P07053.1 1013 Pathogenesis-related protein 1B Nicotiana tabacum 91 3.00E–51
B2-8 XP_002514657.1 1029 Phosphoserine phosphatase, putative Ricinus communis 76 3.00E–44
B2-35 PX11B_ARATH 955 Peroxisomal membrane protein Pisum sativum 80 1.00E–43
B2-73 XP_002528039.1 979 Sugar transporter Ricinus communis 92 1.00E–43
B2-74 ACO51067.1 982 Chloroplast chlorophyll A-B binding protein Gossypium hirsutum 93 4.00E–74
B2-76 XM_002526152.1 1024 Ricinus communis sec15, mRNA Ricinus communis 87 3.00E–142
B2-78 NP_191223.1 1012 Exocyst complex subunit Sec15-like family protein Arabidopsis thaliana 68 4.00E–113
B2-80 GU474419.1 1008 Synthetic construct modified HIV-1 subtype C backbone Unknown 44 3.00E–82
B2-81 ADE34289.1 1009 Aquaporin TIP2 Gossypium hirsutum 90 4.00E–41
B2-90 ADJ00052.1 936 Chloramphenicol acetyltransferase Unknown 97 1.00E–16
B2-93 YP_002970675.1 987 Cytochrome b6/f Alsophila spinulosa 97 1.00E–12
A3-4 P21568.1 1027 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase Solanum tuberosum 90 3.00E–38
第 10期 苏振刚等: 黑胫病菌诱导的烟草 SSH文库构建及其分析 1769
先表达, 可以作为提高烟草抗病性的靶基因, 深入探
究其功能。
本研究发现的 EF1-α 的基因表达调控十分保守,
包含一个强启动子, 在信号转导[20]、蛋白合成[21]、细
胞骨架[22-23]、Rho 相关激酶和细胞凋亡[24]等方面发挥
重要作用, 可能参与了翻译控制、细胞生长、应激反应
等重要环节。Chen等[25]研究表明, EF1-α在心肌细胞株
氧化应激诱导的凋亡过程发挥重要的正调节作用。
病程相关蛋白(PR)是一种由病原菌诱导产生的
细胞壁结构蛋白, 一方面能促进木质素和木栓质的
生物合成, 另一方面可以水解真菌细胞壁中的几丁
质和葡聚糖, 从而抑制病菌的生长[26], 与植物系统
性获得抗性的产生存在密切关系。PR1 家族是一个
独特的高度保守的蛋白质组, 与真菌、无脊椎动物
中的一些蛋白具有同源基因或同源结构基序 [27]。
PR1b出现频率较高, 说明该蛋白参与了烟草抗黑胫
病菌侵染的免疫应答反应, 二者长期互作过程中自
然选择形成一系列有效防御系统, 在保持生物体存
活方面可能起重要的作用。PR作用机能可能是一个
复杂的信号转导机制, 当烟草受到黑胫病菌侵染时
表现抗性应答反应。
除上述相关基因外 , 本研究还发现许多与生
物、非生物胁迫相关的基因, 包括水通道蛋白、α-
微管蛋白、核糖体蛋白 S4、有丝分裂原激活蛋白激
酶 2、真核细胞起始因子、氯霉素乙酰转移酶等据
此推测, 在植物中可能存在涉及能量转换、信号转
导等共同作用的外界胁迫抵御机制。为进一步了解
烟草抗黑胫病的侵染过程, 后续试验将从抗病基因
的表达水平探究差异表达基因的丰度、种类及其互
作关系等方面开展, 继续对 cDNA 文库筛选、测序
和分析 , 重点开展烟草免疫代谢调控的相关研究 ,
并克隆关键抗病基因。
4 结论
构建了烟草黑胫病菌 0 号生理小种诱导的烟草
非亲和互作 SSH cDNA文库, 共获得 33条非重复序
列。初步明确了烟草与黑胫病菌互作过程中相关差
异表达基因的种类及丰度。推测烟草病程相关 PR1b
蛋白、半胱氨酸蛋白、衰老相关蛋白、甘氨酸基因
等参与了烟草的抗病过程, 在烟草与黑胫病菌不亲
和互作过程中可能发挥重要作用; EF1-α、α-微管蛋
白、水通道蛋白、过氧化物酶体膜蛋白等参与了抗
病信号传导过程。延伸因子 1-α (A1-62)、细胞色素
P450 (B1-12)、病程相关蛋白(A2-91)、衰老相关蛋
白(B2-72)等可作为克隆全长的候选基因。
References
[1] Zhu X-C(朱贤朝), Wang Y-T(王彦亭), Wang Z-F(王智发). To-
bacco Diseases in China (中国烟草病害). Beijing: China Agricul-
ture Press, 2002. pp 21–37 (in Chinese)
[2] Hou M-S(侯明生), Huang J-B(黄俊斌). Agricultural Plant Pa-
thology (农业植物病理学). Beijing: Science Press, 2011. pp
321–334 (in Chinese)
[3] Shang Z-Q(尚志强). Recent research advance on pathogen and
disease occurrence of tobacco black shank and its integrated con-
trol. Rev China Agric Sci Technol (中国农业科技导报), 2007,
9(2): 73–76 (in Chinese with English abstract)
[4] Wang D-L(王德龙), Ye W-W(叶武威), Wang J-J(王俊娟), Song
L-Y(宋丽艳), Fan W-L(樊伟丽), Cui Y-P(崔宇鹏). Construction
of SSH Library and its analyses of cotton drought associated
genes under drought stress. Acta Agron Sin (作物学报), 2010,
36(12): 2035–2044 (in Chinese with English abstract)
[5] Diatchenko L, Lau Y F, Campbell A P, Chenchik A, Moqadam F,
Huang B, Lukyanov S, Lukyanov K, Gurskaya N, Sverdlov E D,
Siebert P D. Suppression subtractive hybridization: a method for
generating differentially regulated or tissue specific cDNA probes
and libraries. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93: 6025–6030
[6] Botha A M, Lacock L, van Niekerk C, Matsioloko M T, du Preez F
B, Eduard Venter S L, Kunert K J, Cullis C A. Is photosynthetic
transcriptional regulation in Triticum aestivum L. cv. ‘TugelaDN’
a contributing factor for tolerance to Diuraphis noxia (Homop-
tera: Aphididae)? Plant Cell Rep, 2006, 25: 41–54
[7] Li Y-J(李艳军), Zhang X-Y(张新宇), Yang H-N(杨会娜), Tian
X-H(田新惠), Sun J(孙杰). Isolation of specifically expressed
genes in brown colored cotton by suppression subtractive hy-
bridization. Mol Plant Breed (分子植物育种), 2009, 7(1): 194–
198 (in Chinese with English abstract)
[8] Peng Q(彭琦), Hu Y(胡燕), Du P-F(杜培粉), Xie Q-X(谢青轩),
Ruan Y(阮颖), Liu C-L(刘春林). Construction of SSH library
with different stages of seeds development in Brassica napus L.
Acta Agron Sin (作物学报), 2009, 35(9): 1576–1583 (in Chinese
with English abstract)
[9] Tian Z D, Liu J, Xie C H. Isolation of resistance related-genes to
Phytophthora infestans with suppression subtractive hybridiza-
tion in the R-gene-free potato. Acta Genet Sin, 2003, 30: 597–605
[10] McIntyre J L, Taylor G S. Sereening tobacco seedling for resis-
tance to Phytophthora parasitica var. nicotianae. Phytopathology,
1976, 66: 70–73
[11] Bevan M, Bancroft I, Bent E, Love K, Goodman H, Dean C,
Bergkamp R, Dirkse W. Analysis of 1.9 Mb of contiguous se-
quence from chromosome 4 of Arabidopsis thaliana. Nature,
1998, 391: 485–488
[12] Ji W, Wright M B, Cai L, Flament A, Lindpaintner K. Efficacy
of SSH PCR in isolating differentially expressed genes. BMC
1770 作 物 学 报 第 37卷
Genomics, 2002, 3: 12
[13] Wang X(王雪), Duan Y-X(段玉玺), Chen L-J(陈立杰), Wang
Y-Y(王媛媛). Correlation analysis of amino acids components in
soybean cultivars root exudates and resistance to soybean cyst
nematode. J Shenyang Agric Univ (沈阳农业大学学报), 2008,
39(6): 677–681 (in Chinese with English abstract)
[14] Liu S-P(刘素萍), Wang R-X(王汝贤), Zhang R(张荣), Yang
Z-W(杨之为). Effects of sugar and amino acid in root exudation
of different resistant cotton cultivars on cotton fusarium wilt
pathogen. Acta Univ Agric Boreali-occidents (西北农业大学学
报), 1998, 26(6): 30–35 (in Chinese with English abstract)
[15] Pan K(潘凯), Wu F-Z(吴凤芝). Correlation analysis of amino
acids components in cucumber root exudates and fusarium wilt
resistance. Acta Ecol Sin (生态学报), 2005, 27(5): 1945–1950
(in Chinese with English abstract)
[16] Burger C, Rondet S, Benveniste P, Schaller H. Virus-induced
silencing of sterol biosynthetic genes: identification of a
Nicotiana tabacum L. obtusifoliol-14α-demethylase (CYP51) by
genetic manipulation of the sterol biosynthetic pathway in
Nicotiana benthamiana L. J Exp Bot, 2003, 54: 1675–1683
[17] Hutvάgner G, Barta E, Bάnfalvi Z. Isolation and sequence analy-
sis of a cDNA and a related gene for cytochrome P450 proteins
from Solanum chacoense. Gene, 1997, 188: 247–252
[18] Irmler S, Schröder G, St-Pierre B, Crouch N P, Hotze M,
Schmidt J, Strack D, Matern U, Schröder J. Indole alkaloid
biosynthesis in Catharanthus roseus: new enzyme activities and
identification of cytochrome P450 CYP72A1 as secologanin
synthase. Plant J, 2000, 24: 797–804
[19] Takemoto D, Hayashi M, Doke N, Takemoto D, Hayashi M,
Doke N, Nishimura M, Kawakita K. Molecular cloning of a de-
fense-response-related cytochrome P450 gene from tobacco.
Plant Cell Physiol, 1999, 40: 1232–1242
[20] Chang J S, Seok H, Kwon T K, Min D S, Ahn B H, Lee Y H, Suh
J W, Kim J W, Iwashita S, Omori A, Ichinose S, Numata O, Seo J
K, Oh Y S, Suh P G. Interaction of elongation factor-1 alpha and
pleckstrin homology domain of phospholipase C-gamma 1 with
activating its activity. J Biol Chem, 2002, 277: 19697–19702
[21] Bassell G J, Powers C M, Taneja K L, Singer R H. Single
mRNAs visualized by ultrastructural in situ hybridization are
principally localized at actin filament intersections in fibroblasts.
J Cell Biol, 1994, 126: 863–876
[22] Bunai F, Ando K, Ueno H, Numata O. Tetrahymena eukaryotic
translation elongation factor 1A (eEF1A) bundles filamentous
actin through dimer formation. J Biochem (Tokyo), 2006, 140:
393–399
[23] Murray J W, Edmonds BT, Liu G, Condeelis J. Bundling of actin
filaments by elongation factor 1 alpha inhibits polymerization at
filamentends. J Cell Biol, 1996, 135: 1309–1321
[24] Duttaroy A, Bourbeau D, Wang X L, Wang E. Apoptosis rate can
be accelerated or decelerated by overexpression or reduction of
the level of elongation factor-1 alpha. Exp Cell Res, 1998, 238:
168–176
[25] Chen E, Proestou G, Bourbeau D, Wang E. Rapid up-regulation
of peptide elongation factor EF-1 alpha protein levels is an im-
mediate early event during oxidative stress-induced apoptosis.
Exp Cell Res, 2000, 259: 140–148
[26] Münch G S, Neuhaus J M, Boller T, Kemmerling B, Kogel K H.
Expression of beta-1,3-glucanase and chitinase in healthy, stem-
rust-affected and elicitor-treated near-isogenic wheat lines show-
ing Sr5- or Sr24-specified race-specific rust resistance. Planta,
1997, 201: 235–244
[27] Ebner C, Hoffmann-Sommergruber K, Breiteneder H. Plant
food allergens homologous to pathogenesis-related proteins.
Allergy, 2001, 56: 43–44