全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(1): 2839 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(30971776)和《科技导报》博士生创新研究计划项目(KJDB200902-14)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 叶兴国, E-mail: yexg@mail.caas.net.cn, Tel: 010-82109765
第一作者联系方式: E-mail: ahxiaoshe@126.com, Tel: 010-82108748
Received(收稿日期): 2010-07-19; Accepted(接受日期): 2010-10-05.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.00028
小麦亚硝酸还原酶基因及调控序列克隆、定位和表达分析
佘茂云 1 陈朵朵 2 冯 晨 3 杜丽璞 1 叶兴国 1,*
1 中国农业科学院作物科学研究所 / 国家农作物基因资源与基因改良重大科学工程 / 农业部作物遗传育种重点开放实验室, 北京
100081; 2 武汉大学生命科学学院, 湖北武汉 430072; 3 北京城市学院, 北京 100083
摘 要: 利用 in silico及反向 PCR技术, 从小麦中克隆了亚硝酸还原酶编码基因及其调控序列, 进一步利用原核诱导
表达、半定量 RT-PCR、AS-PCR及生物信息学手段对克隆的新基因进行鉴定及染色体定位分析。开放阅读框预测结
合测序结果表明, 该基因 gDNA长 2 881 bp, 包含 4个外显子和 3个内含子, cDNA长 1 830 bp, GenBank登录号分别
为 FJ555239 和 FJ527909, 预测编码产物大小约为 65.7 kD, 与 NCBI 已公布的亚硝酸还原酶基因编码产物同源性达
60%以上, 其中与其他单子叶谷类作物同源性达 80%以上。IPCR技术延伸该基因 5′端侧翼序列至2 924 bp (以 ATG
起始计算), 经 1 mmol L1 IPTG诱导后可表达大小约为 70 kD的蛋白(含约 3.8 kD的组氨酸标签)。RT-PCR结果显示,
30 mmol L1 KNO3处理小麦幼苗 1 h, 亚硝酸还原酶基因表达量最高。酶活性测定表明, 随着 KNO3处理时间延长亚
硝酸还原酶活性增强。AS-PCR检测发现, 该基因在普通小麦 6A及 6B染色体上至少各存在 1个拷贝。
关键词: 小麦; 亚硝酸还原酶; 表达分析; 启动子; 染色体定位
Isolation, Chromosome Assignment, and Expression Assay of Nitrite Reductase
Gene and Regulatory Sequence in Wheat
SHE Mao-Yun1, CHEN Duo-Duo2, FENG Chen3, DU Li-Pu1, and YE Xing-Guo1,*
1 Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences / National Key Facility of Crop Gene Resources and Genetic Improvement /
Key Laboratory of Crop Genetic and Breeding, Ministry of Agriculture, Beijing 100081, China; 2 Institute of Life Science, Wuhan University, Wuhan
430072, China; 3 Beijing City University, Beijing 100083, China
Abstract: Nitrite reductase is wildly involved in N metabolism in plants and has shown excellent relevance to regeneration poten-
tial in the tissue culture of rice (Oryza sativa L.). In this study, in silico and inverse PCR techniques were employed to isolate
nitrite reductase encoded gene and its regulatory sequences from wheat (Triticum aestivum L.). This gene was predicted to contain
four exons and three introns. The gDNA and cDNA sequences were 2 881 bp and 1 830 bp in length, respectively, and they were
both submitted to GenBank under the accession numbers FJ555239 and FJ527909. Its deduced encoding protein product was ap-
proximately 65.7 kD, sharing high (more than 60%) identity with other nitrite reductase genes deposited in the NCBI database,
especially with those from other monocot cereal crops (more than 80%). The 5′ flanking region was isolated and extended to
2 924 bp (counting from the start code: ATG) through inverse PCR. After induced by 1 mmol L1 IPTG, a protein of ca. 70 kD
was obtained in prokaryotic expression vector pET-28a, including a histidine tag of ca. 3.8 kD. The highest expression of gene in
wheat seedlings was induced by 30 mmol L1 KNO3 for 1 h. Measurement on nitrite reductase activity showed the enzyme acti-
vity increased following the treatment time extension at 5-d intervals under the above same condition. According to the result of
AS-PCR analysis, at least one copy of the gene existed on chromosome 6A and 6B each in common wheat. The study provides a
basis for functional determination of wheat nitrite reductase gene in subsequent research.
Keywords: Wheat; Nitrite reductase; Expression assay; Promoter; Chromosome assignment
氮是组成各种生物大分子的必需元素之一, 氮
代谢在整个生物界特别是在植物界的生命活动过程
中起着重要作用。从分子角度对氮素摄入、利用、
储存等代谢调控网络进行研究, 对于提高作物产量
第 1期 佘茂云等: 小麦亚硝酸还原酶基因及调控序列克隆、定位和表达分析 29


和品质具有重要意义[1]。
小麦(Triticum aestivum L.)是世界上第一大粮食
作物, 在我国是仅次于水稻的第二大粮食作物。小
麦产量及品质一直备受关注, 其中小麦籽粒品质与
氮代谢密切相关。小麦生存环境中存在大量的无机
硝态氮, 但它们不能直接作为合成各种氨基酸和其
他有机氮化物的前体而参与氮代谢过程, 必须先转
变成铵态氮, 在此过程硝酸还原酶(nitrate reductase,
NR; EC: 1.6.6.1)和亚硝酸还原酶(nitrite reductase,
NiR; EC: 1.7.7.1)发挥着重要作用。前者利用铁氧还
蛋白(ferredoxin, Fd)或 NAD(P)H为电子供体在细胞
质中催化硝态氮还原成亚硝态氮, 该酶广泛存在于
生物界 , 目前对其研究报道较多 [2-7]。在此过程中 ,
由 H+-ATPase 作用产生的膜两侧质子梯度及电化学
梯度确保外界的硝酸盐源源不断通过细胞质膜系统
运送到细胞内, 这种硝酸盐摄入方式在整个生物界
十分相似[2]。在高等植物叶片中, 从 NO2−到 NH4+的
同化在叶绿体中进行, 通过电子供体铁氧还蛋白由
亚硝酸还原酶完成 [8], 而在根中则在质体中进行
NO2−的还原反应[9], 从而减少正常条件下植物体内
亚硝态氮积累 , 降低因亚硝酸累积对生物体的毒
害作用。通过上述两步还原产生的 NH4+最终通过谷
氨酰胺合酶 /谷氨酸合酶循环 (glutamine synthase/
glutamate synthase, GS/GOGAT)转变为有机氮 , 作
为合成其他氨基酸的供体[10-11]。
不同氮源对植物组织培养过程影响很大。李玉
峰等[12]发现低剂量范围(1.0×1016~2.0×1016 ions cm2)
的氮离子注入能明显提高水稻成熟胚愈伤组织诱导
率, 抑制褐化衰老, 提高愈伤组织绿苗分化率。优化
培养基中铵态氮与硝态氮比例促进了马铃薯愈伤细
胞的生长[13]。采用丙氨酸替代硫酸铵作为氮源, 同
时降低蔗糖浓度提高了水稻品种 Koshihikari (Oryza
sativa subsp. japonica)的组织培养效率[14]。
在硝态氮转变为铵态氮过程中, NiR也如同 NR
一样发挥了重要作用[15]。该酶属单体酶, 分子量约
60~70 kD, 包含 2个氧化还原中心, 即铁-西罗血红
素中心(siroheme-Fe)和铁-硫(iron-sulfur)中心, 其 C
端构成氧化还原活性中心, 而 N 端主要负责结合还
原型铁氧还蛋白[16]。近年来, 随着转基因技术的不
断推广和应用, 提高低再生植物品种再生能力已受
到普遍关注。Nishimura 等[17]利用 QTL 等对控制水
稻组织培养再生相关基因进行了定位, 发现 NiR 编
码基因与水稻品种 Kasalath (O. sativa subsp. indica)
组织培养高再生性能密切相关, 利用转基因技术将
Kasalath 中 NiR 编码基因导入再生能力差的水稻品
种 Koshihikari, 使后者再生能力明显提高。随后 ,
Ozawa等[18]也在高再生水稻品种 Konansou (O. sativa
subsp. indica)组织培养中发现了同样现象, 并利用
该基因开发了一种新型的植物转化载体, 提高低再
生水稻品种再生能力的同时解决了常用抗生素选择
标记带来的转基因安全问题。Koshihikari 的低再生
能力是由于离体培养细胞内 NiR的低活性引起大量
NO2累积所致[17-18]。Ogawa等[19]发现水稻中 NR和
NiR编码基因表达不一致也会导致低再生性状。
NiR 编码基因主要在高等植物的叶和根中表
达[20-21]。在皱叶烟草(Nicotiana plumbaginifolia)及拟
南芥(Arabidopsis thaliana)中, NiR 编码基因的表达
受到转录水平上光及氮源的调控, 然而其活性及含
量受到转录后水平上氮源的控制[22]。目前, 已在大
豆(Glycine max, GenBank登录号为 AAB50233)、玉
米(Zea mays)[23]、水稻(O. sativa)[17-18]、大麦(Hordeum
vulgare)[21]等重要作物中克隆到该基因编码序列 ,
但在小麦中仅有 NiR 生理方面研究报道, 从分子角
度对其编码基因及蛋白特性的研究还未见报道, 可
能的原因是 NiR 突变株的不易获得[24]。据此, 本研
究根据GenBank中水稻NiR基因(登录号为D50556),
利用 in silico技术及 IPCR技术从小麦中克隆该基因
及调控序列, 并对克隆的 NiR 基因进行表达分析和
染色体定位研究, 为后续体外分析该基因的功能并
通过转基因手段研究该基因奠定基础。分子解析小
麦 NiR 基因将有助于从分子角度认识氮循环的调控
机制, 为提高小麦组织培养再生能力提供基因资源,
为合理利用氮肥并提高氮肥利用率提供理论指导。
1 材料与方法
1.1 植物材料及其 DNA提取
普通小麦(T. aestivum L.)品种(系)CB037、中国
春、Bobwhite、新春 9号、京 411、京 771、济麦 22、
科农 199、宁春 4号、轮选 987、中国春第六同源群
缺体-四体(N6AT6B、N6AT6D、N6BT6A、N6BT6D、
N6DT6A 和 N6DT6B)、中国春双端体 6BL 及 6BS
从相关育种单位或种质资源库中收集, 本课题组保
存; 四倍体代换系材料(由中国春与二倍体 DD 基因
组野生种 Landon 代换产生)由中国农业科学院作物
科学研究所孔秀英研究员惠赠。10个普通小麦品种
(系)在本研究中用于亚硝酸还原酶基因和调控序列
30 作 物 学 报 第 37卷

克隆及亚硝酸还原酶基因表达特性和亚硝酸还原酶
活性分析 , 中国春第六同源群缺体-四体、双端体
6BL 及 6BS、四倍体代换系用于亚硝酸还原酶基因
染色体定位。
利用 SDS法从小麦叶片中提取基因组DNA, 用
于亚硝酸还原酶基因和调控序列扩增。
1.2 RNA提取与 cDNA合成
取 CB037 小麦种子进行水培养, 待种子萌动后
种于蛭石中, 3周后进行 30 mmol L1 KNO3处理, 分
别取处理 0、1、2、4和 8 h时叶片, 液氮速冻后保
存。采用 TRNzol Kit试剂盒(北京天根生物公司), 按
照说明书描述的方法从小麦叶片中提取总 RNA。按
PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa,
大连)操作说明合成 cDNA第一链。
1.3 小麦 NiR基因序列获得
根据已发表的水稻NiR序列, 利用 in silico技术
从 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中搜索相关的
小麦 EST, 用 CodonCode version 2.0.4 (CodonCode
Corporation, Dedham, MA, USA; http://www.codon-
code.com/)进行序列拼接和全长预测。根据拼接序列,
利用 DNAMAN version 6.0软件(http://www.lynnon.
com/)在预测的 5′和 3′ UTR区域设计扩增 cDNA及
gDNA全长序列的引物 , 分别为 5′-ATGTCTTCC
TCGGCCTCCCTG-3和 5′-GCAGAGGGAGGGGCA
TACACTG-3′。
1.4 小麦 NiR基因及调控序列克隆和 ORF预测
采用 Touch-down PCR 进行小麦 NiR 的 gDNA
及 cDNA 扩增。PCR 扩增体系中包含 1 µL 基因组
DNA (30 ng µL1)或 cDNA(原液 40 倍稀释), 0.25
mmol L1 dNTP (4 种 dNTP 等量混合液), 2×GC
I buffer (TaKaRa, 大连)10 µL, 0.75 U Ex-Taq 酶
(TaKaRa, 大连), 补水至 20 µL。PCR 扩增条件为
94℃变性 4 min; 然后 94℃变性 40 s, 70~60℃退火
40 s, 每循环降 1 , 72℃ ℃延伸 1 min 30 s, 共 11个循
环; 94℃变性 40 s, 60℃退火 40 s, 72℃延伸 90 s, 共
20个循环; 最后 72℃延伸 10 min。用 1%琼脂糖凝
胶电泳回收目的片段。连入 pTrans-T simple载体(北
京全式金生物技术公司)后测序确认。利用 NCBI中
ORF (open reading frame) Finder 及在线软件
FGENESH+ (http://linux1.softberry.com/berry.phtml)
进行 ORF、内含子及调控元件预测。
根据 IPCR 原理, 以小麦品种 CB037 基因组
DNA为模板, 进行 3轮延伸以分离 NiR 5′端侧翼序
列。每轮延伸采用两套嵌套引物, 按 Touch-down程
序扩增 , 所用引物如表 1 所示。采用 CodonCode
version 2.0.4软件对 3次延伸结果进行拼接, PCR方
法确认延伸的全长序列, PnirF为 5′-AAGCTGACGG
AGGGGCGGCCTT-3′, PnirR为 5′-GGCCGCTGCTT
GTGGTGGTG-3′, 同时采用此对引物在不同的小麦
中进行扩增后比对分析。

表 1 IPCR扩增引物及方法
Table 1 Primers and model of IPCR
延伸循环数
Extension cycle
酶(识别位点)
Enzyme (recognition site)
引物序列
Primer sequence (5′–3′)
I Nhe I (GCTAGC) F1: CACCATCGCAAAGTTCATCGT; F2: GGCCTTACTATTCTTGATCGATG
R1: CGTCCTCCTTGGTGAGCTTGT; R2: TACTTCTCCTTGAGCACCCAGT
II Spe I (ACTAGT) F1: GTAGGTGGTTAAGGTTACAATG; F2: GCGAAAACATTATTTAGTGATCAC
R1: GGATGCGGTTGAATAAATTATC; R2: ATCCTCGTAAACGCCACCATTT
III Hind III (AAGCTT) F1: CCTTTCCTGTCATTCCAATCACA; F2: CCTTCTCGACTCAAAACTTCCTT
R1: CCCCCTATAGGCTATAGGCTCTGT; R2: ACTCCTGGTGCCTCACCTTTG

1.5 同源比对和聚类分析
根据小麦 NiR 的氨基酸序列, 运用 blastp 在
NCBI 中进行同源比对; 利用在线 clustalW2 (http://
www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html)对搜索到
的相关物种的 NiR基因聚类分析。利用 Mega 4.0软
件包中Neighbor-Joining构建系统发育树, 参数设置
为 1 000个 bootstraps。
1.6 原核诱导表达和半定量 RT-PCR分析
通过 ExPASy (http://www.expasy.org/)在线对
NiR编码产物化学性质进行预测。运用 PCR方法将
NiR cDNA片段两端分别添加 EcoR I及 Hind III酶
切位点, 引物序列为 NiRETF: 5′-TATGAATTCATG
TCTTCCTCGGCCTCCCTG-3′, NiRETR: 5′-TCCAA
GCTTCTCCTCGTCCTCCTCCCTCTCC-3′ (下画线
为添加的酶切位点), 退火温度为 65℃ , 片段大小
为 1 791 bp。双酶切后连接到 pET-28a载体上, 转
化大肠杆菌 BL21, 然后 37℃、220 r min1孵育 2 h,
至 A600=0.5, 加入 1 mmol L1 IPTG进行诱导表达,
第 1期 佘茂云等: 小麦亚硝酸还原酶基因及调控序列克隆、定位和表达分析 31


分别取诱导 0、1、2和 4 h样品进行 SDS-PAGE分
析。
利用小麦 tubulin 进行模板均一化, 后进行 NiR
半定量分析。tubulin及 NiR半定量分析引物分别为
tubulinF: 5′-TCCTCCTATGCCCCAGTGATC-3′, tu-
bulinR: 5′-ACTCATCGCCCTCATCACCG-3′, 退火
温度为 61℃, 片段大小为 544 bp; NiRRTF: 5′-AGGC
CATCATCGAGACCAAG-3′, NiRRTR: 5′-CTACTCC
TCGTCCTCCTCCCTC-3′, 退火温度为 60℃, 片段
大小为 347 bp。
1.7 亚硝酸还原酶活性测定
10个小麦材料 CB037、中国春、Bobwhite、新
春 9号、京 411、京 771、济麦 22、科农 199、宁春
4号和轮选 987同样在水中萌发, 在蛭石中生长 3周
后进行 30 mmol L1 KNO3处理, 分别在处理 0、5、
10、15和 20 d时取叶片测定亚硝酸还原酶活性[18],
每个样品重复测定 3 次, 求其平均值。酶活性定义
为每克小麦鲜叶 1 h 内还原 NO2的微摩尔数(µmol
g1 h1)。采用 SAS统计软件对多次测定结果进行统
计分析[25], 数据多重比较采用 Tukey法。
1.8 基因定位分析
利用小麦与水稻基因组之间的线性关系, 结合
已定位的小麦 EST, 通过 Blastn 工具搜索水稻 NiR
基因的 EST 序列, 比对结果中排除 E 值高于 1E10
的 EST。利用 GrainGenes 2.0 (http://wheat.pw.usda.
gov/GG2/index.shtml)在线预测小麦 NiR 基因可能位
于的染色体。根据小麦 NiR gDNA的分段测序结果
确定 SNP, 设计 AS-PCR 引物(表 2), 进行常规 PCR
扩增, 1%琼脂糖凝胶电泳检测定位结果。

表 2 TaNiR定位扩增引物
Table 2 Primers for TaNiR chromosome assignment
引物组合
Primer combination
引物序列
Primer sequence (5′–3′)
产物大小
Fragment size (bp)
SNP1/common1R SNP1: GAGGGCGGCATCAAGGACTTA 361
Common1R: CATGGGCACATGGAGATGGAGT
CommonF/SNP2 CommonF: CACCATCGCAAAATCCATCGT 775
SNP2: CAGATTTGGAACCACTGGTTTGT
序列中斜体表示 SNP, 粗体表示人为添加的错配碱基[26]。
Italic and bold letters represent SNP and mismatched bases intentionally [26].

2 结果与分析
2.1 小麦 NiR克隆及序列比对分析
采用 in silico 技术, 利用水稻 NiR 的氨基酸编
码序列作为种子序列(query)进行 tBlastn, 从 NCBI
中搜索到 5 个同源性高的小麦候选 EST, 登录号分
别是 CK193470、BQ620637、CJ721884、CD862763
及 CJ910764。将搜索的 5个 EST序列组装, 得到一
条长度为 2 157 bp的序列(图 1-a)。利用 NCBI中的
ORF Finder 找到起始及终止密码子的位置, 并根据
此位置侧翼序列设计 1 对引物, 退火温度为 65℃,
从小麦品系 CB037的 cDNA和 gDNA中分别扩增出
1 884 bp和 3 071 bp片段(图 1-b和 c)。根据测序结
果进行序列同源性比对分析, 发现在氨基酸水平上
与 NCBI 已公布的 NiR 同源性达 70%以上, 其中与
单子叶谷类作物 NiR 同源性达 80%以上, 且存在铁
氧还蛋白(ferredoxin, Fd)结合位点及 4个保守的参
与铁硫蛋白簇(4Fe-4S)形成的半胱氨酸残基(各保守
域说明参考 Nishimura 等的描述[17]), 表明克隆的基
因是小麦 NiR基因, 并命名为 TaNiR (图 2)。

图 1 小麦 EST序列组装及扩增
Fig. 1 Sequence assembly and isolation of candidate ESTs from wheat
a: 小麦 EST序列组装; b: 片段 cDNA扩增; c: 片段 gDNA扩增。
a: sequence assembly of wheat ESTs; b: cDNA fragment amplification; c: gDNA fragment amplification; M: DL5000 marker.
32 作 物 学 报 第 37卷

将克隆到的小麦 TaNiR的 cDNA及 gDNA序列
提交 GenBank, 登录号分别为 FJ527909 和 FJ555239,
利用 FGENESH+在线预测 TaNiR基因内含子位置。
结果表明, 该基因包含 4个外显子和 3个内含子, 各
外显子长度分别为 412、355、289和 738 bp (图 2), 各
内含子相位分别为 phase 1、phase 2、phase 0 (预测
结果缩写词来自 http://linux1.softberry.com/berry.
phtml[27])。Expasy 在线预测编码的蛋白质大小约为
65.7 kD, 等电点约为 7.28。氨基酸序列比对结果表
明, Fd 及参与铁硫蛋白簇形成的氨基酸残基具有高
度的保守性(图 3)。

图 2 小麦 TaNiR内含子/外显子边界预测
Fig. 2 Prediction on intron/exon boundary of the TaNiR
CDSf: 起始外显子; CDSi: 居间外显子; CDSl: 末端外显子;
CDSo: 单外显子; PolA: 末端 polyA区; TSS: 转录起始位点。
CDSf: first (starting with start codon) coding segment; CDSi: in-
ternal (internal exon) coding segment; CDSl: last (ending with stop
codon) coding segment; CDSo: gene contains the ONE coding exon
only; PolA: terminal polyA signal; TSS: transcription start site.

图 3 不同物种来源的 NiR氨基酸序列比对分析
Fig. 3 Amino acid alignment of nitrite reductase of different plant origins
细下画线为本研究所克隆的 NiR, 粗下画线为 Fd结合位点; 箭头所示为参与 4Fe-4S形成的保守的半胱氨酸位点。GenBank登录号:
TaNiR: ACL13515(本研究克隆); OsNiR: EEC70619, 水稻(O. sativa); SbNiR: XP_002454602, 高粱(Sorghum bicolor); ZmNiR:
ACG29734, 玉米(Z. mays); NtNiR: BAD15364, 烟草(Nicotiana tabacum); AtNiR: NP_179164, 拟南芥(Arabidopsis thaliana)。
Thin and thick underlines represent the NiR isolated in this study and the binding sites of Fd, respectively. Arrows show the four conserved
cysteins residues participating in the formation of 4Fe-4S clustals. GenBank accession ID: TaNiR: ACL13515 (isolated in this study); OsNiR:
EEC70619, O. sativa; SbNiR: XP_002454602, Sorghum bicolor; ZmNiR: ACG29734, Z. mays; NtNiR: BAD15364, Nicotiana tabacum;
ANiR: NP_179164, Arabidopsis thaliana.

2.2 小麦 TaNiR基因进化树构建
根据 TaNiR氨基酸序列, 采用 Blastp在 NCBI上
进行比对寻找, 选取 39 个物种中同源性高于 60%的
NiR, 运用 clustalW2 软件进行聚类分析, 同时运用
Mega 4.0软件构建系统发育树(图 4)。结果表明, 单子
叶植物来源的 NiR 具有较高的同源性(达 80%以上),
可明显形成一个分支(图4), 进一步说明本研究克隆的
TaNiR基因与已报道的水稻 OsNiR基因属同类基因。
2.3 小麦 TaNiR原核表达、半定量 RT-PCR分析
及酶活性测定
将克隆的小麦 TaNiR 基因连接到具有高效表达
外源蛋白特性的 pET-28a 载体上, 通过 1 mmol L1
IPTG 诱导, 不同时间段取样, 进行总蛋白质 SDS-
PAGE分析。结果表明, 诱导 1 h后小麦 TaNiR在 E.
coli菌株 BL21中即能高效表达, 得到一条约 70 kD
的蛋白条带(含约 3.8 kD 的组氨酸标签[28]), 目标蛋
白大小(约 66 kD)与预期大小相符(图 5)。
NiR基因表达受到 NO3的诱导[29]。为明确本研
究克隆的 TaNiR 是否具有类似的功能 , 利用 30
mmol L1 KNO3处理小麦幼苗, 进行 NiR 基因半定
量 RT-PCR分析及酶活性测定。结果表明, KNO3处
理 1 h后 TaNiR的表达量就达到最高(图 6), 随着处
第 1期 佘茂云等: 小麦亚硝酸还原酶基因及调控序列克隆、定位和表达分析 33



图 4 小麦 TaNiR系统发育树构建
Fig. 4 Cladogram of the TaNiR
ZP_06383073.1: 螺旋藻(A. Platensis); ZP_06306743.1: 拉氏拟柱孢
藻(C. raciborskii); ZP_06306024.1: 尖头藻(R. brookii);
ZP_05038808.1: 聚球藻(Synechococcus); ZP_03274889.1: 极大节旋
藻(A. maxima); ZP_01629852.1: 泡沫节球藻(N. spumigena);
ZP_01619812.1: 鞘丝藻(Lyngbya); YP_720910.1: 红海束毛藻(T.
erythraeum); YP_474090.1: 细长聚球藻(S. elangatus); YP_325032.1:
鱼腥藻(A. variabilis); YP_002376987.1: 蓝杆藻(Cyanothece);
YP_001656855.1: 铜绿微囊藻(M. aeruginosa); XP_002518763.1: 蓖
麻(R. communis); XP_002507511.1: 溪藻(Micromonas);
XP_002454602.1: 高粱(S. bicolor); XP_002330328.1: 毛果杨(P.
trichocarpa); XP_002289265.1: 假微型海链藻(T. pseudonana);
XP_002285208.1: 酿酒葡萄(V. vinifera); XP_001777025.1: 小立碗
藓(P. patens); XP_001696787.1: 莱茵衣藻(C. reinhardtii);
XP_001419920.1: 绿藻(O. lucimarinus); Q51879.1: 席藻(P. lamino-
sum); Q42997.1: 水稻(O. sativa); P38500.1: 垂枝桦(B. pendula);
NP_484651.1: 念珠藻(Nostoc); NP_179164.1: 拟南芥(A. thaliana);
EEC70619.1: 水稻(O. sativa); CAC06095.1: 百脉根(L. japonicus);
BAE46578.1: 番茄(S. lycopersicum); BAD15364.1: 烟草(N. ta-
bacum); BAB55003.1: 桃(P. persica); BAA06530.1: 颤藻(L. bory-
ana); ACL13515.1: 小麦(T. aestivum); ACG29734.1: 玉米(Z. mays);
ACD13218.1: 芜青(B. rapa); ABR13308.1: 甜杏(P. dulcis);
AAC17127.1: 辣椒(C. annuum); AAB50233.1: 大豆(G. max);
AAA74456.1: 菜豆(P. vulgaris); 2AKJ-A: 菠菜(S. oleracea)。括号标
注显示单子叶植物来源的 NiR形成的分支。黑点示小麦 TaNiR。
ZP_06383073.1: A. Platensis; ZP_06306743.1: C. raciborskii;
ZP_06306024.1: R. brookii; ZP_05038808.1: Synechococcus;
ZP_03274889.1: A. maxima; ZP_01629852.1: N. spumigena;
ZP_01619812.1: Lyngbya; YP_720910.1: T. erythraeum; YP_474090.1:
Synechococcus; YP_325032.1: A. variabilis; YP_002376987.1: Cyan-
othece; YP_001656855.1: M. aeruginosa; XP_002518763.1: R. com-
munis; XP_002507511.1: Micromonas; XP_002454602.1: S. bicolor;
XP_002330328.1: P. trichocarpa; XP_002289265.1: T. pseudonana;
XP_002285208.1: V. vinifera; XP_001777025.1: P. patens;
XP_001696787.1: C. reinhardtii; XP_001419920.1: O. lucimarinus;
Q51879.1: P. laminosum; Q42997.1: O sativa; P38500.1: B. pendula;
NP_484651.1: Nostoc; NP_179164.1: A. thaliana; EEC70619.1: O.
sativa; CAC06095.1: L. japonicus; BAE46578.1: S. lycopersicum;
BAD15364.1: N. tabacum; BAB55003.1: P. persica; BAA06530.1: L.
boryana; ACL13515.1: T. aestivum; ACG29734.1: Z. mays;
ACD13218.1: B. rapa; ABR13308.1: P. dulcis; AAC17127.1: C. an-
nuum; AAB50233.1: G. max; AAA74456.1: P. vulgaris; 2AKJ-A: S.
oleracea. Curly bracket shows NiR from monocotyledonous crops
released from NCBI; Black dot represents TaNiR in the study.

图 5 小麦 TaNiR原核诱导表达
Fig. 5 Prokaryotic expression induction of the TaNiR
M: 蛋白预染 marker II; 1~4: 诱导 0、1、2、4 h; 箭头所示为目
标蛋白带。
M: prestained protein marker II; 1–4: Induction for 0, 1, 2, 4 h.
Arrow shows the target protein band.

图 6 TaNiR在 30 mmol L−1 KNO3处理条件下的表达
Fig. 6 Expression profile of TaNiR under 30 mmol L−1 KNO3
treatment

理时间的延长表达有所下降。取 10个小麦品种同样
处理条件下 0、5、10、15 和 20 d 的叶片进行酶活
性测定 , 结果表明 , 随着处理天数的延长 , 供试小
麦品种 NiR活性皆明显上升(图 7), 如中国春从处理
前的 0.3667 µmol g1 h1上升到处理 20 d时的 0.8333
µmol g1 h1, CB037从处理前的 0.4252 µmol g1 h1
上升到处理 20 d时的 0.9252 µmol g1 h1, 新春 9号
从处理前的 0.5406 µmol g1 h1上升到处理 20 d时
的 1.1407 µmol g1 h1。
2.4 小麦 NiR 基因调控序列克隆及功能元件预
测
采用 3 轮 IPCR 进行 NiR 基因 5′端侧翼序列延
伸, 每轮进行 2次巢式 PCR扩增, 分别得到 1 849、
506和 1 537 bp片段(包含重叠部分), 共延伸 5′端至
2 924 bp (以 ATG计算)(图 8), 序列如图 9所示。调
控元件预测表明 , 存在 2个重要的功能域, 即启动
子功能域(自81 bp)和增强子功能域(自55 bp)(表
3), 线性判别函数阈值(linear discriminant function,
LDF)分别为 0.13、0.20, TATA盒位于115 bp, LDF
值为 19.04。预测结果缩写来自 http://linux1.softberry.
com/berry.phtml[27]。
采用 PCR方法在上述 10个小麦品种中扩增出 3
次延伸的拼接序列, 并对这些序列采用 clustalW2进
行多重序列比对分析, 结果发现, 除少数 SNP 外,
尚未发现插入/缺失(InDel)序列差异(数据未列出)。
34 作 物 学 报 第 37卷


图 7 10个小麦品种不同时间段的 NiR活性
Fig. 7 NiR activity at different time points from ten wheat accessions
柱状图上方的字母标识为 Tukey法成对比较结果, 显著水平 α=0.05。CS: Chinese Spring; JM22: 济麦 22; J411: 京 411; J771: 京 771;
KN199: 科农 199; LX987: 轮选 987; NC4: 宁春 4号; XC9: 新春 9号。
The letters over the columns show the results of Tukey’s pairwise test at P<0.05. CS, JM22, J411, J771, KN199, LX987, NC4, XC9 denote T.
aestivum cv. Chinese Spring, Jimai 22, Jing 411, Jing 771, Kenong 199, Lunxuan 987, Ningchun 4, Xinchun 9, respectively.


图 8 小麦 TaNiR基因启动子克隆
Fig. 8 Promoter isolation for TaNiR
a: 第一轮延伸; b: 第二轮延伸; c: 第三轮延伸。3个图中左泳道
为第一次 IPCR, 右为第二次 IPCR。
a: the 1st extension; b: the 2nd extension; c: the 3rd extension. Left
lane: the 1st cycle of IPCR; right lane: the 2nd cycle of IPCR.

2.5 小麦 NiR基因染色体定位
利用水稻与小麦基因组间的线性关系, 对克隆
的 TaNiR进行定位预测, 表明在小麦染色体 6A、6B、
6D上皆存在 TaNiR。引物组合 SNP1/commonR在四
倍体小麦代换系 6D/6B中没有扩增到 TaNiR基因特
异条带 , 在其他代换系中扩增到了特异条带 (图
10-a), 引物组合 commonF/SNP2在 6D/6A代换系中
没有扩增到 TaNiR 基因特异条带, 在其他代换系中
扩增到了特异条带(图 10-a), 表明小麦染色体 6B及
6A 上各存在 1 个拷贝 TaNiR。此外, 利用普通小麦
第六同源群的缺体-四体材料进行上述定位, 引物组
合 SNP1/commonR在N6BT6A和N6BT6D中没有扩
增到 TaNiR基因特异条带, 在其他缺体-四体中扩增
到了特异条带(图 10-b), 引物组合 commonF/SNP2
在 N6AT6B和 N6AT6D中没有扩增到 TaNiR基因特
异条带, 在其他缺体-四体中扩增到了特异条带(图
10-b), 进一步证实了利用四倍体小麦代换系进行的
定位结果。利用普通小麦双端体对引物组合 SNP1/
commonR 进一步定位, DT6BL 有特异扩增带, 而
DT6BS 无特异扩增带(图 10-c), 将 TaNiR 基因的 1
个拷贝定位在染色体 6BL 上, 因此, 认为在小麦单
倍体基因组中至少存在 2个拷贝的 TaNiR基因。
3 讨论
小麦 NiR是参与小麦硝态氮向铵态氮转变的一
个中间酶 , 在氮的利用及同化过程中发挥重要作
用。尽管目前为止在小麦中尚未见 NiR编码基因序
列的报道, 但小麦具有丰富的 EST 库(hhtp://www.
ncbi.nlm.nih.gov/; http://wheat.pw.usda.gov/GG2/index.
shtml; http://www.jcvi.org/), 可利用 in silico技术进
行一步 PCR分离未知基因, 本研究的成功实施是 in
silico技术实用性的又一佐证。
迄今为止已建立许多用于基因侧翼序列分离的
方法[30], 其中的一些方法存在单引物扩增及非特异
性扩增等缺陷, 因而限制其广泛应用。IPCR技术相
比其他方法, 虽操作上繁琐一些, 但由于采用 2 对
确定引物扩增, 因而很好解决了单引物扩增存在的
问题, 具有极好的重演性, 在很大程度上避免了非
特异性扩增片段的产生, 笔者已成功应用此法分离
到小麦中 3个果聚糖合成酶编码基因(1-SST、1-FFT
和 6-SFT)启动子序列 (GenBank 登录号分别为
FJ228689、FJ361762和 GU944823)。
高等植物中 NiR的分子研究比其生理研究相对
薄弱。已发现几种植物 NiR转录本皆受到 NO2−诱导
而上调, 但不及 NO3−诱导作用明显[8,21,23], 故本研
究采用 KNO3进行诱导表达分析。Lahners等[23]发现
玉米叶片 NiR 转录本具有本底水平微弱表达, 而根
部没有, 故本研究采用叶片进行 NiR 转录本分析。
尽管玉米和菠菜(S. oleracea) NiR基因 cDNA相似性
很低(66%), 但其编码蛋白相似性达 86%, 说明 NiR
的保守性较高, 本研究比对发现, 几种单子叶植物
第 1期 佘茂云等: 小麦亚硝酸还原酶基因及调控序列克隆、定位和表达分析 35



图 9 小麦品种 CB037的 TaNiR调控序列
Fig. 9 Sequence of TaNiR regulatory region from T. aestivum cv. CB037
方框示起始密码子。Initial code is boxed.

的 NiR编码蛋白同源性也都在 80%以上(图 4)。另一
方面, 利用反义RNA技术实现了对烟草内源NiR基因
表达抑制, 逆转了正常烟草生长对铵盐的敏感性[24]。
Morot 等[31]利用同样的研究方法, 发现当 NiR 基因
表达受到抑制时 , 转基因烟草体内 NO2累积量及
NO 生成量分别比野生型烟草上升 10 倍及 100 倍,
后者引发 14-3-3蛋白及亲环蛋白(cyclophilin)合成增
加, 从而影响了体内许多酶的活性及稳定性。
本研究表明, 随着 KNO3 处理时间的延长, 供
试的 10个小麦品种其 NiR活性均增加。然而, 对来
源 CB037 的 NiR 进行半定量 RT-PCR 研究却发现,
其转录本减少。Suzuki等[29]认为这是由于 NiR编码
基因在转录后发生翻译水平上的修饰 , 从而导致
NiR 的低转录、高活性现象。此外, 在组织培养再
生能力好的小麦品种中(如新春 9 号、科农 199 等),
NiR 本底活性(处理 0 h)明显较再生能力差的品种
(如中国春、宁春 4 号等)高, 结合 Nishimura 等[17]
和 Ozawa等[18]研究结果, 推断小麦的 NiR也可能与
36 作 物 学 报 第 37卷

其组织培养再生能力有关。
原核表达系统具有快速、方便等优势, 可实现
外源基因高效表达, 并方便在体外进行功能蛋白的
理化分析。Bellissimo等[32]利用大肠杆菌菌株 JM109
(E. coli strain JM109)成功表达了定点突变的菠菜
NiR, 对纯化的表达产物进行了生化分析 , 表明突

表 3 TaNiR调控区域顺式作用元件预测
Table 3 Prediction of cis-action elements of the TaNiR regulatory region from wheat
功能元件
Functional
element
位置
Position
正/负链
Direct/
complementary chain
功能域 a
Functional
motif a
识别位点 b
Recognition site b
位点说明
Description on recognition site
2657  RSP00096 GGTTT
2574  RSP00096 GGTTT
Maize (Z. mays) /GENE: GapC4/RE: GT-box /BF:
tobacco nuclear factors
2729 + RSP00102 aaaT-GACGaaaatgc
Cucumber (Cucumis sativus) /GENE: hpr-A/RE:
as-1 LM /BF: unknown nuclear factor
2717 + RSP00269 atcttatgtcattgaT-GACGacctcc
Arabidopsis (A. thaliana) /GENE: GST6/RE: OBF5
BS /BF: OBF5
2867  RSP00469 GNGGTG
2858  RSP00469 GNGGTG
2855  RSP00469 GNGGTG
2852  RSP00469 GNGGTG
2849  RSP00469 GNGGTG
2834  RSP00469 GNGGTG
2793  RSP00469 GNGGTG
Alfalfa (Medicago sativa) /GENE: Synthetic
oligonucleotides/RE: Alfin1 BS1o /BF: Alfin1
2858  RSP00470 GTGGNG
2855  RSP00470 GTGGNG
2852  RSP00470 GTGGNG
2849  RSP00470 GTGGNG
2834  RSP00470 GTGGNG
2812  RSP00470 GTGGNG
2790  RSP00470 GTGGNG
Alfalfa (M. sativa) /GENE: Synthetic oligonucleo-
tides/RE: Alfin1 BS2 /BF: Alfin1
2697 + RSP00483 GCCGC
2742 + RSP00483 GCCGC
Maize (Z. mays) /GENE: Adh1/RE: GC-2 /BF: un-
known nuclear factor
2851 + RSP00512 cttgtaacCAT-
CAgccaatcgac-
cagccaatcattc
Oat (Avena fatua) /GENE: alpha-Amy2/A/RE: Inr /
BF: unknown nuclear factor
Enhancer
2866 + RSP00596 GCCACA Tomato (L. esculentum) /GENE: rbcS3A/RE: box II EE2 /BF: unknown nuclear factor
2657  RSP00096 GGTTT
2574  RSP00096 GGTTT
Maize (Z. mays) /GENE: GapC4/RE: GT-box /BF:
tobacco nuclear factors
2729 + RSP00102 aaaT-GACGaaaatgc
Cucumber (C. sativus) /GENE: hpr-A/RE: as-1 LM /
BF: unknown nuclear factor
2717 + RSP00269 atcttatgtcattgaT-GACGacctcc
Arabidopsis (A. thaliana) /GENE: GST6/RE: OBF5
BS /BF: OBF5
2553 + RSP00469 GNGGTG
2834  RSP00469 GNGGTG
2793  RSP00469 GNGGTG
Alfalfa (M. sativa) /GENE: Synthetic oligonucleo-
tides/RE: Alfin1 BS1o /BF: Alfin1
2553 + RSP00470 GTGGNG
2834  RSP00470 GTGGNG
2812  RSP00470 GTGGNG
2790  RSP00470 GTGGNG
Alfalfa (M. sativa) /GENE: Synthetic oligonucleo-
tides/RE: Alfin1 BS2 /BF: Alfin1
2697 + RSP00483 GCCGC
Promoter
2742 + RSP00483 GCCGC
Maize (Z. mays) /GENE: Adh1/RE: GC-2 /BF: un-
known nuclear factor
a: RSPXXXXX为 Softberry数据库中的信息; b: 大写字母表示保守序列, 小写为非保守序列, N表示 A、C、G、T中任一个。
a: information of RSPXXXXX is from the Softberry Regsite-Plant database; b: capital and lower letters mean conserved and
non-conserved nucleotides in the site consensus, respectively. N represents A or C or G or T.
第 1期 佘茂云等: 小麦亚硝酸还原酶基因及调控序列克隆、定位和表达分析 37



图 10 小麦 TaNiR基因染色体定位
Fig. 10 Chromosome location of TaNiR
a: 四倍体代换系定位; 引物组合: SNP1/commonR(上)和 commonF/SNP2(下); 泳道从左到右依次为: 1D/1A、1D/1B、2D/2A、2D/2B、
3D/3A、3D/3B、4D/4A、4D/4B、5D/5A、5D/5B、6D/6A、6D/6B、7D/7A、7D/7B、中国春、H2O、DL2000 marker; b: 缺体四体定位;
引物组合: SNP1/commonR(上)和 commonF/SNP2(下); 泳道从左到右依次为: N6AT6B, N6AT6D, N6BT6A, N6BT6D, N6DT6A, N6DT6B,
中国春, DL2000 marker, H2O(上)和 N6AT6B, N6AT6D, N6BT6A, N6BT6D, N6DT6A, N6DT6B, 中国春, H2O, DL2000 marker(下); c: 双
端体材料定位; 引物组合: SNP1/commonR; 泳道从左到右依次为: DL2000 marker, DT6BS, DT6BL。
a: Chromosome assignment using tetraploid substitution lines; Primer combination: SNP1/commonR (upper) and commonF/SNP2 (lower);
Lanes: 1D/1A, 1D/1B, 2D/2A, 2D/2B, 3D/3A, 3D/3B, 4D/4A, 4D/4B, 5D/5A, 5D/5B, 6D/6A, 6D/6B, 7D/7A, 7D/7B, Chinese spring, H2O,
DL2000 marker (from left to right); b: Chromosome assignment using nullisomic tetrasomic lines; Primer combination: SNP1/commonR
(upper) and commonF/SNP2 (lower); Lanes: N6AT6B, N6AT6D, N6BT6A, N6BT6D, N6DT6A, N6DT6B, Chinese spring, DL2000 marker,
H2O (upper) and N6AT6B, N6AT6D, N6BT6A, N6BT6D, N6DT6A, N6DT6B, Chinese spring, H2O, DL2000 marker (lower) (from left to
right); c: Chromosome assignment using ditelosomic lines; Primer combination: SNP1/commonR; Lanes: DL2000 marker, DT6BS,
DT6BL(from left to right).

变的 NiR与野生型菠菜中的 NiR具有一致的理化特
性。本研究利用原核表达载体 pET-28a 成功表达了
小麦 NiR 基因编码产物, 为后续体外研究 NiR 编码
产物奠定了基础。
Ozawa 等[18]发现, 从再生能力不同的水稻品种
中分离的 NiR 启动子存在一段重复序列差异(5′-G
CATCTGCCCTTTTGAATTCGCCA-3′), 且这种差异
导致了高再生品种 Konansou 的 NiR 活性高于低再
生品种 Koshihikari 达 3 倍之多。然而, 本研究对具
有不同再生能力小麦品种的 NiR 启动子序列进行比
对分析, 发现除极少数 SNP外, 并无这种差异(图 8),
推断若 TaNiR 也与小麦组织培养再生密切相关, 差
异可能发生在 NiR转录后水平或翻译水平上。
AS-PCR 技术用于小麦基因定位已有许多成功的
报道[33-37]。本研究利用该技术在小麦基因组第六部分
同源群中成功定位到 2 个 NiR 位点, 分别位于 6A 及
6B 染色体上, 尽管我们尚未发现 6D 染色体特异的
SNP, 但根据小麦基因组的异源多倍体特性[38], 不排除
6D 染色体上也存在 NiR 基因位点。在玉米基因组中,
Lahners等[23]发现 NiR至少也存在 2个拷贝。证明 NiR
在小麦、玉米等植物中以多拷贝形式存在, 其在氮代谢
和组织培养植株再生等方面的功能有待深入研究。
4 结论
根据 NCBI 上已公布的 OsNiR 序列, 利用 in
silico技术从小麦基因组中拼接出一段长度为 2 157
bp 的序列, 运用生物信息学预测可能的 ORF, 采用
Touch-down程序扩增出该拼接序列的全长 gDNA及
cDNA序列。通过基因结构分析和聚类分析, 结合原
核诱导表达, 证实所克隆的基因是小麦 NiR 编码基
因, 命名为 TaNiR。半定量 RT-PCR结果表明, 所克
隆的基因具有 NiR 基因的表达特性, 进一步确认所
克隆基因的准确性。借助 IPCR 技术, 成功分离到
2 924 bp的 TaNiR 5′侧翼序列, 功能原件预测表明其
具有启动子的基本组分。利用 AS-PCR 技术进行染
色体定位分析, 发现 TaNiR基因在小麦 6A及 6B上
至少各存在 1个拷贝。
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