全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(2): 216223 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(2010CB125906)资助。
*
通讯作者(Corresponding author): 喻德跃, E-mail: dyyu@njau.edu.cn, Tel/Fax: 025-84396410
第一作者联系方式: E-mail: woshijjw@126.com
Received(收稿日期): 2010-07-02; Accepted(接受日期): 2010-09-28.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.00216
大豆丙二烯氧化物合酶基因(GmAOS)及其启动子的克隆与分析
吴娟娟 1,2 吴 倩 1 喻德跃 1,*
1 南京农业大学国家大豆改良中心 / 作物遗传与种质创新国家重点实验室, 江苏南京 210095; 2 南通大学医学院生化教研室, 江苏南
通 226001
摘 要: 利用 RT-PCR、RACE 和 LA PCR 相结合的方法, 从大豆中克隆了 GmAOS 基因及其启动子序列(登录号为
EU366252), GmAOS基因共 1 789 bp碱基, 等电点 8.97, 分子量 58.3 kD, 在 3种不同抗性大豆材料中均有 2个拷贝。
生物信息学分析表明, GmAOS酶的 N末端有典型叶绿体定位信号肽, 基因序列上有多个丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸的
磷酸化位点。该研究克隆到 ATG 上游 472 个碱基的 GmAOS 基因启动子部分序列 , 其含有赤霉素的响应元件
(TAACAA), 可诱导性抗性基因响应元件(W box), 细菌和盐诱导的响应元件(GAAAAA), 茉莉酸诱导的响应元件(G
box)。GmAOS能强烈响应茉莉酸的诱导, 且在黄皮小青豆(高抗斜纹夜蛾)中表达量高于徐疃大豆, 两种材料抗虫性的
差异可能是由 GmAOS 基因受诱导后的表达量差异引起的, 即 GmAOS 基因与作物抗虫性相关, 可作为培育高诱导抗
性材料的候选基因。
关键词: 大豆; 丙二烯氧化物合酶; 启动子; 克隆; 生物信息学分析
Cloning and Characterization of GmAOS Gene and Its Promoter in Soybean
(Glycine max)
WU Juan-Juan1,2, WU Qian1, and YU De-Yue1,*
1 National Center for Soybean Improvement / National Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Nanjing Agricultural Univer-
sity, Nanjing 210095, China; 2 Department of Biochemistry and Molecular Biology, Medical School of Nantong University, Nantong 226001, China
Abstract: Allene oxide synthase (AOS) is a major intermediate enzyme in octadecanoid pathway to JA biosynthesis affecting the
synthesis and levels of all JA-related compounds in plants, and therefore plays a significant role in plant defense. In this study, a
full length cDNA of GmAOS and its promoter were cloned from the soybean (Glycine max) by RT-PCR, RACE, and LA PCR
methods. GmAOS cDNA coding 519 amino acids (58.3 kD) with an isoelectric point of 8.97 and two genes copies in the soybean
genome coding for GmAOS. Bioinformatics analysis indicated that the N-terminal region of GmAOS displayed features of a typi-
cal chloroplast targeting peptide including an enrichment of serine, threonine and tyrosine phosphorylation sites. The length of the
promoter was 472 bp, containing several stress-induced elements: GA inducing elements (TAACAA), W-box element which was
in response to elicitor-responsive transcription of defense genes, element responsive to salt and pathogen (GAAAAA) and G-box
(CACGTG) induced by JA. Jasmonic acid showed a strong inducement of the GmAOS transcript level, expression patterns of
GmAOS were explored in two soybean accessions with distinct resistance to cotton worm: XTDD was highly susceptible and
HPXQD highly resistant, showing that GmAOS had higher transcript level in HPXQD(HR) than in XTDD(HS). GmAOS transcript
level were correlated with soybean material resistance grades. These results suggest GmAOS is likely to be a useful tool for im-
proving self-resistance abality of high plants.
Keywords: Soybean; A11ene oxide synthase; Promoter; Clone; Bioinformatics analysis
丙二烯氧化物合酶(a11ene oxide synthase, AOS,
EC.4.2.1.92)[1]普遍存于植物组织中, 属于 P450超基
因家族中的一员 , 具有 CytP450 家族的普遍特征 ,
是茉莉酸(jasmonic acid, JA)合成的关键酶[2-3], 可以
通过控制 JA 的生物合成而参与调节植物的许多生
理过程。徐涛等[4]在研究水稻的虫害诱导防御体系
时发现, 斜纹夜蛾危害能够明显诱导水稻茉莉酸合
成途径的关键酶脂氧合酶和丙二烯氧化物合酶基因
第 2期 吴娟娟等: 大豆丙二烯氧化物合酶基因(GmAOS)及其启动子的克隆与分析 217


表达。伤害可以诱导番茄叶片 AOS 基因的表达[5],
AOS mRNA水平最大时可达到相应对照的 5~9倍。
可见, AOS 基因表达的加强对提高植物对物理环境
的适应和种间竞争力, 抵御天敌侵害, 增强抗病性
等方面起着重要作用。目前, 在许多作物中克隆了
AOS 基因并进行了相关功能的研究, 但是 AOS 基因
在大豆中的研究还比较少。虽然 Kongrit等[6]克隆了
2 个大豆 AOS 基因, 但是只报道了基因序列、酶活
性测定和简单的组织表达, 关于大豆 AOS 基因的定
位, 与其他作物 AOS 基因的进化关系, 拷贝数及其
启动子等均没有报道。
为了解大豆 GmAOS 基因在逆境胁迫中所起的
作用及 GmAOS 基因及启动子的特性, 本研究通过
RT-PCR以及 RACE等方法从大豆中克隆了 GmAOS
基因, 利用 LA PCR法分离了 GmAOS基因的启动子
序列(GmAOS 基因和启动子登录号为 EU366252),
用生物信息学方法分析 GmAOS 基因序列的特点和
启动子的顺式元件, 用茉莉酸诱导两种对斜纹夜蛾
抗性差异显著的大豆材料, 分析了 GmAOS 基因在
两种材料中的表达差异 , 用 Southern blot 分析了
GmAOS基因的拷贝数。
1 材料与方法
1.1 试验材料
大豆(Glycine max L. Merr.)品种黄皮小青豆(高
抗斜纹夜蛾)、徐疃大豆(高感斜纹夜蛾)和野生豆
ZYD3693 由国家大豆改良中心提供, 于正常季节种
植于南京农业大学网室中, 常规田间管理。取六复
叶期的大豆叶片, 液氮速冻存于–80℃备用。
1.2 大豆基因组 DNA、总 RNA 的提取纯化和
cDNA第一链的合成
采用 CTAB法小量提取大豆基因组 DNA, 采用
Trizol试剂(Invitrogen, USA)提取大豆总 RNA, 经过
DNase I (TaKaRa公司)处理后进行 cDNA第一链的
合成(Promega, USA), –20℃保存备用。
1.3 GmAOS基因的克隆
利用截叶苜蓿 AOS基因全长序列搜索 GenBank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast), 得到与 AOS 有
相似性的大豆 dbEST(BG652002), 验证预测的准确
性。根据测序结果在 Tigr (http://www.tigr.org/)运用
Blast比对得到高度同源的 TC207123, 设计引物, 上
游为 5-TATCACGCTCCCTCTTCAAC-3; 下游为
5-AGTAACGGAAGAACCCAAGG-3。扩增程序为
95℃预变性 2 min, 94℃ 30 s, 52℃ 60 s, 72℃ 60 s, 30
个循环, 72℃延伸 10 min。
利用 3-Full RACE Core Set试剂盒(TaKaRa公
司)和 5RACE试剂盒(Clontech公司, BD SMARTTM
RACE cDNA Amplification Kit)根据说明书分别设计
引物, 快速扩增 cDNA末端。根据 RACE-PCR的结
果, 设计覆盖完整 ORF 的引物序列(GmAOS 上游引
物： 5-ACACCCAAAATGGCATCCTC-3, 下游引
物：5-TCATCATCCTAACCGGTCAAA-3), 以 DNA
和 cDNA为模板同时扩增GmAOS的ORF, 扩增程序
同前文 , 将扩增产物克隆至 pGEM-T 载体 , 由
Invitrogen公司测序。
1.4 GmAOS基因启动子序列的克隆
采用 LA PCR in vitro Cloning Kit (TaKaRa公司)
克隆基因的启动子 , 设计引物 S1：5-AGAGCGT
TGTTTGGTTGAGGAG-3, S2：5-GAAATAGTCTT
GGCGGTCCTTG-3, 按照说明书操作。
1.5 半定量 RT-PCR分析
以大豆组成型表达的 Actin 基因(GenBank 登录
号为 V00450)为内部参照 , 利用黄皮小青豆
(HPXQD), 高抗斜纹夜蛾 (HR); 徐疃大豆 (XTDD),
高感斜纹夜蛾(HS), 以茉莉酸诱导胁迫后 , 分别提
取总 RNA为模板, 进行 RT-PCR分析。Actin：上游
引物为 5-GTTCTCTCCTTGTATGCAAGTG-3, 下
游引物为 5-CCAGACTCATCATATTCACCTTTAG-
3。GmAOS 上游引物为 5-TCTCCATCAGAGCCTC
GGTC-3, 下游引物为 5-CATCATCCTAACCGGTC
AAAAAC-3。扩增程序为 95℃预变性 5 min, 94℃ 30
s, 56℃ 50 s, 72℃ 60 s, 30个循环, 72℃延伸 10 min;
GmAOS基因退火为 60℃ 1 min。为减小误差, 每份
DNA样品分别做 3次 PCR, 3次电泳。用 Band Leader
3.0 (http://www.bio-soft.net/draw/BandLeader.htm)完
成胶灰度图的数据化, 取电泳胶灰度图的 3 次平均
值用于做柱状图; GmAOS 基因柱状图用 GmAOS 基
因与 Actin基因表达量数据化的比值表示。
1.6 Southern blot分析
采用 CTAB法提取大豆叶片基因组 DNA, 分别
用 Xba I、Dra I、Xho I和 Pvu II于 37℃酶切 12 h, 琼
脂糖凝胶电泳, 进行 Southern blot 杂交。Southern杂
交及探针标记等参见Roche公司的DIG试剂盒提供的
操作程序; 限制性内切酶购自 TaKaRa (大连)公司。
1.7 生物信息学分析
GmAOS 蛋白的分子量和等电点由经在线软件
218 作 物 学 报 第 37卷

Compute pI/Mw tool, ExPASy (http://expasy.org/
tools/pi_tool.html)预测; CholorP version 1.1 (http://
genome.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/)用于预测 GmAOS
蛋白的信号肽; 利用 NetPHos 2.0 (http://www.cbs.
dtu.dk/services/NetPhos/)软件分析 GmAOS蛋白的磷
酸化作用位点 ; MotifScan 程序 (http://hits.isb-sib.
ch/cgi-bin/motif_scan)用于搜寻 GmAOS 序列中的可
能基序 ; 多序列比对由 ClustalX 程序 (Ver.1.83)
(http://www.ibioo.com/soft/biosoft/2009/7400.html)和
GeneDOC 程序(Ver.2.6) (http://www.psc.edu/biomed/
genedoc)进行 ; MEGA 程序 (Ver.4.0)(http://www.
megasoftware.net/)用于系统发生分析。PredictProtein
(http://www.predictprotein.org/)用于 GmAOS 蛋白质
二级结构预测; MaInspector (http://www.genomatix.
de/en/index.html)程序用于 GmAOS启动子分析。
2 结果与分析
2.1 大豆 GmAOS基因的克隆与序列分析
以徐疃大豆 cDNA为模板, 通过RT-PCR的方法
克隆 dbEST (BG652002), 得到大小为 467 bp的片段;
根据测序结果在 Tigr 运用 Blast 比对得到高度同源
的 TC207123, 扩增得到 866 bp 的片段(图 1-A); 根
据此克隆的序列, 利用 3RACE引物和 3RACE巢式
引物, 扩增得到 575 bp的片段(图 1-B); 利用 5RACE
引物和 5RACE巢式引物, 胶回收后得到 729 bp的
片段(图 1-C); 将扩增得到的片段拼接后, 设计引物
同时在 cDNA和 gDNA中扩增得到大小为 1 789 bp
序列(图 1-D), 该序列 5端已经包含起始密码子且符
合 Kozak规则[7], 3端有典型的 poly(A)加尾信号, 包
含完整的 ORF, 编码 519 个氨基酸残基, 没有内含
子, 将该基因在 NCBI 上注册定名为 GmAOS, 登录
号为 EU366252。经在线软件分析 GmAOS蛋白等电
点为 8.97; 分子量为 58.3 kD (Compute pI/Mw tool,
ExPASy)。之后, 发现 NCBI文库刚新增加了 2个大
豆 GmAOS1 和 GmAOS2 基因, 且 GmAOS2 基因与
GmAOS基因序列大部分相同。Kongrit等[6]只报道了
酶活测定和简单的组织表达, 关于大豆 GmAOS 基
因的启动子, 大豆 AOS 基因的定位, 与其他作物的
AOS 基因进化关系, 拷贝数等均没有报道, 本文对
GmAOS基因做了进一步的研究。
2.2 GmAOS序列的生物信息学分析
在以往的报道中, 亚麻[8]、大麦[9]、番茄[10]、拟
南芥 [11]的 AOS 蛋白定位于叶绿体内膜。利用
CholorP (Ver. 1.1)软件预测大豆的 GmAOS基因信号
肽 MASSASTTLSSPFLRLE FPSSTKQRSSISIR。软
件分析表明 GmAOS蛋白序列的 N末端有大量羟基
化的氨基酸(前 31个氨基酸含有 9.68% T和 32.3% S),
显示了典型叶绿体定位信号肽(图 2), 定位于叶绿体
的可能性为 89.9 % (CholorP Ver. 1.1 软件预测), 这
与以往的报道一致。
利用NetPHos 2.0软件分析发现GmAOS蛋白有
多个得分很高的磷酸化作用位点, 分别是丝氨酸(6、
20、21、26、27、29、33、35、44、47、51、130、
145、156、161、178、209、359、495、503、513



图 1 大豆 GmAOS基因的克隆
Fig. 1 Cloning of GmAOS from soybean
A: TC207123的片段; B: GmAOS 3RACE扩增; C: GmAOS 5RACE扩增; D: GmAOS在 cDNA和 gDNA中的扩增。
A: TC207123 obtained by PCR; B: 3 terminal of GmAOS obtained by 3RACE; C: 5 terminal of GmAOS obtained by 5RACE; D: ORF of
GmAOS obtained from genomic DNA and cDNA.
第 2期 吴娟娟等: 大豆丙二烯氧化物合酶基因(GmAOS)及其启动子的克隆与分析 219


和 518), 苏氨酸(96、234、268、271、307、425 和
462)和酪氨酸(283和 291)(图 2)。丝氨酸、苏氨酸、
酪氨酸磷酸化激酶在信号转导中起着重要的作用 ,
它们强大的生理催化活性可以满足范围很广的生理
要求, 包括转导细胞外的生长、分化刺激以及细胞
对胞内氧化还原势的响应等功能。GmAOS蛋白序列



图 2 GmAOS蛋白序列的多重比对
Fig. 2 Multiple alignments of GmAOS amino acid sequences
利用软件 Clustal X(Ver.1.81)进行氨基酸序列比对, 比对结果通过 GeneDOC程序显示。画圈的是预测的丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸磷酸
化位点。预测的信号肽序列用黑色下画线标出。高度保守的 I-helix region、血红素结合结构域(C是血红素结合位点, 用箭头标出)和
CYP74A酶类高度保守的 ETLR结构域用黑方框标出。
The deduced amino acid sequence of soybean AOS (GmAOS) is compared with the primary structures of AOS from Lycopersicon esculentum
(LeAOS1, protein ID: CAB88032), Solanum tuberosum (StAOS1, protein ID: CAD29735), Nicotiana attenuate (NaAOS, protein ID: CAC82911),
Glycine max (GmAOS1/GmAOS, protein ID: ABB91776/ACA79943), Medicago truncatula (MtAOS, protein ID: CAC86897). The circled amino
acid residues indicate the predicted serine, threonine and tyrosine phosphorylation sites in the GmAOS sequence. The predicted chloroplast-targeting
signal peptides are underlined. The highly conserved I-helix region, heme-binding domain (the heme-binding C is marked by arrowhead) and the
highly conserved ETLR motifs of the CYP74A enzymes are boxed. Aminoacid similarity is based on the ClustalX (version 1.81) convention.
220 作 物 学 报 第 37卷

上有多个丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸的磷酸化位点可
以通过磷酸化与脱磷酸化调节细胞内已存在酶的
“活性酶量”, 使细胞对外界刺激做出迅速反应更
为有效, 充分表明其催化功能的复杂性。
GmAOS 是 P450 超基因家族中特别的一员, 被
归类为 CYP74A, 具有典型的 P450成员特征又有所
变化(图 2), AOS是不需要氧气也不需要 NADPH的
P450 还原酶, 表现极高的转换数, 对 CO 的亲和力
也较低。选取部分已报道的双子叶作物 AOS蛋白序
列与 GmAOS 进行序列比对分析 , 结果显示了
GmAOS 基因的 P450 家族特征序列: (1)高度保守的
I-helix region[12], 该结构域的作用是在血红素表面
上形成氧结合袋 , 它在 P450 家族中的序列为
GXXXT, G 和 T 用于紧密结合氧分子 [13]。大豆
GmAOS 中的 GXXXT转变为 GXXXL, 介导氧气结
合的保守的 T 没有了, 苏氨酸转变为亮氨酸, 不能
形成氧结合袋, 因此不需要氧分子。(2) C末端有高
度保守的血红素结合结构域, P450 家族的血红素保
守序列为 FXXGXXXCXG, C 是血红素结合位点(用
箭头标出)。CYP74A酶类的该保守区的序列演变为
P-V-NKQCAG 与大多数细胞色素 P450 酶相关的一
致性序列有差异。大豆中的该序列转变为 P-L-
NKQCAG。(3)具有 CYP74A酶类高度保守的 ETLR
结构域, ETLR motifs (Glu-Thr-Leu-Arg)是 P450超基
因家族的典型序列, 也是 CYP74A 亚家族酶类的保
守序列 [14]。在所比对的几个物种中 EALR 取代了
ETLR, 在大豆中进一步演变成了 EAFR。
为了进一步了解大豆 GmAOS 蛋白可能的功能
和在植物AOS家族中的进化位置, 用MEGA程序构
建了植物 AOS家族的系统发生树。从图 3可以看出,
GmAOS与已经报道的GmAOS1和GmAOS2亲缘关
系最近, 与同为豆科的 MtAOS分在双子叶植物一列,
都是细胞色素 P450超基因家族, CYP74A 亚家族中
的一员。通过 PredictProtein 蛋白质结构预测, 发现
GmAOS 的二级结构主要由 β 折叠和 α 螺旋构成(图
4)。
2.3 GmAOS基因启动子序列的分析
为了进一步了解 GmAOS 基因的表达调控机制,
利用 LA-PCR in vitro cloning kit (TaKaRa, Japan)分离
得到 GmAOS 基因的启动子片段, 该序列为起始密
码子(ATG)上游的 472 bp片段。通过 MaInspector程
序对该区域进行序列分析(图 5)。结果表明在GmAOS
启动子区有 2 个可能的真核生物 RNA 聚合酶 II 识
别位点 TATA-box, 1个增强转录的 CAAT-box, 1个
响应赤霉素的作用元件(TAACAA), 1个响应可诱导
性抗性基因的作用元件(W box), 2个响应细菌和盐诱



图 3 GmAOS与其他植物 AOS蛋白的系统发生树
Fig. 3 Phylogenetic tree analysis of GmAOS and other plants
多种作物的 AOS系统发生树用 MEGA (Ver.4.0)程序构建, 树枝
上的数字表示 bootstrap验证中该树枝可信度的百分比, GmAOS
与已经报道的 GmAOS1和 GmAOS2亲缘关系最近, 归于双子叶
植物一列。
The phylogenetic tree is constructed by the MEGA (Ver.4.0). The
number above the horizontal lines is percentage of homology
among AOS verified by bootstrap. GmAOS is closely related to
GmAOS1/GmAOS2 and belongs to the dicotyledonous. Accession
No. is as follows: Glycine max (GmAOS1, ABB91776; GmAOS2,
ABB91777), Medicago truncatula (MtAOS, CAC86897), Solanum
tuberosum (StAOS1, CAD29735; StAOS2, CAD29736), Lycoper-
sicon esculentum (LeAOS1, CAB88032; LeAOS2, AAF67141),
Nicotiana attenuate (NaAOS, CAC82911), Linum usitatissimμm
(LuAOS, AAA03353), Arabidopsis thaliana (AtAOS, CAA6326
6.1), Zea mays (ZmAOS, AAR33048), Hordeum vulgare (HvAOS1,
CAB86383; HvAOS2, CAB86384), Triticum aestivum (TaAOS,
AAO43440), Oryza sativa (OsAOS, AAL17675).



图 4 GmAOS蛋白二级结构预测
Fig. 4 Protein structure prediction of GmAOS protein
第 2期 吴娟娟等: 大豆丙二烯氧化物合酶基因(GmAOS)及其启动子的克隆与分析 221




图 5 GmAOS部分启动子序列的分析
Fig. 5 Sequence analysis of partial promoter of GmAOS

导的作用元件(GAAAAA)以及 1 个茉莉酸诱导表达
所必须的顺式元件(G box)[15-16]。在启动子区域发现
这些元件表明 GmAOS 基因在催化功能上具有高度
灵敏性。细胞在受到外界刺激时, 不但可以通过磷
酸化与脱磷酸化控制细胞内已存在酶的“活性酶量”,
还可以通过调控不同的响应元件来提高“酶的总量”,
因此如果植株中含有较多的 AOS酶, 当植株受到外
界侵害时可在短时间内诱导材料提高抗性, GmAOS
基因可用于培育高诱导抗性的材料。
2.4 茉莉酸(jasmonic acid)诱导 GmAOS 基因的
表达分析
据以往报道, 茉莉酸是重要的植物激素能启动
抗逆基因的表达, 逆境条件改变了植物体内源激素
的平衡状况, 从而导致代谢途径变化, 影响植物的
抗逆性。在虫害和病毒条件下, 植物体内茉莉酸及
其衍生物的含量显著增加, 这些物质通过激活植物
体内相应的防御基因, 使植物产生各种类型的化学
防御物质, 同时诱导植物体内直接防御物质的增加,
从而明显提高植物的防御作用[4]。因为 GmAOS启动子
中有茉莉酸诱导表达所必须的顺式元件(G box)[15-16],
本试验研究了 GmAOS 与茉莉酸之间的关系。结果
表明, GmAOS能强烈响应茉莉酸的诱导(图 6-A), 说
明 GmAOS 在植物激素相互作用的网络中起到了一
定作用, 且受到诱导 3、6、12和 24 h后, GmAOS在
黄皮小青豆 (高抗 )中表达量高于在徐疃大豆 (高
感)(图 6-B), 即大豆受到茉莉酸诱导后, GmAOS 在
高抗性材料中的表达高于高感性材料。吴娟娟等[17]
用斜纹夜蛾诱导黄皮小青豆(高抗)和徐疃大豆(高感)
后也发现, GmAOS 在黄皮小青豆(高抗)中达到最大
表达量所需要的时间远远短于徐疃大豆(高感), 即
GmAOS与材料的抗性有密切的联系。因此, 黄皮小
青豆(高抗)与徐疃大豆(高感)抗虫性的差异可能与
GmAOS 基因达表达量的不同有关, GmAOS 可做为
培育高诱导抗性材料的候选基因。



图 6 两种大豆品种叶片中的 GmAOS基因在茉莉酸胁迫下的响应
Fig. 6 Accumulation of the GmAOS transcripts in leaves of
two soybean varieties treated by jasmonic acid
A: 两种材料按照时间点分别收获叶片, CK为未处理样品, 提取
总 RNA, 做半定量 RT-PCR, 为降低误差, 每份样品做 3次 PCR,
3次电泳, 得到相似的实验结果。B: 在茉莉酸胁迫下, GmAOS
mRNA的表达水平(相对与 Actin的表达量)。利用 Band Leader 3.0
软件读取 3次电泳的胶灰度图数据用于做柱状图。白色代表徐疃
大豆(高感); 黑色代表黄皮小青豆(高抗)。
A: leaf tissue was harvested for extraction of total RNA immediately at
the time points and CK is the sample without treatment. The experi-
ments were repeated three times and the similar results were obtained;
B: mRNA expression of GmAOS was represented as the ratio of
GmAOS band intensity to that of Actin. The digitalization of agarose gel
analysis was performed with BandLeader (version 3.0) software.
XTDD(HS): white histogram; HPXQD(HR): black histogram.
222 作 物 学 报 第 37卷

2.5 GmAOS的 Southern blot分析
为进一步分析该基因与植物的抗逆性的关系 ,
本文分析了 GmAOS 基因在不同抗性材料中是否存
在拷贝数的差别, 即质上的差别。用对斜纹夜蛾不
同抗性的大豆做了 Southern blot分析。用 Xba I、Dra
I、Xho I和 Pvu II四个限制性内切酶(目的序列中不
含该酶切位点)对大豆基因组进行酶切, 以 GmAOS
全长 cDNA 序列为模板标记探针, 结果显示, 在高
感的徐疃大豆中 GmAOS 有 2 个拷贝(图 7-A), 在高
抗的黄皮小青豆和野生豆 ZYD3693中也有 2个拷贝
(图 7-B)。茉莉酸是一种重要的次生代谢物, 是植物
受诱导产生的微量可代谢物, AOS 是茉莉酸合成的
关键酶, GmAOS基因的拷贝数在 3种不同抗性材料
中不存在差别, 与 AOS是次生代谢物关键酶的“身
份”相符合, 说明该基因只是通过量的变化影响材
料的抗性而不是质的变化导致材料抗性的不同, 因
此可以通过增加 GmAOS 基因量的积累来提高植物
的抗逆性。



图 7 GmAOS的 Southern blot
Fig. 7 Southern blot of GmAOS
A: Southern blot分析 GmAOS基因在徐疃大豆(高感)中的拷贝数; B: Southern blot分析 GmAOS基因在徐疃大豆(高感)、
黄皮小青豆(高抗)和 ZYD3693(野生豆)的拷贝数。
A: Genomic southern blot analysis of GmAOS isolated from XTDD(HS); B: Genomic southern blot analysis showing there are two copies of
GmAOS gene in XTDD(HS), HPXQD(HR), and ZYD3693 (wild soybean).

3 讨论
`近年来, 茉莉酸诱导可提高寄主植物抗病虫性
一直是国内外的研究热点 [15-16,18], 对一些双子叶模
式植物(如拟南芥、番茄、烟草等)的研究表明, 茉莉
酸信号传导途径在调节植物虫害有的防御过程中起
关键作用。AOS 作为关键酶, 与茉莉酸的生物合成
关系密切, 可以通过控制茉莉酸的生物合成而参与
调节植物的许多生理过程。目前已经从多种作物中
分离得到了 AOS 基因并研究了其功能, 但是关于大
豆 GmAOS基因相关研究很少。
本实验室克隆了 GmAOS 基因, 分离了 GmAOS
基因的启动子序列。GmAOS基因共 1 789 bp碱基, 编
码 519个氨基酸残基, 没有内含子, 等电点 8.97, 分
子量 58.3 kD。软件分析表明 GmAOS基因的 N末端
显示了典型叶绿体定位信号肽, 这与 Song 在亚麻[8]
中的报道一致。GmAOS基因序列上有多个丝氨酸、
苏氨酸、酪氨酸的磷酸化位点可以通过磷酸化与脱
磷酸化控制细胞内已存在酶的“活性酶量”, 使细
胞迅速对外界刺激做出有效的反应。GmAOS启动子
区有多个可受诱导的调控元件 , 当有外界刺激时 ,
GmAOS可以迅速响应, 增加 GmAOS“酶的总量”,
通过调控茉莉酸途径, 调动植物体内相关抗逆基因,
降低恶劣环境对植物照成的损害。多个响应元件和
磷酸化位点的存在, 表明 GmAOS 基因在催化功能
上具有高度复杂性, 不但可以通过磷酸化与脱磷酸
化控制细胞内已存在酶的“活性酶量”, 还可以通
过调控不同的响应元件来提高“酶的总量”。GmAOS
第 2期 吴娟娟等: 大豆丙二烯氧化物合酶基因(GmAOS)及其启动子的克隆与分析 223


能强烈响应茉莉酸的诱导且受到诱导 3、6、12 和
24 h 后, GmAOS 在黄皮小青豆(高抗)中的表达量高
于徐疃大豆 (高感 ), 其抗虫性的差异可能是由
GmAOS 基因受诱导后的表达量差异引起的 , 即
GmAOS 与材料的抗性有密切的联系。虽然 GmAOS
基因在 3种不同抗性的大豆材料中均有 2个拷贝, 但
是如果植株中含有较多的活性 AOS酶总量, 当植株
受到外界的侵害时, 仍然可以在短时间内诱导材料
提高抗性, 其机理可能是通过调控茉莉酸来控制植
株的系统防御, 因此 GmAOS 基因可做为培育高诱
导抗性材料的候选基因。
4 结论
从大豆中克隆了合成茉莉酸的关键酶 GmAOS
基因及其启动子序列, GmAOS基因在 3种不同抗性
的大豆材料中均有 2个拷贝。GmAOS能强烈的响应
茉莉酸的诱导, 且在黄皮小青豆(高抗)中其表达量
高于徐疃大豆(高感), 两种大豆抗虫性的差异, 可能
是由 GmAOS 基因受诱导后的表达量差异引起的。
GmAOS可能与材料的抗性有密切的联系, 可作为培
育高诱导抗性材料的候选基因。
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