全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2010, 36(2): 341−346 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由转基因生物新品种培育科技重大专项(2009ZX08001-010B)和山东省农业科学院博士科研启动基金项目(2007YBS008)资助。
*
通讯作者(Corresponding author): 刘炜, E-mail: wheiliu@163.com; Tel: 0531-83179572
第一作者联系方式: E-mail: iamzisewutongyu@163.com
Received(收稿日期): 2009-05-19; Accepted(接受日期): 2009-10-04.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2010.00341
花生白藜芦醇合成酶基因 PNRS1的克隆及其在原核中的表达
韩晶晶 1,2 刘 炜 1,* 毕玉平 1,2
1 山东省农业科学院高新技术研究中心 / 农业部黄淮海作物遗传改良与生物技术重点开放实验室, 山东济南 250100; 2 山东师范大
学生命科学学院, 山东济南 250014
摘 要: 采用 RT-PCR克隆花生白藜芦醇合成酶(resveratrol synthetic enzyme, RS)基因全长, 命名为 PNRS1, GenBank
登录号为 FM955393。序列分析表明该基因的开放读码框 1 170 bp, 编码 389个氨基酸残基。以花生品种鲁花 14基
因组DNA为模板经 PCR扩增, 获得该基因的基因组序列长 1 537 bp, 包含 2个外显子和 1个内含子。比较发现, PNRS1
与其他已知 RS序列的同源性达 91%~95%。表达模式分析显示, PNRS1在花生根中特异表达, 并可被紫外线 UV-B诱
导。PNRS1与 pET-28a(+)构建原核表达载体, 经 IPTG诱导后可表达获得相对分子量约为 46 kD的外源融合蛋白。以
上结果证实 PNRS1属花生 RS基因家族成员, 并为进一步分析该基因的功能奠定了基础。
关键词: 花生; 白藜芦醇合成酶; 表达模式; 原核表达; 融合蛋白
Molecular Cloning of Peanut Resveratrol Synthetic Enzyme 1 (PNRS1) and its
Expression in Prokaryote
HAN Jing-Jing1,2, LIU Wei1,*, and BI Yu-Ping1,2
1 Hi-Tech Research Center, Shandong Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Crop Genetic Improvement and Biotechnology,
Huanghuaihai, Ministry of Agriculture, Ji’nan 250100 China; 2 College of Life Sciences, Shandong Normal University, Ji’nan 250014, China
Abstract: Resveratrol synthetic enzyme (RS) is a key and necessary enzyme that plays important role in resveratrol synthesis
pathway. To uncover and characterize the function of the RS in plant developmental process, we isolated a RS gene PNRS1
(FM955393) by RT-PCR using total RNA of peanut seed as template, and the gene PNRS1 was expressed in E. coli prokaryote for
further analysis. The results showed that the PNRS1 had a 1 170 bp open reading frame encoding 389 amino acid polypeptide, and
exhibiting high similarities with other members of RS genes family. Expression pattern analysis indicated that the PNRS1 was spe-
cially expressed in peanut root, and could be induced by UV-B treatment. The recombinant PNRS1 protein product with the molecu-
lar weight about 46 kD could also be detected in E. coli protein expression system. These results suggested that the PNRS1 was a
member of RS family with peculiar expression patterns compared with other ones. As protein is the functional executor of a gene, the
protein product of PNRS1 finally will take effect in the later processes of plant development, and shed light on the stress-resistant
breeding and cultivation.
Keywords: Peanut; Resveratrol synthetic enzyme (RS); Expression pattern; Prokaryotic expression system; Fusion protein
白藜芦醇(resveratrol, Res)是一种含有芪类结构的非
黄酮类多酚化合物, 化学名称为 3,5,4’-三羟基二苯乙烯
(3,5,4’-trihydroxysitlbene), 分子式为 C14H12O3, 分子量为
228.25 kD, 为无色针状晶体, 难溶于水, 易溶于乙醇、乙
酸乙酯、丙酮等极性溶剂[1]。它不仅是植物遭受胁迫时产
生的一种能提高植物抵抗病原性攻击和环境恶化的植物
抗毒素[2], 还具有抗癌[3]、抗氧化[4]、调节血脂[5], 影响寿
命[6]等多方面有益于人类健康的重要功能。研究表明, 白
藜芦醇合成酶(resveratrol synthetic enzyme, RS)是 Res合
成代谢途径中最后一个起作用的关键酶 , 也是合成途径
中唯一必需的合成酶[7]。
1990年 Lanz 等克隆到 4个花生 RS基因[8], 近年来,
有更多的 RS基因在虎杖、葡萄、花生等种子植物中被分
离并克隆[9-10]。而根据所获得的 RS 基因来源的不同, 组
织表达模式也有所差别 , 导致各基因在植物中可能具有
不同的生理功能。有报道指出, 花生 RS 基因在根、茎、
叶等部位均有表达; 而诱导表达模式分析显示, 花生 RS
基因表达可受紫外线、伤害等因素诱导[11]。
在以往研究的基础上 , 本文通过同源克隆的方法 ,
在花生根中克隆到 RS基因 PNRS1, 并分析其组织表达模
342 作 物 学 报 第 36卷

式、紫外照射及激素处理下的诱导表达情况; 同时利用大
肠杆菌原核表达系统将该基因进行表达 , 最终获得
PNRS1的蛋白产物, 为进一步研究 RS的生理、生化功能,
基因修饰及蛋白产物之间的关系 , 有目的地进行作物遗
传改良提供了工作基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
选用花生鲁花 14, 在人工气候室培养, 光周期为 16
h, 25 /8 h, 20℃ ℃, 定期浇水至萌发。分别提取花生根(25
d)、茎(15 d)、叶(15 d)、花及种子的 RNA, 保存于−70 , ℃
用于反转录及相关实验。采用水培法培养花生, 待种子萌
发 20 d后, 分别用 5 mmol L−1乙烯利处理 12 h、254 nm
的 UV-B紫外光[超净操作台紫外消毒灯(220 W, 220 V, 50
Hz)]照射 2 h并暗培养恢复 12 h后, 收集叶片用液氮速冻
后于−70℃保存备用。
1.2 基因组 DNA和 RNA提取
参照陈由强等[12]CTAB法提取花生基因组 DNA。利
用 Trizol法[13]略作改动分别提取花生各组织 RNA。
1.3 花生中 PNRS1的克隆及序列分析
以反转录获得的花生单链 cDNA为模板进行 PCR扩
增。根据 GenBank 中已登录的花生 RS 基因序列
(AY170347)设计特异性引物 PNRS1p1: 5′-CGGGATCC
ATGGTGTCTGTGAGTGGAATT-3′(下画线显示引入的
BamH I 位点 )、 PNRS1p2: 5′-CGAGCTCGTATTATAT
GGCCATGCTGC-3′ (下画线显示引入的 Sac I位点)。PCR
体系(25 μL)含: 10×PCR buffer 2.5 μL、dNTPs (2.5 mmol
L−1) 1 μL、PNRS1p1、PNRS1p2引物(10 μmol L–1)各 1 μL、
单链 cDNA 2 μL、Ex Taq DNA Polymerase 0.3 μL、ddH2O
17.2 μL; 反应程序为 94 10 min℃ ; 94 40 s℃ , 55 30 s℃ ,
72 2 min℃ , 共 30个循环, 72 10 min℃ 。
扩增产物经琼脂糖凝胶电泳并回收后, 与 pMD18-T
Vector连接并转化大肠杆菌 DH5α感受态细胞, 转化细胞
经含氨苄青霉素(Amp) 100 μg mL−1的 X-gal/IPTG/LB平
板进行蓝白斑筛选 , 对可能的阳性菌斑提取质粒并进行
酶切鉴定。酶切体系(20 μL)含 pMDPNRS1 2 μL、10×M
buffer 2 μL、Hind III 0.5 μL、ddH2O 15.5 μL, 于 37℃水
浴 2 h。对酶切鉴定阳性的重组质粒 pMDPNRS1(图 1)进
行测序及核苷酸序列同源性比对, 应用 MEGA 软件进行
进化分析。
1.4 花生中 RS 基因－PNRS1 的组织表达和诱导表达模
式分析
以花生各组织, 经紫外线及激素处理的材料的 RNA
为模板, 经反转录分别获得第一链 cDNA, 以此为模板进
行 RT-PCR。基因引物为 RSp1: 5′-CGGGATCCATGGTGTC
TGTGAGTGGAATT-3′, RSp2: 5′-CGAGCTCGTATTATAT
GGCCATGCTGC-3′; 内标引物 Actin-1: 5′-GCCCAACTA
GCGAGTCGAAC-3′, Actin-2: 5′-CAGAACCCAGAAGGC
TCTCC-3′; 反应条件为 94 10 min℃ ; 94 40 s℃ , 55 30 s℃ ,
72 1 min℃ 30 s、共 30个循环, 于 72℃下延伸 10 min。
1.5 花生 PNRS1基因原核表达载体的构建及鉴定
分别用 BamH I 和 Sac I 双酶切质粒 pMDPNRS1 和
pET-28a(+), 酶切体系(20 μL)含 pMDPNRS1 2 μL, 10×K
buffer 1 μL, BamH I和 Sac I各 0.5 μL, ddH2O 16 μL, 于
37℃水浴 2 h。PNRS1片段经回收并与线性 pET-28a(+)连
接, 构建成原核表达载体 pET-28a-PNRS1(图 2), 经转化
及 Kan 50 µg mL–1的抗性筛选, 结合酶切鉴定, 经测序确
认读框是否正确。
将 pET-28a-PNRS1转化入 BL21 (DE3)的感受态细胞
中, 经抗性筛选及 PCR (参数设置同 1.4), 对阳性克隆进
行鉴定。
1.6 PNRS1蛋白的表达及 SDS-PAGE电泳
将含有质粒 pET-28a-PNRS1 的 BL21(DE3)的阳性克
隆振荡培养, 菌液以 1∶100稀释于预温的选择性 LB培养
液中, 进一步培养至 OD 值约为 0.6 后, 分别以不同浓度
IPTG (0.2、0.5、0.7、1.0、2.0 mmol L−1)和不同时间(1、2、
3、4和 5 h)进行诱导。菌体经等量还原性 2×SDS样品缓
冲液裂解, 经 12%的 SDS-PAGE电泳, 染色后在凝胶成像
仪上对电泳结果进行鉴定并照相。


图 1 pMDPNRS1图谱
Fig. 1 Map of pMDPNRS1


图 2 pET-28a-PNRS1图谱
Fig. 2 Map of pET-28a-PNRS1
2 结果与分析
2.1 PCR产物的克隆及酶切鉴定
PCR扩增产物经 1%琼脂糖凝胶电泳, 得到约 1.2 kb
第 2期 韩晶晶等: 花生白藜芦醇合成酶基因 PNRS1的克隆及其在原核中的表达 343


的条带(图 3), 与预期大小一致。该产物与 pMD18-T载体
连接, 对获得阳性克隆提取质粒后, 用 Hind III进行酶切
鉴定(图 4), 证明载体构建成功 , 将此重组载体命名为
pMDPNRS1。

图 3 PNRS1的 RT-PCR扩增结果
Fig. 3 Results of PNRS1 amplified by RT-PCR
M: 分子量; 1: 基因 PNRS1的 PCR产物。
M: molecular weight marker; 1: PCR product of PNRS1.



图 4 质粒 pMDPNRS1的酶切鉴定
Fig. 4 Identification of plasmid pMDPNRS1 by enzyme digestion
M: 分子量; 1: 酶切产物。
M: molecular weight marker, 1: products of enzyme digestion.

经测序 , 克隆片段包含 1 188个核苷酸(其中 3′和 5′
分别含限制性酶切位点及保护碱基), 具有起始密码子和
终止密码子, 为一个完整的阅读框架, 编码 389 个氨基酸
残基(图 5)。核酸序列比对表明, 与已报道的花生 RS核苷
酸序列(AY170347)的同源性为 95%。所克隆的 PNRS1 基
因与花生数据库中已有的几个 RS基因的核苷酸序列的相
似性为 91%~93%。蛋白质同源比较显示, 其所翻译的蛋
白质与已知花生RS基因的相似性为 94%~97%, 与大豆查
儿酮合酶的相似性为 86.4%, 与葡萄中芪合酶基因的相似
性为 81.4%, 与虎杖芪合酶基因的相似性为 72.7% (图 6)。
2.2 PNRS1基因的组织表达模式及诱导表达模式
利用 RT-PCR 的方法对花生 RS 基因 PNRS1 的表达
模式进行了研究。如图 7所示, PNRS1在花生根中特异性
表达, 且表达量随循环数的增加而增强, 而在其他组织中
表达量较低或未见表达。
利用 RT-PCR的方法对乙烯利和紫外光 UV-B照射后
基因的表达情况进行了分析。结果显示, PNRS1对 5 mmol
L–1 乙烯利处理没有响应, 而能够响应紫外线的诱导, 经
紫外线照射后基因表达程度明显增强(图 8)。正义转基因

图 5 花生 PNRS1序列信息
Fig. 5 The sequence information of PNRS1 gene
方框: 引物位置; 三角: 活力位点; 双下画虚线: 芪合酶特征序列。
Frame: primer; Triangle: activity site; Double dash lines: characteristic
sequence of stilbene sythnase.

植株在紫外线照射下, 植株叶片未出现明显皱缩, 地上部
分受损程度低于对照(图 9), 暗示 PNRS1基因的导入有利
于提高植物抗紫外线损伤的能力。
2.3 PNRS1原核表达载体的构建及鉴定
从 pMDPNRS1上用 BamH I和 Sac I切下 PNRS1基
因片段, 定向插入经 BamH I和 Sac I酶切的原核表达载体
pET-28a(+)中, 经转化并对可能的阳性克隆进行酶切鉴定,
证明原核表达载体 pET-28a-PNRS1 构建成功(图 10), 经
测序证明目的基因 PNRS1 的阅读框与原核表达载体上的
His-Tag阅读框正确融合。
将构建好的原核表达载体 pET-28a-PNRS1 导入大肠
杆菌 BL21(DE3)感受态细胞, 在含 Kan 50 μg mL−1的 LB
培养基上进行筛选, 对阳性菌斑进行 PCR 检测, 得到约
1.2 kb的特异性条带(图 11), 表明 pET-28a-PNRS1原核表
达载体被成功导入大肠杆菌 BL21 (DE3)。
344 作 物 学 报 第 36卷



图 6 PNRS1与其他物种中芪合酶基因的进化树
Fig. 6 Phylogenetic tree based on the similarity of STS genes sequences in different plant species
AHRS: 花生(AY170347); AHSTS: 花生(AY826726); AHCHS: 花生(AY735111); VSTCHS: 葡萄(XM_002276885); VSTRS1: 葡萄(AF274281);
VSTSTS1: 葡萄(DQ366301); SoyCHS: 大豆(X52097); PCRS: 虎杖(EF117976); PCSTS: 虎杖(DQ459349)。
AHRS(AY170347); AHSTS(AY826726); AHCHS(AY735111); VSTCHS(XM_002276885); grape VSTRS1(AF274281); VSTSTS1(DQ366301);
SoyCHS(X52097); PCRS(EF117976); PCSTS(DQ459349).


图 7 RT-PCR对 PNRS1的组织表达模式分析
Fig. 7 Tissue expression pattern analysis of PNRS1 by RT-PCR

图 8 RT-PCR对 PNRS1的诱导表达模式分析
Fig. 8 Induced expression pattern analysis of PNRS1 by RT-PCR

图 9 紫外照射下对照与转基因植株表型
Fig. 9 Phenotype of control and transgenic plants under UV
treatment

2.4 蛋白产物的 SDS-PAGE鉴定
经 SDS-PAGE 分析显示 , 重组菌株 BL21(DE3)
PNRS1在 37℃下经 1.0 mmol L−1的 IPTG诱导, 1 h后就能
在分子量约 46 kD位置上看到明显的诱导带(图 12), 该条
带大小与外源基因编码蛋白大小的理论值相符 , 表明外
源基因可表达并获得诱导产物。图中还显示, 随诱导时间
的延长, PNRS1蛋白的表达量逐渐提高, 在诱导 3~4 h后,

图 10 质粒 pET-28a-PNRS1酶切鉴定
Fig. 10 Identification of plasmid pET-28a-PNRS1 by double en-
zyme digestion
M: 分子量; 1: 双酶切产物。
M: molecular weight marker; 1: products of double enzyme digestion.


图 11 导入 pET-28a-PNRS1的 BL21(DE3)菌液 PCR鉴定结果
Fig. 11 Identification of BL21(DE3) transformed by
pET-28a-PNRS1
M: 分子量; 1: 阳性对照, 质粒 pET-28a-PNRS1; 2: 阴性对照, 空载体
pET-28a(+); 3~4: 转化入 pET-28a-PNRS1的大肠杆菌 BL21 (DE3)。
M: molecular weight marker; 1: positive control, plasmid
pET-28a-PNRS1; 2: negative control, vector of pET-28a(+);
3–4: E. coli BL21 (DE3) transformed by pET-28a-PNRS1.

第 2期 韩晶晶等: 花生白藜芦醇合成酶基因 PNRS1的克隆及其在原核中的表达 345


丰度达到最高, 之后随诱导时间的延长而略有升高(结果
未列出)。同时, 不同 IPTG浓度对外源蛋白的诱导程度无
明显差异, 0.2 mmol L−1的 IPTG即可诱导外源蛋白的表达,
而 1.0 mmol L−1 IPTG诱导效果略好。

图 12 外源融合蛋白在不同诱导时间的表达情况
Fig. 12 Expression of fusion protein under different culture time
1: 负对照, 空载体 pET-28a(+)诱导 4 h; M: 蛋白分子量; 2: 负对照,
未诱导菌体蛋白; 3: pET-28a-PNRS1诱导 1 h, 4: pET-28a-PNRS1诱导
2 h; 5: pET-28a-PNRS1诱导 3 h; 6: pET-28a-PNRS1诱导 4 h。
1: negative control, vector of pET-28a(+) was induced for 4 h; M: pro-
tein marker; 2: negative control, uninduced bacterior;
3: pET-28a-PNRS1 was induced for 1 h; 4: pET-28a-PNRS1 was in-
duced for 2 h; 5: pET-28a-PNRS1 was induced for 3 h; 6:
pET-28a-PNRS1 was induced for 4 h.
3 讨论
Res 作为一类重要的植物次生代谢产物, 本身具有
多种生物学功能与重要的保健作用。该物质不仅可使植物
获得并提高抵抗恶劣环境的能力[14], 近几年研究还表明,
它还具有抗肿瘤[15-16], 抗氧化[17]、调节雌激素水平[18]、
调节血脂[19]、影响代谢及延长寿命[20]等功效。
RS 作为 Res 合成途径中的唯一、必需的关键酶, 对
植物中 Res含量及代谢都具有重要的调控作用。 烜张 等[21]
对花生不同组织中白藜芦醇含量测定显示, 其根、茎、花、
果壳、种衣等部位中均含有 Res, 以花生根中含量最高,
暗示 RS基因在在植物体内存在时空表达的调控。本文对
RS 基因组织表达模式的研究发现, 其特异性存在于花生
根中 , 笔者以根为材料 , 经同源克隆法分离到 RS 基因
PNRS1, 经测序及同源比较, 发现该序列包含完整的阅读
框, 除部分碱基因品种差异而不同外, 该基因与几种已知
芪合酶及查儿酮合酶的序列保守性较高。同时, PNRS1在
序列组成上与芪合酶家族其他成员有一定的共性 , 氨基
酸总数在 380~400之间、相对分子量约为 43 kD、包含特
征性序列 GVLFGFGPGLT 及活性位点 Cys[10]、序列中均
存在一个内含子, 虽其长度有差异, 但其位置几乎都是从
同一位置开始(180 nt附近)。另外, Lanz等[22]认为, 芪合
酶结合底物的活性中心位点为 Cys164或 Cys169, 与来自不
同品种植物的酶活性中心的位置略有偏差。而 PNRS1 所
编码蛋白质也具有 Cys164特征活性位点。已报道在植物的
许多物种中, RS基因是多拷贝存在的[23]。究其原因, 可能
是由于白藜芦醇作为一种重要的植保素 , 当植物受到较
严重的病菌、恶劣环境等胁迫时, 单拷贝 RS 基因无法瞬
时诱导产生足够的 Res来抵抗外来威胁, 故在长期进化及
适应过程中 , 植物中形成并保留了多拷贝的白藜芦醇合
酶基因。他们同时指出, 由于花生在长期进化过程中经历
了多次基因渗入事件, 故推测花生中存在多种不同的 RS
基因。而本文中所克隆的基因 PNRS1, 综上结果推测应为
花生 RS 多基因家族中的一员, 根据其在序列上与其他成
员较近的亲缘关系 , 暗示其编码产物具备芪合酶家族成
员的活性及功能。蛋白质是基因功能的体现者, 通过构建
PNRS1 原核蛋白表达载体, 实现了外源蛋白在大肠杆菌
中的诱导表达, 且蛋白产物随 IPTG 浓度的增加及随诱导
时间的延长而表达量略有提高, 在经 1 mmol L–1 IPTG诱
导 3~4 h后, 丰度达到较高, 之后随诱导时间的延长而略
有增加。
植物在生长过程中必须不断地进行光合作用以制造
养分 , 在进行光合作用时不可避免地也会接受到紫外线
的照射。2007年, 美国的化学家指出, 植物体经大剂量的
紫外线照射可引起体内 DNA分子的不正常聚合并导致遗
传物质异常存在, 阻碍并抑制植物生长。而 DNA 分子驱
散紫外光产生的能量越快, 生物体受损的机率越小[24]。已
有研究证实, Res 可通过缓解植物体内遗传物质异常状态
而对 DNA损伤有明显的保护作用[25], 因此提高植物体内
Res的含量可以提高其抗紫外损伤的能力。而 Res的含量
与 RS的表达水平直接相关。本文中, 花生 PNRS1基因表
达可受波长为 254 nm 的 UV-B 紫外线照射诱导, 而其表
达水平的提高进一步促进体内 Res的合成, 从而间接在植
物抗紫外辐射损伤中发挥作用。同时, 瑞士科学家在《自
然》杂志上报告说: 高剂量紫外线照射及恶劣环境所造成
的植物生殖细胞基因变异可遗传 , 进而导致植物群体变
异及物种不稳定。这种结果对农业生产来说尤其危险, 会
导致一些经过多年杂交选择获得的优良作物 , 在长期紫
外辐照等不良环境下丢失优良性状。因此进行 RS的相关
研究, 通过作物转基因育种、导入外源 RS 基因来提高目
的植物中白藜芦醇的含量 , 从而提高作物对紫外照射等
环境胁迫的抵抗力及耐受性, 是一项很有意义的工作。笔
者目前已经获得 PNRS1 的烟草转基因植株, 相关表型、
生理指标及基因作用机理等方面的研究正在进行中。
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