全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(1): 8794 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(30871556, 30900910)和国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2006AA10Z1D3)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 张正圣, E-mail: zhangzs@swu.edu.cn, Tel: 13883608797 ** 共同第一作者
Received(收稿日期): 2010-04-16; Accepted(接受日期): 2010-07-29.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.00087
ET-ISJ标记的开发及陆地棉遗传图谱构建
林 刚 张 轲** 张 建 滕中华 张正圣*
西南大学农学与生物科技学院 / 农业部生物技术与作物品质改良重点开放实验室, 重庆 400716
摘 要: 根据植物结构基因外显子拼接位点的保守序列, 设计扩增外显子的 ET-ISJ (exon targeted intron-exon splice
junction)标记引物。利用 1 280对 ET-ISJ引物组合, 对陆地棉品种渝棉 1号和 T586进行多态性筛选, 获得 69对多态
性引物组合, 占引物组合的 5.4%。用多态性 ET-ISJ引物组合检测(渝棉 1号×T586)F2:7重组近交系群体, 得到 70个位
点。以 70 个 ET-ISJ 标记位点与 523 个 SSR、59 个 IT-ISJ、29 个 SRAP 和 8 个形态标记进行连锁分析, 构建的遗传
连锁图谱包括 59个连锁群和 673个位点(68个 ET-ISJ、510个 SSR、58个 IT-ISJ、29个 SRAP和 8个形态标记)。连
锁图覆盖 3 216.7 cM, 约占棉花基因组的 72.3%, 标记间平均距离为 4.8 cM。68个 ET-ISJ标记分布于 20条染色体。
研究表明 ET-ISJ标记多态性较高、稳定性好, 可有效用于棉花与其他植物遗传连锁图谱构建。
关键词: 陆地棉; 外显子定靶内含子-外显子剪接位点标记; 遗传图谱
Development of Exon-Targeted Intron-Exon Splicing Conjunction (ET-ISJ)
Marker and Establishment of Upland Cotton Genetic Map
LIN Gang, ZHANG Ke**, ZHANG Jian, TENG Zhong-Hua, and ZHANG Zheng-Sheng*
College of Agronomy and Biotechnology / Key Laboratory of Biotechnology & Crop Quality Improvement, Ministry of Agriculture, Southwest
University, Chongqing 400716, China
Abstract: Cotton is the leading fiber crop in the world, and upland cotton contributes over 95% of cotton production. The genetic
map of upland cotton is far from saturated, so it is necessary to develop new markers for genetic map construction. ET-ISJ (exon
targeted intron-exon splice conjunctions) marker primers were designed according to the conserved intron-exon splicing junction
sequences. A total of 1 280 ET-ISJ primer combinations were used to screen polymorphism between upland cotton cultivar Yu-
mian 1 and T586, and 69 of which showed polymorphism, accounting for 5.4% of total primer combinations. The 69 polymorphic
ET-ISJ primer combinations were used to genotype 270 F2:7 recombinant inbred line derived from (Yumian 1 × T586), and 70
ET-ISJ loci were obtained. Linkage analysis was conducted on 70 ET-ISJ, 523 SSR, 59 IT-ISJ, 29 SRAP and 8 morphological loci,
and a linkage map including 59 linkage groups and 673 loci (68 ET-ISJ, 510 SSR, 58 IT-ISJ, 29 SRAP and 8 morphological loci)
was established. The linkage map covered 3 216.7 cM, accounting for 72.3% of cotton genome, with an average interval of 4.8
cM between two markers. Sixty-eight ET-ISJ loci were located on 20 chromosomes. The present study demonstrated that ET-ISJ
markers were stable, highly polymorphic, and able to be effectively applied in genetic map construction of cotton and other
plant’s.
Keywords: Upland cotton (Gossypium hirsutum L.); ET-ISJ; Genetic map
棉花有草棉、亚洲棉、陆地棉和海岛棉 4 个栽
培种, 其中陆地棉占世界棉花产量的 95%以上, 海
岛棉占 2%左右[1]。然而作为纺织工业原料陆地棉的
纤维品质比海岛棉差。如何培育高产优质陆地棉品
种一直是棉花育种的重要目标。棉花产量、纤维品
质等性状为数量性状, 传统遗传改良方法进展缓慢,
效率低。DNA标记技术的研究进展为数量性状的遗
传改良提供了快速有效的方法[2]。在构建遗传连锁
图谱和定位数量性状基因座的基础上, 利用与 QTL
紧密连锁的分子标记进行分子标记辅助选择, 可大
幅度提高育种效率。利用海陆种间杂交群体, 已构
建了相对饱和的棉花种间图谱[3-5]。由于棉花种间杂
交遗传连锁图谱难以用于陆地棉遗传改良[6-7], 因此
需要构建陆地棉饱和遗传连锁图谱。而陆地棉品种
88 作 物 学 报 第 37卷

间的DNA标记多态性低, 目前所构建遗传连锁图谱
的标记密度、基因组覆盖率还不能满足分子标记辅
助选择的需要[8], 需要开发大量新型标记。Lin 等[9]
和 Zhang 等[8]相继将 SRAP 标记应用于棉花遗传连
锁图谱的构建。郑靓等 [10]根据植物基因内含子-外显
子剪接位点保守序列设计了扩增内含子的 IT-ISJ,
并将其应用于陆地棉遗传图谱构建。本研究利用不
同 ET-ISJ引物组合对陆地棉重组近交系群体进行标
记基因型检测, 构建遗传连锁图谱, 以确定 ET-ISJ
标记在作物遗传连锁图谱构建中的应用价值。
1 材料与方法
1.1 亲本及重组近交系群体基因组 DNA提取
2006年于西南大学重庆北碚歇马科研基地种植
270 个(渝棉 1 号×T586)F2:7重组近交系[11]。采用改
良的 CTAB法[12]提取渝棉 1号、T586、F1、重组近
交系幼叶 DNA。
1.2 ET-ISJ引物设计
参照郑靓等[10]的方法设计扩增外显子的 ET-ISJ
引物。根据前体 mRNA 内含子-外显子剪接边界 5
端保守序列 TGTGCAGGT 作为正向引物的核心部
分, 以剪接边界 3端保守序列 ACTTACCTG作为反
向引物的核心部分, 为保证引物的退火温度在 55℃
左右, 同时为下一步进行 PCR 产物克隆测序, 在正
向引物 5端加上限制性内切酶 EcoR I 的识别序列
GAATTC, 在反向引物 5端加上限制性内切酶 Pst I
的识别序列 CTGCAG。正向引物与反向引物均在 3
端加上 3个任意选择碱基(表 1)。

表 1 遗传连锁图谱构建所用 ET-ISJ引物
Table 1 ET-ISJ primers used in establishing linkage map
引物名
Primer name
序列
Sequence (5→3)
序列
Sequence (5→3)
正向引物 Forward primer 反向引物 Reverse primer
ET-ISJ01F GAATTCTGTGCAGGTAAA ET-ISJ19R CTGCAGACTTACCTGCAG
ET-ISJ02F GAATTCTGTGCAGGTAAC ET-ISJ22R CTGCAGACTTACCTGCCC
ET-ISJ03F GAATTCTGTGCAGGTAAG ET-ISJ23R CTGCAGACTTACCTGCCG
ET-ISJ04F GAATTCTGTGCAGGTAAT ET-ISJ24R CTGCAGACTTACCTGCCT
ET-ISJ05F GAATTCTGTGCAGGTACA ET-ISJ26R CTGCAGACTTACCTGCGC
ET-ISJ06F GAATTCTGTGCAGGTACC ET-ISJ29R CTGCAGACTTACCTGCTA
ET-ISJ07F GAATTCTGTGCAGGTACG ET-ISJ31R CTGCAGACTTACCTGCTG
ET-ISJ08F GAATTCTGTGCAGGTACT ET-ISJ33R CTGCAGACTTACCTGGAA
ET-ISJ09F GAATTCTGTGCAGGTAGA ET-ISJ35R CTGCAGACTTACCTGGAG
ET-ISJ10F GAATTCTGTGCAGGTAGC ET-ISJ38R CTGCAGACTTACCTGGCC
ET-ISJ11F GAATTCTGTGCAGGTAGG ET-ISJ39R CTGCAGACTTACCTGGCG
ET-ISJ12F GAATTCTGTGCAGGTAGT ET-ISJ40R CTGCAGACTTACCTGGCT
ET-ISJ13F GAATTCTGTGCAGGTATA ET-ISJ41R CTGCAGACTTACCTGGGA
ET-ISJ14F GAATTCTGTGCAGGTATC ET-ISJ42R CTGCAGACTTACCTGGGC
ET-ISJ15F GAATTCTGTGCAGGTATG ET-ISJ43R CTGCAGACTTACCTGGGG
ET-ISJ16F GAATTCTGTGCAGGTATT ET-ISJ44R CTGCAGACTTACCTGGGT
ET-ISJ17F GAATTCTGTGCAGGTCAA ET-ISJ45R CTGCAGACTTACCTGGTA
ET-ISJ18F GAATTCTGTGCAGGTCAC ET-ISJ46R CTGCAGACTTACCTGGTC
ET-ISJ19F GAATTCTGTGCAGGTCAG ET-ISJ47R CTGCAGACTTACCTGGTG
ET-ISJ20F GAATTCTGTGCAGGTCAT ET-ISJ48R CTGCAGACTTACCTGGTT
反向引物 Reverse primer ET-ISJ49R CTGCAGACTTACCTGTAA
ET-ISJ01R CTGCAGACTTACCTGAAA ET-ISJ50R CTGCAGACTTACCTGTAC
ET-ISJ02R CTGCAGACTTACCTGAAC ET-ISJ51R CTGCAGACTTACCTGTAG
ET-ISJ03R CTGCAGACTTACCTGAAG ET-ISJ52R CTGCAGACTTACCTGTAT
ET-ISJ04R CTGCAGACTTACCTGAAT ET-ISJ53R CTGCAGACTTACCTGTCA
ET-ISJ05R CTGCAGACTTACCTGACA ET-ISJ55R CTGCAGACTTACCTGTCG
ET-ISJ08R CTGCAGACTTACCTGACT ET-ISJ56R CTGCAGACTTACCTGTCT
ET-ISJ10R CTGCAGACTTACCTGAGC ET-ISJ57R CTGCAGACTTACCTGTGA
ET-ISJ11R CTGCAGACTTACCTGAGG ET-ISJ58R CTGCAGACTTACCTGTGC
ET-ISJ12R CTGCAGACTTACCTGAGT ET-ISJ59R CTGCAGACTTACCTGTGG
ET-ISJ13R CTGCAGACTTACCTGATA ET-ISJ61R CTGCAGACTTACCTGTTA
ET-ISJ15R CTGCAGACTTACCTGATG ET-ISJ62R CTGCAGACTTACCTGTTC
ET-ISJ16R CTGCAGACTTACCTGATT ET-ISJ63R CTGCAGACTTACCTGTTG
ET-ISJ17R CTGCAGACTTACCTGCAA ET-ISJ64R CTGCAGACTTACCTGTTT
引物名
Primer name
第 1期 林 刚等: ET-ISJ标记的开发及陆地棉遗传图谱构建 89


1.3 ET-ISJ标记的扩增与检测
ET-ISJ 标记扩增反应体系含 1.0 L 10×PCR
buffer、1.5 L MgCl2 (25 mmol L–1)、0.2 L dNTP (2
mmol L–1)、0.5 μL正向引物(10 mol L–1)、0.5 μL
反向引物(10 mol L–1)、0.1 L Taq DNA聚合酶(5 U
L)、1.0 L模板 DNA (50 ng L), 以双蒸水补足
10.0 L。扩增程序为 94℃预变性 5 min; 94℃变性
45 s, 53℃退火 45 s, 72℃延伸 1 min, 40个循环; 72℃
10 min。采用银染方法检测 ET-ISJ标记[12]。命名标
记以引物组合加一字母, 如 ET-ISJ18F58Ra, 18F 为
正向引物, 58R为反向引物, a表示一个引物组合产
生多个位点中分子量较小的位点。
1.4 遗传连锁图谱的构建
采用 JoinMap3.0 作图软件[13], 以 LOD=4.0, 重
组率=0.4, Kosambi作图函数进行遗传连锁分析。根
据已定位在染色体上的形态标记和 SSR 标记[8], 确
定 ET-ISJ 标记在染色体上的分布。采用绘图软件
MapChart2.2 [14]绘制遗传连锁图谱。
2 结果与分析
2.1 ET-ISJ引物多态性表现
利用 1 280对 ET-ISJ引物组合 , 对陆地棉品种
渝棉 1号和 T586进行多态性筛选, 每个引物组合产
生 1~10个清晰条带(图 1), 片段为 80~1 000 bp, 其
中 69对引物在两亲本间具多态性, 占 5.4%。
2.2 ET-ISJ标记遗传连锁图谱
以 69对多态性 ET-ISJ引物组合检测(渝棉 1号
×T586)F2:7重组近交系群体, 获得 70个标记位点(图
2~图 4)。其中 62个表现显性, 占 88.6%; 8个表现共
显性, 占 11.4%。70个标记位点中有 23个偏离 1∶1
的孟德尔分离比例(P≤0.05), 占标记位点的 32.9%。
其中 6个位点较严重偏离孟德尔分离比例(P≤0.001),
占标记位点的 8.7%。
以 70个 ET-ISJ标记位点与 523个 SSR、59个
IT-ISJ、29 个 SRAP 和 8 个形态标记进行遗传连锁
分析 , 构建的遗传连锁图谱包括 59个连锁群、673
个位点(68个 ET-ISJ、510个 SSR、58个 IT-ISJ、29

图 1 不同 ET-ISJ引物组合的多态性
Fig. 1 Polymorphisms of different ET-ISJ primer combinations between Yumian 1 and T586
M: 标准分子量 DNA; P1: T586; P2: 渝棉 1号; 箭头表示多态性位点。
M: DNA marker; P1: T586; P2: Yumian 1; Arrows indicate polymorphic loci.

图 2 重组近交系群体 ET-ISJ04F61R的电泳图
Fig. 2 Electrophoregram of ET-ISJ04F61R in recombinant inbred line population
M: 标准分子量 DNA; P1: T586; P2: 渝棉 1号; F1: 杂交 1代; 1~45: 重组近交系。
M: DNA marker; P1: T586; P2: Yumian 1; F1: hybridization F1; 1–45: recombinant inbred lines.

个 SRAP和 8个形态标记)(图 5)。连锁图覆盖 3 216.7
cM, 占棉花基因组的 72.3%, 标记间平均距离为 4.8
cM。68个 ET-ISJ标记分布于 20条染色体(表 2), 其
中第 6、第 8染色体均分布 14个 ET-ISJ标记。
90 作 物 学 报 第 37卷


图 3 重组近交系群体 ET-ISJ10F53R的电泳图
Fig. 3 Electrophoregram of ET-ISJ10F53R in recombinant inbred line population
M: 标准分子量 DNA; P1: T586; P2: 渝棉 1号; F1: 杂交 1代; 1~45: 重组近交系。
M: DNA marker; P1: T586; P2: Yumian 1; F1: hybridization F1; 1–45: recombinant inbred lines.

图 4 重组近交系群体 ET-ISJ11F33R的电泳图
Fig. 4 Electrophoregram of ET-ISJ11F33R in recombinant inbred line population
M: 标准分子量 DNA; P1: T586; P2: 渝棉 1号; F1: 杂交 1代; 1~45: 重组近交系。
M: DNA marker; P1: T586; P2: Yumian 1; F1: hybridization F1; 1–45: recombinant inbred lines.

表 2 标记在遗传连锁图谱的分布
Table 2 Distribution of markers on genetic linkage map
染色体
Chromosome
总位点
Total loci
ET-ISJ IT-ISJ SSR SRAP 形态标记
Morphological marker
长度
Length (cM)
1 18 4 1 13 0 0 101.1
2 19 0 0 19 0 0 128.1
3 18 1 1 14 2 0 88.6
4 16 2 0 14 0 0 115.0
5 31 0 3 27 0 1 219.7
6 59 14 7 36 1 1 108.9
7 24 3 1 12 1 2 111.9
8 62 14 5 36 7 0 115.2
9 19 0 1 18 0 0 99.6
10 20 0 3 16 1 0 153.9
11 30 1 2 25 2 0 150.6
12 14 1 1 10 1 1 101.3
13 38 7 6 23 1 1 81.2
14 32 1 6 24 1 0 123.9
15 23 0 0 21 1 1 134.5
16 22 2 1 18 0 1 120.4
17 15 1 0 13 1 0 91.0
18 19 1 1 17 0 0 96.8
19 30 1 4 25 0 0 215.2
20 22 1 2 18 1 0 130.0
21 39 7 3 28 1 0 174.0
22 11 2 0 9 0 0 101.4
23 25 3 3 16 3 0 89.4
24 21 1 4 16 0 0 128.1
25 34 1 1 27 5 0 83.2
26 12 0 2 10 0 0 126.2
合计 Total 673 68 58 518 29 8 3216.7
第 1期 林 刚等: ET-ISJ标记的开发及陆地棉遗传图谱构建 91























































(图 5)

NAU32610.0
MUSB0042*2.4
DPL0520*4.4
MUCS524**6.5
IT-ISJ07F28R**8.1
BNL359411.3
IT-ISJ01F63Rb15.7
NAU277317.8
TMB13690.0
NAU115111.0
NAU093815.2
JESPR25219.0
DPL023822.3
TMB085337.1
BNL256941.0
CIR203*43.1
TMB0154**44.6
TMB153847.3
SRAP04F13R***54.7
ET-ISJ14F33R0.0
ET-ISJ18F31R4.3
ET-ISJ18F19R5.3
ET-ISJ18F55R6.4
ET-ISJ08F48R6.9
ET-ISJ16F29R7.9
ET-ISJ15F10R8.6
ET-ISJ18F39R9.4
ET-ISJ10F17R10.1
ET-ISJ07F40R10.8
ET-ISJ10F49R11.1
ET-ISJ14F05R11.8
ET-ISJ05F10R12.2
NAU268712.6
IT-ISJ07F54R12.8
NAU258113.7
MUSB107714.2
MUCS57914.5
MUSB053615.0
T115.7
IT-ISJ01F40Rb16.3
TMB294016.5
BNL410816.8
IT-ISJ07F24R17.1
NAU0874**17.5
MUSB016517.8
MUSS12218.1
TMB147518.4
ET-ISJ02F51R18.8
MUSB010319.6
MUSS50120.4
MUCS11421.6
IT-ISJ04F54R22.8
IT-ISJ07F06Rb23.9
NAU268424.4
BNL365027.1
NAU355128.9
NAU1218***29.9
MUSS09932.1
BNL1453*36.4
Chr06
NAU3435*0.0
NAU3181***5.5
CIR238***17.7
Lc1***23.0
CIR320a*29.1
NAU1048**0.0
MUSS0046.5
MUSB0770b14.8
R222.5
IT-ISJ14F04R27.2
MUSB019129.9
ET-ISJ10F11R34.5
SRAP06F53R35.3
NAU262836.9
NAU262738.5
BNL169440.2
BNL174640.7
NAU108548.9
DPL080052.7
NAU356352.9
CIR39361.4
CIR20866.7
ET-ISJ08F02R69.2
ET-ISJ19F52R*82.8
Chr07
SRAP02F46R**0.0
MUSB06406.2
MUSB0792*10.2
ET-ISJ11F56R17.0
NAU35150.0
NAU34245.4
DPL0176a10.2
NAU078017.9
NAU103725.1
NAU119630.4
NAU130235.6
MUSS25045.6
BNL1513a51.6
TMB289961.8
HAU030b0.0
MUCS5295.3
ET-ISJ14F45R6.4
MUSB10767.5
ET-ISJ06F50R9.5
ET-ISJ09F22R9.9
ET-ISJ06F04R10.5
ET-ISJ15F24R11.5
ET-ISJ15F59R11.9
DPL003012.5
JESPR04513.1
SRAP06F05R13.7
IT-ISJ11F50R14.4
ET-ISJ04F23R15.1
ET-ISJ01F55R15.6
NAU291416.1
TMB002916.4
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SRAP02F61Rb17.4
SRAP01F60R17.8
MUSB0013a18.1
MUSB016718.3
STV10718.4
ET-ISJ18F58Ra18.7
ET-ISJ10F46R19.3
MUSB005919.8
BNL347420.1
BNL166420.7
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IT-ISJ11F05R**22.7
CIR291*23.0
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ET-ISJ04F61R***24.6
CM16124.8
ET-ISJ10F08R25.5
MUCS418*26.1
BNL380026.7
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IT-ISJ06F59R*28.4
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Chr08
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MUSS05470.5
NAU274176.2
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BNL14340.0
HAU04019.6
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NAU118816.8
NAU0935*22.7
NAU276127.5
NAU102831.7
NAU0854**38.9
NAU115544.4
MUSS10748.0
CIR37661.0
NAU2859***73.6
NAU285878.3
MUSS05984.1
NAU227786.0
NAU226586.8
NAU341993.2
Chr02
NAU10810.0
NAU08624.2
JESPR1078.2
CIR133**13.2
MUSB00020.0
BNL34636.6
SRAP05F48R8.4
NAU079611.7
NAU3541***19.3
MUSB120725.1
TMB196332.3
MUSS172*35.3
NAU1190***41.9
ET-ISJ05F45R**49.3
JESPR19164.1
SRAP04F14R68.1
TMB174871.8
IT-ISJ11F52R75.4
Chr03
HAU086b*0.0
NAU0913b13.1
TMB0206**31.0
MUSS145***0.0
CIR122*5.3
NAU2162*18.7
NAU2477***23.1
NAU0913a*25.2
CIR091*27.2
DPL0451***31.1
HAU086a42.8
ET-ISJ01F03R0.0
BNL11679.6
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ET-ISJ19F13R41.2
Chr04
CIR2420.0
BNL3400*20.9
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IT-ISJ05F40R***44.0
TMB154862.7
TMB086581.4
NAU1225***0.0
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NAU1230***11.8
NAU1255***13.2
NAU0797***15.9
MUCS02019.7
CIR364*21.1
MUSS317**35.1
MUCS330**36.7
CIR27337.3
NAU115643.3
BNL360247.2
TMB148958.4
JESPR19762.0
BNL399263.7
BNL187869.3
IT-ISJ02F07R75.5
TMB166783.5
MUSB041099.4
JESPR065115.8
CIR253128.6
P1138.3
Chr05
NAU35440.0
NAU34809.6
MUSB114419.7
NAU081625.4
MUSB105629.7
CIR31633.2
IT-ISJ01F58R0.0
NAU09803.7
NAU22576.9
TMB19807.8
MUSS2818.5
DPL057012.1
NAU300814.6
DPL071717.4
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DPL0176b24.8
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SRAP05F52R*42.0
BNL289544.4
IT-ISJ01F23R45.7
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TMB126254.2
BNL062555.7
BNL280556.6
TMB122258.6
DPL025360.8
DPL052878.5
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NAU1103100.0
Chr11
NAU23170.0
STV0656.5
MUSS2590.0
IT-ISJ01F40Ra***14.9
MUSS520b***25.9
BNL0256*37.2
MUSB033845.3
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MUCS02351.0
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DPL043185.4
MUSB0768*90.5
MUSB025496.3
TMB1125110.2
BNL2960*131.3
NAU2991147.4
Chr10
DPL04430.0
NAU351912.1
NAU3186*0.0
CIR148***19.8
N1***29.7
IT-ISJ07F11Rb0.0
SRAP03F12R4.2
TMB0327*11.0
DPL003917.1
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CM05026.1
ET-ISJ06F53R37.4
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MUSB079559.5
Chr12
NAU34680.0
TMB031213.2
ET-ISJ15F48R0.0
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NAU1201**15.6
ET-ISJ07F43R17.4
NAU330719.0
NAU114120.0
BNL402920.7
NAU081722.9
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IT-ISJ01F63Ra25.3
Y126.1
MUSB097927.0
DPL087427.8
ET-ISJ18F17R28.6
ET-ISJ11F13R29.4
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IT-ISJ07F15R31.1
SRAP04F01R*31.8
IT-ISJ03F42R***32.8
TMB121634.3
MUSB0013b35.1
IT-ISJ07F23R**36.4
CIR30037.6
BNL244938.2
NAU357039.2
ET-ISJ12F46R**40.0
BNL3472*41.4
ET-ISJ12F48R**42.8
NAU121143.7
IT-ISJ03F03R*45.1
IT-ISJ03F41R**46.4
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MUSS01048.9
NAU289350.7
DPL024953.7
ET-ISJ07F38R68.0
Chr13
92 作 物 学 报 第 37卷


































































图 5 ET-ISJ标记在陆地棉遗传连锁图上的分布
Fig. 5 Distribution of ET-ISJ markers on upland cotton linkage map
*、**、***分别表示 P≤0.05、0.01和 0.001的偏分离标记。
*, **, and *** indicate the segregation distortion marker at P≤0.05, 0.01, and 0.001, respectively.
*
*
CIR2460.0
BNL35455.0
SRAP03F04R10.2
MUSB0770a15.1
MUSB02850.0
BNL064511.9
TMB1638b17.4
ET-ISJ17F57R*0.0
MUSB12276.7
BNL051911.7
BNL303314.8
BNL350216.2
IT-ISJ07F08R21.1
JESPR00629.8
BNL024436.1
BNL265137.8
BNL3034**39.7
CIR320b***44.8
STV12347.1
NAU235350.9
IT-ISJ09F64Rb53.8
NAU217354.0
NAU099855.6
IT-ISJ09F32Ra56.5
MUCS13856.8
MUCS407
IT-ISJ09F44R59.0
IT-ISJ09F11Ra61.2
NAU099762.6
IT-ISJ09F36Ra73.1
NAU219079.5
JESPR23191.4
Chr14
L20.0
BNL244010.7
NAU243721.5
CIR1050.0
NAU089812.3
CIR11023.5
MUSB075128.3
MUCS325a42.5
CIR3110.0
BNL078613.5
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BNL2827*29.2
NAU338434.0
BNL390239.5
BNL408244.0
DPL032248.4
TMB166455.1
CIR33456.8
TMB0323*58.4
TMB1152a60.4
TMB1660***62.1
SRAP01F21R***65.7
CIR234**70.5
Chr15
*
IT-ISJ11F38R*0.0
MUCS0368.3
MUSS34511.6
HAU00316.0
ET-ISJ04F40R20.0
NAU30960.0
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MUSS38713.7
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BNL304853.5
MUSB024057.4
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MUCS40062.4
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BNL409672.1
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TMB179177.2
TMB036681.3
NAU321793.5
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MGHES67113.3
IT-ISJ02F28Ra**131.5
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NAU2894163.8
MUSB1007178.0
IT-ISJ05F07R188.1
IT-ISJ05F15R*195.2
Chr19
ET-ISJ14F39R0.0
NAU305312.2
NAU298420.7
MGHES7637.6
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BNL379915.9
NAU262623.3
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TMB294532.4
BNL160434.7
MUSB067639.0
BNL139545.0
BNL112247.4
R1***48.8
MUCS32749.2
BNL102650.7
BNL276651.6
JESPR29754.1
MUCS373*57.1
IT-ISJ07F47R*59.5
ET-ISJ06F12R66.6
Chr16
CIR035*0.0
TMB08791.6
MUSS3548.9
NAU08550.0
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BNL2496A25.7
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HAU11920.9
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NAU2837**30.9
ET-ISJ04F64R**0.0
NAU26496.1
SRAP04F25R*11.2
NAU2291***20.5
STV011*25.5
Chr17
MUCS5350.0
IT-ISJ05F29R*5.6
BNL17218.8
BNL347913.8
HAU01517.8
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MUSS20327.8
MUSS30629.5
CIR09944.8
ET-ISJ11F62R*53.8
JESPR20463.3
TMB229573.2
JESPR17881.5
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CIR21696.8
Chr18
ET-ISJ10F53R0.0
IT-ISJ03F08Ra3.4
BNL2662*7.6
BNL3279***10.2
IT-ISJ01F38R***14.1
MUSB07750.0
MUCS0289.0
MUSS33211.9
ET-ISJ02F19R***0.0
ET-ISJ19F03R**11.3
ET-ISJ10F19R13.9
ET-ISJ01F58R16.5
JESPR02919.6
BNL140822.5
SRAP01F48Rb*25.7
BNL155131.2
IT-ISJ01F22R43.3
DPL067051.0
TMB126457.3
JESPR25159.1
BNL105360.6
BNL397661.8
ET-ISJ18F58Rb**69.7
BNL168171.0
JESPR15479.9
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NAU220687.3
CIR38590.2
TMB004392.6
DPL018196.1
NAU3265100.1
ET-ISJ03F40R**103.6
DPL0062*106.4
NAU0760110.3
NAU1012113.5
NAU3074121.1
CIR067b*122.4
BNL3442134.0
BNL1705148.0
Chr21
NAU29020.0
IT-ISJ03F13R12.7
BNL122723.1
MUSS07550.4
BNL01180.0
NAU217015.7
IT-ISJ07F13R33.7
BNL342349.0
BNL255761.3
STV11777.9
NAU308490.4
JESPR300103.1
Chr26
CIR1830.0
DPL048921.5
ET-ISJ07F42R33.8
ET-ISJ15F42R38.5
JESPR05047.1
BNL403050.7
NAU202653.4
BNL044859.4
MUCS210a***64.0
DPL0722*75.9
NAU2553101.4
Chr22
BNL15790.0
BNL31407.1
NAU092313.9
BNL131720.8
CIR19428.1
MUCS13333.6
MUSS13936.9
MUCS325b*0.0
MUSS31611.8
MUSB0382***17.9
CIR22726.0
ET-ISJ11F35R27.9
ET-ISJ12F15R*30.1
ET-ISJ11F33R32.4
SRAP01F48Ra34.3
MUSS25335.7
NAU215837.6
MUCS26938.6
CIR38339.9
JESPR01341.4
IT-ISJ06F42R**43.1
SRAP02F01R***45.4
IT-ISJ03F51R***46.8
IT-ISJ10F51R***48.7
SRAP02F61Ra***52.5
Chr23
CM0300.0
BNL25973.1
NAU099911.6
NAU235927.6
MUSB0744*37.1
NAU205443.4
CIR35448.7
BNL1513b53.0
JESPR07055.0
DPL046160.2
JESPR18368.4
BNL152169.3
MUSS03377.4
IT-ISJ08F26R85.5
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NAU265295.7
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IT-ISJ09F32Rb*108.7
IT-ISJ09F36Rb116.2
ET-ISJ20F55R119.9
IT-ISJ09F11Rb***128.1
Chr24
NAU29670.0
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BNL101520.4
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SRAP07F55R24.6
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DPL037726.1
BNL141727.0
CIR07127.7
SRAP05F25R*29.2
TMB134230.2
DPL079931.3
NAU270032.3
SRAP03F22R**33.9
SRAP06F25R*35.0
ET-ISJ01F33R38.3
Chr25
NAU21390.0
NAU250815.3
IT-ISJ03F15R0.0
MUCS210b8.0
BNL3280**12.1
CIR361*19.4
MUSB043022.5
CM082*43.3
TMB0161**60.2
IT-ISJ06F01R71.2
DPL013575.1
TMB193977.7
BNL094680.1
SRAP05F31R82.0
TMB043785.3
MUSB036587.3
BNL0662*89.4
TMB085891.1
CIR359*94.3
ET-ISJ12F01R100.3
TMB0443**105.8
BNL3895*114.7
Chr20
第 1期 林 刚等: ET-ISJ标记的开发及陆地棉遗传图谱构建 93


3 讨论
自 Reinisch 等[15]将 RFLP 标记用于棉花遗传图
谱构建以来, RFLP、AFLP、SSR和 SRAP等标记已
广泛用于棉花遗传图谱构建, 但目前所构陆地棉遗
传图谱覆盖率低, 同时所定位的 QTL与连锁标记距
离偏远, 不能满足分子标记辅助选择育种的需要[8]。
因此, 需要开发大量新型标记, 尤其是与基因紧密
连锁的分子标记。作为基因翻译起始信号、前体
mRNA 加 A 位点、启动子、增强子区域和内含子-
外显子剪接边界等保守区域均具有与基因紧密连锁
的特性[16]。此外, 绝大多数植物基因都存在内含子,
且内含子与外显子的结合区域高度保守[17]。本研究
根据前体 mRNA 内含子-外显子剪接边界保守序列
设计的扩增外显子的 ET-ISJ标记在陆地棉重组近交
系群体亲本渝棉 1号与 T586间的多态性引物组合比
例为 5.4%, 郑靓等[10]设计的扩增内含子的 IT-ISJ标
记在渝棉 1 号与 T586 间的多态性引物组合比例为
7.0%, SSR和 SRAP标记在渝棉 1号与 T586间的多
态性引物比例分别为 6.8%和 7.0%[8]。ET-ISJ标记的
多态性引物比例略低于 IT-ISJ、SSR和 SRAP标记。
在这些标记中, SSR 标记稳定性好, 但正向引物与
反向引物不能任意组合, 成本较高; ET-ISJ、IT-ISJ
和 SRAP 标记正向引物与反向引物可任意组合, 成
本较低; SRAP 标记扩增程序退火稳定较低(前 5 个
循环 35℃)[18], 易产生非特异性扩增产物[10]; ET-ISJ
和 IT-ISJ 标记具有结果稳定与成本低的优点。扩增
外显子的 ET-ISJ标记对构建陆地棉高密度遗传图谱
和 QTL定位研究具有较好的应用前景。为确定扩增
片段是否为外显子, 下一步将对 ET-ISJ 引物组合扩
增产物进行克隆测序研究。
本研究表明 ET-ISJ 标记主要表现为显性。70
个标记位点中有 23个(32.9%)位点偏离 1∶1的孟德
尔分离比例(P≤0.05), 6个(8.7%)位点严重偏离孟德
尔分离比例(P≤0.001)。Zheng等[10]研究指出, 在同
一群体 , SSR 与 IT-ISJ 标记的偏分离比例分别为
30.7%和 44.8%, 严重偏分离比例分别为 5.3%和
13.8%。ET-ISJ标记偏分离比例与 SSR标记一致, 大
多数偏分离标记集中分布于少数染色体区域。
本研究还表明 ET-ISJ标记总体上均匀分布于棉
花基因组, 但存在 ET-ISJ标记密集区域。如第 6和
8 染色体均具有 14 个 ET-ISJ 标记, 第 6 染色体上
SSR、IT-ISJ和 SRAP标记密集, 第 8染色体上 SSR
和 IT-ISJ标记密集。产生标记密集区域的可能原因,
一是目前所开发的标记不完全均匀分布于棉花基因
组; 二是本研究使用的群体亲本在标记密集区域存
在较大的 DNA 序列差异; 三是棉花基因在基因组
中分布不均匀, 存在基因密集区域。本研究使用了
SRAP、IT-ISJ和 ET-ISJ三种基因相关标记, 但这 3
种标记在图谱上无明显分布规律, 其原因可能是目
前所用引物组合数量有限, 以及所获得的标记分布
于不同的染色体区域。
4 结论
根据内含子-外显子剪接边界保守序列设计的
ET-ISJ标记应用成本低、稳定性好、多态性较高, 可
有效地用于棉花以及其他植物的遗传多样性研究、
遗传图谱构建和 QTL定位研究。
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