全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(1): 89−94 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

基金项目: 西北农林科技大学青年教师基金项目
作者简介: 郭东伟(1973−), 男, 讲师, 博士, 主要从事细胞遗传学方面的研究。
*
通讯作者(Corresponding author): 马有志, 研究员, 博士, 主要从事小麦分子育种研究。Tel: 010-68918789; E-mail: mayouzhi
@yahoo.com.cn
Received(收稿日期): 2007-05-15; Accepted(接受日期): 2007-07-31.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.00089
小麦流式分选染色体的鉴定
郭东伟1,2 胡 甘2 佘茂云3 李连城1 陈 明1 徐兆师1 马有志1,*
(1 中国农业科学院作物科学研究所分子育种系, 北京 100081; 2 西北农林科技大学农学院, 陕西杨凌 712100; 3 新疆农业大学农学院,
新疆乌鲁木齐 830052)
摘 要: 构建染色体 BAC文库对于简化拥有庞大基因组植物的测序、物理作图和基因克隆具有重要意义。分选染色
体的鉴定是整个文库构建过程的关键环节之一。 本文在前人研究的基础上, 分别采用荧光原位杂交(FISH)、原位
PCR(C-PRINS)和 PCR 方法, 对分选的 6VS、3B 和 7BL 染色体(臂)进行了鉴定。结果表明, 这 3 种方法都能对流式
分选染色体进行有效鉴定, 其中 PCR法速度最快、重复性好, 但结果不具可视性、也不能鉴定分选纯度; 而 FISH法
重复性好、结果具有可视性、能够鉴定分选纯度, 但操作程序复杂耗时, 受探针特异性的限制; C-PRINS法则综合了
上述两种方法的优点, 是最具潜力的鉴定方法, 如果与液体原位杂交相结合, 有可能为解决染色体分选问题开辟新
的途径, 但也存在重复性差、杂交信号不稳定的缺点。
关键词: 小麦染色体; 流式分选; PCR; 原位 PCR; 荧光原位杂交
Identification of Wheat Chromosomes Sorted by Flow Cytometry
GUO Dong-Wei1,2, HU Gan2, SHE Mao-Yun3, LI Lian-Cheng1, CHEN Ming1, XU Zhao-Shi1,
and MA You-Zhi1, *
(1 Department of Molecular Breeding, Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081; 2 Agronomy Coll-
ege, Northwest A & F University, Yangling 712100, Shaanxi; 3 Agronomy College, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 810012, Xinjiang,
China)
Abstract: Construction of chromosome specific BAC library plays an important role for simplifying sequencing, physical map-
ping and gene cloning of plant with complexity genome such as common wheat, identification of sorted chromosome is a vital
step of library construction. Although there were some reports about identification of sorted chromosomes using different methods,
the sorted chromosomes were different normal chromosomes and the applicability and feature of various identification methods
had also not been commented by the numbers yet. Based on previous research, the identifications of 6VS, 3B and 7BL chromo-
somes (arms) sorted from ditelosomic and common wheat were performed through fluorescence in situ hybridization (FISH),
primed in situ DNA labeling (C-PRINS) and PCR amplification methods respectively. The results showed that all of these three
methods could efficiently identify the flow sorted chromosomes. The chromosome staining before flow sorting and chromosome
damage from physical shear force during chromosome suspension preparation and flow sorting did not impact obviously the re-
sults of identification. After comparing to these three protocols, the PCR approach was the fastest with better repetition which
adapted to determine rapidly constitute of chromosomal peaks on the univariate flow karyotype histogram, but there were no visi-
ble signals and the purity of sorted chromosomes could not be determined were the disadvantages of this approach. The FISH
approach could provide a visible and repetitive result and was suit for identifying purity of the sorted chromosomes, but it was
time-consuming, complex and necessary for special probes. C-PRINS combined the advantages of FISH and PCR, had potential
for chromosomes identification, although the hybridization signals was instable and repetition was not so good at present, if com-
bined this method with in situ hybridization in suspension, a new way for chromosome flow sorting might be set up. The features
of these three methods, some key points during the identification process and their applicability also were discussed.
Keywords: Wheat chromosome; Flow sorting; PCR; C-PRINS; FISH
90 作 物 学 报 第 34卷

构建染色体特异BAC文库, 用于像小麦这样具
有复杂基因组植物的大规模测序、物理作图和基因
克隆是一条很有吸引力的途径[1]。这不仅有利于国
际分工与协作, 而且能够大大减少重复, 提高工作
效率[2]。染色体的分选与鉴定是整个染色体文库构
建过程的关键环节。有关小麦染色体分选的研究已
有一些报道[3-5], 而对于分选染色体的鉴定尚缺少相
关的系统研究。染色体鉴定的方法很多, 如分带、
原位杂交等 , 已成为细胞遗传学研究的重要内容 ,
但分选染色体不同于常规压片的染色体, 这些染色
体在流式分选之前, 根尖需要同步化处理, 获得的
染色体悬浮液也需进行荧光染色, 而同步化试剂是
否对杂交结果产生影响, 荧光原位杂交(FISH)过程
中荧光染料的选择以及复染等过程都可能与常规的
FISH染色体鉴定有所区别, 一些新的杂交方法, 如
染色体原位PCR标记 (C-PRINS)的反应条件优化等
问题都需要解决。为此, 本研究分别采用C-PRINS、
PCR和FISH方法 , 对流式分选自中国 春、中国春
7BL双端体和 6V染色体短臂的异附加系T-240 的
3B、7BL、6VS染色体(臂)进行了鉴定, 并对各方法
应用的特点、需要注意的问题及适用性进行了总结。
1 材料与方法
1.1 材料
普通小麦中国春、中国春 7BL端体和携带簇毛麦
6V 短臂的异附加系 T-240 均由本课题组保存。PCR
和 C-PRINS引物由大连宝生生物公司合成。
1.2 方法
参照Guo等[5]、Lee等[6]的方法进行同步化处理
和设定分选参数, 将目标染色体以 500 条为单位直
接分选至干净载玻片, 室内风干 2 d用于C-PRINS鉴
定, 风干 7 d用于FISH鉴定, 同时在载玻片上滴有染
色体部位的背面做标记。而PCR鉴定时染色体以 80万
条为单位分选至 1.5 mL离心管, 4℃保存备用。
1.2.1 FISH鉴定 6VS染色体 以Biotin-16-
dUTP标记的簇毛麦专化重复序列pDVTU383 (中国
农业大学袁文业博士馈赠)为探针 , 参照Fukui等 [7]
的方法进行原位杂交。
1.2.2 C-PRINS鉴定 3B染色体 每张染色体标
本滴加 25 µL PRINS反应混合液(1×DNA聚合酶缓冲
液, 2.5 mmol L−1 MgCl2, 0.12 mmol L−1 dCTP、dGTP
和dATP, 34 µmol L−1 dTTP, 8 µmol L−1荧光素 -
12-dUTP, 2 µmol L−1 (GAA)7引物, 2 µmol L−1 (CTT)7
引物, 1.5 U Taq DNA聚合酶, ddH2O补充至 25 µL),
盖片 , 树胶封片 , 室温静置至胶干后 , 置载片于原
位杂交仪进行C-PRINS, 反应条件为 91℃ 4 min;
91℃ 1 min, 55℃ 1 min, 72℃ 3 min, 循环 25次; 72℃
5 min, 4℃终止反应; 揭去盖片, 加 100 µL反应终止
缓冲液(0.5 mol L−1 NaCl, 0.05 mol L−1 Na2EDTA, pH
8.0), 70℃温育 2 min, 弃多余终止缓冲液, 将载片移
入培养皿 (直径 9 cm)。加 70 µL洗涤缓冲液 (0.1 mol
L−1马来酸, 0.15 mol L−1 NaCl, 0.05% Tween-20, pH
7.5)室温保持 5 min。2次重复。加 70 µL含有PI的洗
涤缓冲液(0.2 µg mL−1)复染 15 min, 倒掉多余液体,
加 8 µL抗褪色剂(DABCO 50 mmol L−1), 盖片, 轻压
去除多余溶液, 树胶封片, 荧光显微镜镜检。
1.2.3 PCR法鉴定 7BL染色体 将流式分选染
色体(40万条) 3 000×g离心 1 min, 沉淀加 20 µL水重
悬用作模板。在 0.2 mL离心管添加反应混合液 (10
mmol L−1 Tris-HCl, 50 mmol L−1 KCl, 2.0 mmol L−1
MgCl2, 0.2 mmol L−1 dNTPs, 1 U Taq DNA聚合酶, 各
0.4 µmol L−1 7BL特异引物对, 模板染色体 2 µL, 总体
积 25 µL), PCR条件反应为 94℃ 10 min, 94℃ 45 s,
55℃/60℃ 60 s, 72℃ 90 s, 72℃ 10 min, 4℃保存; 44
个循环。扩增产物经 3%琼脂糖凝胶 100 V室温电泳 4
h, EB染色, 凝胶成像仪观察。所用 7BL特异SSR 引
物对为Xgwm 611(55℃)和Xgwm 302(60℃)[8]。
2 结果与分析
2.1 6VS染色体的 FISH鉴定
荧光原位杂交(FISH)结果显示, 以簇毛麦 6VS专
化序列pDVTU383 为探针杂交后, 能在具有端体形态
的分选染色体远着丝点处产生一个强烈的信号带和近
着丝点处产生两个较弱的点状信号带 (图 1-a, e), 其
带型与模式图 (图 1-g[9])一致。说明分选染色体为来自
簇毛麦的 6V染色体短臂。而在分别以PI复染(红色)和
以DAPI复染(蓝色)的杂交中, 前者背景噪音较高, 后
者则背景信号较低, 显示了较高的分辨率, 这表明分
选染色体进行FISH鉴定时, 复染染料的选择对杂交信
号分辨率有明显影响, 当复染染料与染色体分选前染
色的染料一致时, 更易获得较高的信号分辨率; 以
DAPI为染料复染, 其使用浓度应在 0.2 µg mL−1以下。
此外, 在两次杂交中还有一些染色体虽带有信号, 但
带型与模式核型有一定差异(图 1-b, c, d, f), 这可能是
染色体的浓缩程度以及分选到载玻片上的取向不同造
成的。而一些没有信号的染色体臂可能是正常小麦染
色体在制备染色体悬浮液过程中产生的染色体片段
(图片未显示)。以上结果表明, 与正常染色体相比
第 1期 郭东伟等: 小麦流式分选染色体的鉴定响 91



图 1 6VS染色体的 FISH鉴定
Fig. 1 Identification of sorted chromosomes 6VS by FISH
a、b: 以PI复染; c~f: 以DAPI复染; g: pDVTU383探针在正常 6V染色体上的荧光原位杂交模式图[9]。
示染色体远着丝点处的一个强烈信号带, 示近着丝点处的两个较弱的信号带。
a, b: images of FISH counterstained with PI; c–f: images of FISH counterstained with DAPI; g: idiogram of FISH for
pDVTU383 probe on normal 6V chromosome. An intensive signal band on tel-centromere region arrowed
by and two faint signals bands on sub-centromere region arrowed by .

(图1-g), 用FISH法进行分选染色体鉴定时, 分选前的
同步化处理并没有对杂交信号产生影响; 且杂交结果
重复性好, 可同时确定分选染色体的纯度。
2.2 3B染色体的 C-PRINS鉴定
以GAA重复序列为引物对分选染色体进行原位
PCR的结果显示, 在大多数分选染色体长臂的近着
丝点部位和端部都产生信号带(图2-c), 与 3B染色体
模式图(双色原位标记[4]) (图 2-a)一致, 说明这些染
色体为 3B染色体; 而并没有看到模式图上着丝点部
位等其他微弱信号带; 这可能与杂交时染色体的浓
缩程度有关 , 当浓缩程度较高时 , 杂交难度增加 ,
分辨率也下降。另外, 还有少量的染色体只在着丝
点部位产生杂交信号(图 2-b), 这些染色体与分选的
其他染色体在形态上有明显差异, 说明分选的 3B染
色体中混杂有少量其他染色体。根据Guo等[5] 的研究
结果, 3B染色体位于流式核型图的最远端, 且独立
成峰, 理论上其分选纯度应当在 98%以上, 那么这
些混杂的染色体很可能是一些染色体簇在分选过程
中由于高压液流的作用力彼此分离而引入的。另外,
据Vrana等[3]的报道, GAA重复序列几乎能够在小麦
所有的 21条染色体上产生不同带型的杂交信号, 所
以即便不是 3B染色体, 也应该有杂交信号。然而,
在本研究中, 一些染色体(图2-d)虽然形态上与 3B接
近, 但没有产生杂交信号, 说明这部分染色体标记
不成功, 标记结果的重复性差, 至于为什么在同一
载玻片上有些染色体能被标记, 而另一些却不能被
标记, 可能与C-PRINS过程中缓冲液挥发造成成分
浓度局部改变或与染色体的浓缩程度有关。
2.3 PCR鉴定 7BL
将分选自假定 7BL峰的染色体沉淀后作为模板,
用 7BL专化的SSR标记Xgwm 302 和Xgwm 611 的
上、下游引物进行PCR扩增, 结果如图 3所示。在泳
道 2的 277 bp和泳道 3的 166 bp处分别扩增出目的
带 , 而以分选自其他几个峰的混合染色体为模板 ,
用Xgwm 611标记的引物对没有扩增出目标带(泳道
1), 说明分选染色体中含有高比例的 7BL染色体。此
外 , 根据 Röder等 [8] 的微卫星图谱 , 标记位点
Xgwm302 和Xgwm611 分别位于 7BL染色体臂的两
端, 以这两个标记的引物能够同时扩增出目标条带
也说明分选的 7BL染色体具有较好的完整性。


图 2 流式分选 3B染色体的 C-PRINS鉴定
Fig. 2 Identification of sorted chromosome 3B by C-PRINS
a: 3B染色体C-PRINS模式图[10-11]; b: 非 3B染色体; c: 3B染色体; d: 无标记信号染色体。
a: idiogram of 3B chromosome labeled by C-PRINS; b: other chromosome with different signals from idiogram;
c: 3B chromosome; d: chromosome without labeled signals.

92 作 物 学 报 第 34卷



图 3 7BL染色体的 PCR鉴定
Fig. 3 Identification of sorted chromosome 7BL by PCR
M: DL2000; 1: 分选自混合峰的染色体为模板, Xgwm 611的引
物对; 2: 分选的 7BL染色体为模板, Xgwm 302的引物对; 3: 分
选的 7BL染色体为模板, Xgwm 611的引物对。
M: DL2000 (Tiangen); 1: products used chromosomes from remaining
peaks expect for putative 7BL peak as template and primers of Xgwm 611
marker; 2: products used chromosome from putative 7BL peak as tem-
plate and primers of Xgwm 302 marker; 3: products used chromosome
from putative 7BL peak as template and primers of Xgwm 611 marker.

3 讨论
染色体分选的纯度和准确性是染色体BAC文库
构建的基础, 常规压片进行染色体鉴定主要涉及的
方法有C-banding、FISH等。分带技术操作简单、成
本低, 曾在早期的细胞遗传学研究中发挥了重要作
用, 尽管至今在一些研究中还有应用, 但由于带型
的多态性和分辨率较低, 已逐渐被随后兴起的FISH
技术所替代, 并被广泛应用于标记细胞核、染色体
[12]、DNA纤维[13]上特定区域和构建遗传、物理图谱
等研究[14]。但流式分选染色体不同于常规压片染色
体, 这些染色体在分选前经过同步化处理, 且悬浮
液中的染色体分选前已经用DNA特异结合的荧光染
料如PI或DAPI进行了染色; 同步化试剂, 及荧光染
料对染色体的结构及杂交结果是否会产生影响, 这
些问题亟待阐明。在本研究中, 我们以簇毛麦的特
异重复序列pDVTU383 为探针, 对分选的 6VS染色
体进行了鉴定, 结果表明, 探针与目标染色体特异
区段结合产生的信号带型, 与常规压片得到的模式
杂交带型相似, 说明同步化试剂没有对染色体结构
产生可见影响; 而在以PI复染和以DAPI复染的不同
杂交中 , 尽管信号带型一致 , 杂交结果重现性高 ,
但以DAPI复染得到的杂交结果显示了更高的分辨
率, 说明分选前的荧光染色对杂交结果的分辨率有
影响, 复染染料与分选前染色体染色所用染料一致
有利于杂交结果的检测。FISH检测的灵敏度常受到
探针的长度, 性质, 与靶位点的结合能力和信号的
放大程度等因素的影响[15]。一般使用多拷贝重复序
列探针, 不经过信号放大时可检测的中期染色体靶
位点最小长度在 10 kb左右[16]; 尽管有报道采用特
殊的FISH杂交方法以及经过信号放大 , 利用长度
750 bp的单拷贝探针可检测出 1~3 kb的目标区段,
但增加了操作的复杂性和时间。基于以上缺点, 一
些研究将PCR和C-PRINS引入流式分选染色体的鉴
定[3,5,10-11]。FISH鉴定需要 2~3 个工作日, 而PCR鉴
定可在 2~3 h内完成, 利用该法我们对分选自小麦双
端体的 7BL染色体进行了成功鉴定, 显示了快速、
重复性好的特点, 利用已有的小麦微卫星图谱信息
[8], 则鉴定会更加方便高效。然而需要指出, PCR方法
需要较多的分选染色体, 本研究中模板染色体被加
至 4 万条, 约 20 ng, 而分选这些染色体约需要 1~2
个工作日, 虽然有报道用 6 000 条分选染色体也可
进行PCR鉴定 [3], 但相对于FISH的数百条仍要多许
多。同时PCR鉴定不能在染色体上形成特异的信号
带, 无法鉴定分选染色体的纯度。因此, 本研究认为,
PCR法在初步确定流式核型的染色体峰组成上作用
明显, 因为此时分选染色体主要来自混和染色体峰,
分选的速度(200P/S)比分选单种染色体(15P/S)快 10
倍以上。
C-PRINS的原理是将一段没有标记的寡核苷酸
退火结合到互补的染色体位点上, 然后在DNA聚合
酶的引导下, 把反应体系中用生物素、荧光染料或
辅助抗原标记过的核苷酸连接到引物DNA片段上 ,
使之延伸然后能进行荧光信号的直接或间接检测。
与常规的荧光原位杂交相比, 因为PRINS使用的引
物没经过标记, 因此它们与染色体的非特异性结合
不会导致背景信号的增加, 使反应时间更短, 更灵
敏, 对染色体的损害也较小[10-11]。
Mukai等[17] 用C-PRINS法首次建立了黑麦 45S
和 5S核糖体RNA基因的物理图谱。反应设计了 20
个循环, 以荧光标记的抗体检测杂交片段。比较发
现C-PRINS比FISH对序列的变化更加敏感, 可以用
来检测不同 5S核糖体RNA基因连锁群的特异位点。
通过C-PINS检测单拷贝序列, 使片段最小可以达到
1 kb, 这在PRINS和FISH中是检测不到的[18]。本文以
GAA重复序列为引物对分选的 3B染色体进行了直
接标记 , 标记信号显示了与先前研究类似的带型 ,
进一步说明了这种方法在高拷贝重复序列定位中的
第 1期 郭东伟等: 小麦流式分选染色体的鉴定响 93

可行性。与FISH相比这种方法不需要标记探针, 且
RNA酶处理、前固定、变性等FISH步骤都可以被省
略 , 因此整个操作快速而简单。此外 , 研究发现
C-PRINS标记的成功率受很多因素的干扰, 如盖玻
片的大小、分选液的成分和pH值, 染色体制片的干
燥时间, 引物浓度等, 其重复性较差。我们认为, 分
选液中加入 5%的蔗糖, 并将染色体悬浮液pH值调
至 9.0 有利于保持染色体的形态; 染色体制片干燥的
时间过短 (1~2 d) 产生的信号较弱, 过长(20 d以上)则
背景噪音过高, 一般应以7 d为宜, 与Kubalakova 等[11]
的报道一致; 盖玻片的大小应与反应缓冲液形成的液
滴面积相当, 过大会产生气泡影响封片效果, 过小则
缓冲液会部分损失, 造成反应总体积变化; 在数次标
记过程中, 产生信号的结果总是出现在引物浓度较小
的实验中, 至于为什么会出现这种现象以及引物浓度
应该稀释到何种程度, 目前还无从解释。反应缓冲液
挥发是造成实验结果重复性差的主要原因, 因此, 防
止反应过程中缓冲液挥发是成功标记的关键。
由于C-PRINS能够提高染色体标记的分辨率, 进
行单拷贝序列的染色体定位, 而且操作简单快速, 对
染色体损伤小; 如果将这种方法和前人报道的液体
原位杂交技术相结合[19], 即在离心管中以预纯化的
染色体为模板, 单拷贝染色体特异序列为引物执行
C-PRINS, 不仅能有效解决反应缓冲液的挥发问题,
还能够对悬浮液中特定的染色体进行荧光标记, 再
对反应产物进行流式分选, 则有可能将标记的染色
体直接分选出来, 此时用流式细胞仪检测和分选标记
染色体不同于常规以DNA含量差异为基础的检测, 前
者检测的是“有没有”的问题, 而后者检测的是“多与
少”的问题, 二者有质的区别, 因此分辨率更高。这
对于植物染色体的流式分选技术将是质的改变。随
着生物信息学技术的发展, 能够公开用于染色体特
异探针设计的序列信息相当丰富, 仅 2004 年, Qi
等[20]在对 16 099个EST序列染色体作图时就发现其中
有 14 个Unigenes具有染色体或染色体组特异性, 有 6
个EST序列只在同一条染色体内出现多次重复。已报
道并进行了染色体定位的小麦抗条锈基因就有 40 多
个, 这些已知功能基因的位点涵盖了小麦的所有 21
条染色体, 且多数具有染色体特异性。根据这些序
列设计引物进行C-PRINS则能将染色体特异标记。一
般在常规PCR中得到 1~2 kb的扩增产物是很普遍的,
如引物长度达到 24 bp时, 用常规PCR方法甚至能得到
5 kb左右的产物。尽管以小于 10 kb的探针进行标准
FISH, 很难在荧光显微镜下看到杂交信号, 但流式细
胞仪具有通过调节激光的输出功率, 放大和检测微弱
荧光信号的功能, 所以即使长度在 1 kb的探针, 也足
以检出。有报道显示利用流式细胞仪可检测小至 0.125
kb的DNA片段[21]。目前, 本课题组已创建了一套有效
的小麦染色体预纯化方法 [22], 而相应的染色体
C-PRINS液体标记法也已进入实验探索阶段。
4 结论
PCR、FISH和 C-PRINS法都能实现对分选染色
体的有效鉴定。其中 PCR法更适合于流式核型图中
各峰染色体组成的快速鉴定, 可为进一步用 FISH和
C-PRINS 法进行分选染色体纯度鉴定时的探针选择
提供参考。虽然 FISH 和 C-PRINS 都能用于分选染
色体纯度鉴定, 但 C-PRINS 法更加简单快速; 如果
将液体原位杂交与 C-PRINS相结合则有可能为染色
体分选以及分选染色体的鉴定开创新的途径。
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