全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2012, 38(7): 1167−1177 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由山东省花生良种产业化工程项目和现代农业产业技术体系建设项目(CAIS-14)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 万勇善, E-mail: yswan@sdau.edu.cn, Tel: 0538-8241540; 刘风珍, E-mail: liufz@sdau.edu.cn, Tel:
0538-8241540
第一作者联系方式: E-mail: dongjinyu86@163.com
Received(收稿日期): 2011-12-29; Accepted(接受日期): 2012-04-15; Published online(网络出版日期): 2012-05-11.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20120511.1540.020.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2012.01167
花生 Δ9-硬脂酰-ACP 脱氢酶基因(SAD)的序列分析
东金玉 万勇善* 刘风珍*
山东农业大学农学院 / 作物生物学国家重点实验室 / 山东省作物生物学重点实验室, 山东泰安 271018
摘 要: 利用同源克隆技术获得花生区组二倍体野生种 A. duranensis 和 A. ipaensis 的 Δ9-硬脂酰-ACP 脱氢酶基因
SAD (命名为 gSAD-A和 gSAD-B)及 3个栽培品种的 SAD, 每个栽培品种有 2个 SAD (命名为 gSAD-1和 gSAD-2)。同
时获得丰花 2 号 SAD 的两条全长 cDNA (命名为 FhrSAD-1 和 FhrSAD-2)。丰花 2 号的 FhgSAD-1 和 FhgSAD-2 均含
有 2个内含子 , 二者同源性 97.5%, 共有 69个变异位点, 其中 62个是 SNP位点、6个特异性酶切位点。FhrSAD-1
和 FhrSAD-2 间核苷酸序列同源性 98.6%, 其中编码区序列同源性 98.9%, 共有 12 个变异位点, 编码的 Ah-SAD2 氨
基酸序列与 Ah-SAD1相比在 N端的 17PSSSSSSSSSSFSL30丝氨酸聚集区少一个丝氨酸。gSAD-1和 gSAD-A同源性为
99.9%, 存在 4个 SNP位点; gSAD-2和 gSAD-B同源性为 100%。推测 gSAD-1和 gSAD-2分别来自花生栽培品种的 A、
B 2个染色体组。研究明确了花生不同染色体组 SAD的序列特征, 为进一步探讨 SAD的表达及其在控制花生籽仁脂
肪酸组分中的作用提供了重要的参考。
关键词: 花生; 硬脂酰-ACP脱氢酶(SAD); 序列分析
Sequence Analysis of Δ9-Stearoyl-ACP Desaturase Gene (SAD) in Peanut
DONG Jin-Yu, WAN Yong-Shan*, and LIU Feng-Zhen*
State Key Laboratory of Crop Biology / Shandong Key Laboratory of Crop Biology / Agronomy College of Shandong Agricultural University, Tai’an
271018, China
Abstract: The peanut (Arachis hypogaea L.) cultivars are an allotetraploid consisting of A and B genomes. Δ9-Stearoyl-ACP de-
saturase (SAD) is a key enzyme that catalyzes the conversion of stearoyl-ACP to oleoyl-ACP, and finally controls the content of
oleic acid as well as the proportion of saturated to unsaturated fatty acids. By using the primers based on the peanut cDNA se-
quence of SAD (AF172728), genomic DNAs were amplified from the wild diploid species A. duranensis and A. ipaensis, and
from the cultivated accessions of peanut Fenghua 2, Shanhua 7 and Puyangdatuoyang, respectively. Two isoforms of the genomic
SAD were identified and named as FhgSAD-1 and FhgSAD-2 from the cultivated peanut accessions. In addition, two isoforms of
SAD cDNA were isolated and named as FhrSAD-1 and FhrSAD-2 from Fenghua 2. Comparison of the genomic sequences with
cDNAs revealed that there were two introns in the SAD genomic sequences. Sequences alignment showed that the similarity be-
tween FhgSAD-1 and FhgSAD-2 in nucleotide level was over 97.5%, with 69 different sites in total, including 62 SNP sites and
six variation sites of endonuclease recognition. The cDNA sequence similarity between FhrSAD-1 and FhrSAD-2 was 98.6%,
with 98.9% nucleotides identity in coding region. Deduced amino acid sequences revealed that only one difference occurred in
serine gathering area of 17PSSSSSSSSSSFSL30. gSAD-1 shared 99.9% nucleotide sequence homology with gSAD-A, while
gSAD-2 was the same as gSAD-B. According to the phylogenetic tree, it is assumed that gSAD-1 and gSAD-2 may come from the
A and B genome, respectively. The results revealed the characteristics of SAD sequences from different genomes of peanut, and
provided important basis for exploring gene expression regulation and fatty acid component improvement in peanut seeds.
Keywords: Peanut; Stearoyl-ACP desaturase (SAD); Sequence analysis
花生是我国重要的油料和经济作物之一, 总产
居世界首位。花生籽仁贮藏油脂中 80%左右为不饱
和脂肪酸, 饱和脂肪酸占 20%左右[1-2]。植物不饱和
脂肪酸组成很大程度上是受到脂肪酸脱氢酶种类和
1168 作 物 学 报 第 38卷
数量的调控 , 而 Δ9-硬脂酰 -ACP 脱氢酶 (stearoyl-
ACP desaturase, SAD)催化硬脂酰-ACP脱饱和而在
脂肪酸链的 C9与 C10间引入一个双键形成油酰-ACP
的反应, 是不饱和脂肪酸合成代谢的关键酶[3-4]。因此,
SAD直接决定了植物油脂中的不饱和脂肪酸的总量
以及饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸的比例 [5-6]。目前,
在大豆 [7-8]、拟南芥 [9]等很多植物中已经克隆到
SAD[10-12], 经研究证实在大多数高等植物中, SAD呈
现组织特异性表达, 且在发育的种子中的表达量比
其他组织都高[9,13-15]。Liu 等[16]通过 RNA 干涉使棉
花的 SAD 沉默, 硬脂酸含量从正常的 20%上升到
40%, 同时还伴随棉籽油中其他 3 种主要脂肪酸棕
榈酸、油酸和亚油酸的减少。Wendy等[17]将土豆 SAD
转入烟草, 发现叶片和种子的脂肪酸组分发生了变
化, 不饱和脂肪酸含量增加。Jung 等(2000 年)首先
在 GenBank 中注册了花生 SAD 的全长 cDNA 序列
(AF172728), 关于栽培品种不同染色体组 SAD 序列
特征的研究未见报道。
本研究目的是通过对花生 3 个栽培品种和 2 个
野生种 SAD的 cDNA和基因组 DNA序列结构分析,
比较 A、B染色体组的 SAD核苷酸序列和编码的氨
基酸序列差异, 及花生与其他油料作物的系统发育
关系, 为进一步利用 SAD 改善油料作物中脂肪酸组
分提供重要的参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
花生属花生区组二倍体野生种 A. duranensis和
A. ipaensis 及栽培品种濮阳大拖秧由中国农业科学
院油料作物研究所姜慧芳研究员提供; 栽培品种丰
花 2号、山花 7号由山东农业大学选育。
TIANgel 胶回收试剂盒购自天根生化科技有限
公司; pEASY-T1 Vector, 大肠杆菌菌株 DH5α, Trizol
Reagent Kit, EasyScript First-Strand cDNA Synthesis
Kit 购自北京全式金生物技术有限公司, 其他试剂
均为进口或国产分析纯。引物由上海生物工程有限
公司合成, 测序工作由北京六合华大基因科技有限
公司完成。
1.2 DNA、RNA提取及 cDNA链的合成
分别取花生栽培品种和野生种幼嫩花生叶片, 用
CTAB法提取总 DNA。丰花 2号花生果针入土约 35 d
后, 取幼果, 液氮速冻, –70℃保存, 参照 Trizol Re-
agent Kit说明书提取其总 RNA。以 2 μL RNA为模板、
以 Oligo(dT)为引物 , 按照 EasyScript First-Strand
cDNA Synthesis Kit描述的方法, 合成 cDNA第一链。
1.3 花生 SAD的 PCR扩增
采用报道的花生 SAD的 cDNA序列(GenBank登
录号为 AF172728)设计 1 对特异性引物, 上游引物 F:
5′-GCAACACGAAAAATGGCTCT-3′; 下游引物 R:
5′-GGACACCACACCGAAAACAT-3′。以花生栽培品
种丰花 2 号总 RNA 经反转录生成的 cDNA 第一链为
模板, 用引物 F 和 R 扩增 SAD 的 cDNA 序列。PCR
程序为 94℃ 5 min; 94℃ 30 s, 58℃ 30 s, 72℃ 1.5 min,
35个循环; 72℃ 10 min。分别以 3个栽培品种和 2个
野生种基因组 DNA 为模板, 用引物 F和 R扩增 SAD
的 DNA 序列。扩增程序为 94℃ 5 min; 94℃ 30 s,
55℃ 30 s, 72℃ 3 min, 35个循环; 72℃ 10 min。
1.4 PCR产物的克隆测序和序列分析
PCR 扩增产物经 10 g L–1 琼脂糖凝胶电泳后,
按照 DNA 胶回收试剂盒说明书回收, 再与 pEASY-
T1 克隆载体连接, 转化至大肠杆菌 DH5α 中进行抗
卡那霉素筛选。挑选白色单菌落, PCR检测鉴定后送
北京六合华大基因科技有限公司测序, 每个品种选
6~10 个克隆。采用 Blast 程序(http://www.ncbi.nlm.
nih.gov/blast)分析序列的同源性, 用 DNAMAN软件
进行序列翻译和多重比对。
1.5 生物信息学分析
利用 ClastalX 软件结合 PHYLIP 软件, 采用最
大简约法, 以来自栽培品种和野生种 SAD 的 DNA
序列构建分子进化树。采用 BootStrap 1000 检验分
子系统树的置信度。利用软件 ClustalW对包括花生
在内的 10 种主要油料作物 SAD 编码的氨基酸序列
进行聚类分析。用下列在线软件对氨基酸序列进行
结构特征分析 : 蛋白等电点、分子量等分析软件
(http://www.expasy.ch/tools/protparam.html), 蛋白二
级结构分析软件 (http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_
automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html), 蛋白保守
结构域分析软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/
cdd/wrpsb.cgi), 跨膜结构分析软件(http://www.cbs.dtu.
dk/services/TMHMM/), 亚细胞定位软件 (http://www.
cbs.dtu.dk/services/TargetP), 信号肽预测软件 (http://
www.cbs.dtu.dk/services/SignalP).
2 结果与分析
2.1 花生 SAD的克隆
用引物 F 和 R 对丰花 2 号 cDNA 进行 PCR 扩
第 7期 东金玉等: 花生 Δ9-硬脂酰-ACP脱氢酶基因(SAD)的序列分析 1169
增, 琼脂糖凝胶电泳检测获得约 1.5 kb特异性条带,
与预期大小相符。从琼脂糖凝胶回收的 PCR产物与
pEASY-T1 克隆载体连接 , 重组子转化大肠杆菌
DH5α, 经卡那霉素筛选、PCR检测鉴定获得含有目
的片段的阳性克隆 , 测序结果表明 , 存在 2个 SAD
基因, 分别命名为 FhrSAD-1和 FhrSAD-2。
以 3 个栽培品种和 2 个野生种的 DNA 为模板,
用引物 F和 R对进行 PCR扩增, 获得约 3.5 kb的片
段, 与 pEASY-T1载体连接后, 克隆测序。结果表明,
3个栽培品种均得到 2条不同的序列, 命名为 gSAD-1
和 gSAD-2 (表 1); 2个野生种分别得到一条序列, 由
A. duranensis 克隆的序列命名为 gSAD-A, 由 A.
ipaensis克隆的序列命名为 gSAD-B。
2.2 丰花 2号 SAD核苷酸序列分析
2.2.1 cDNA 序列分析 由丰花 2 号扩增得到的
cDNA序列 FhrSAD-1和 FhrSAD-2同源性为 98.6%,
与发表序列同源性分别为 97.6%和 96.7%。克隆得到
的两序列都具有开放阅读框 , FhrSAD-1 全长 1 479
bp, 包含 1 221 bp的编码区和 246 bp 的 3′UTR;
FhrSAD-2全长 1 480 bp, 包含 1 218 bp的编码区和
250 bp的 3′UTR; 起始密码子均位于 13 bp处, 终止
密码子分别位于 1 231 bp和 1 228 bp处; ATG起始
密码子附近符合 Kozak 规则(AXXATGG)(图 1)。
FhrSAD-1 和 FhrSAD-2 的编码区核苷酸序列同源性
98.9%, 共有 12个变异位点, 其中 11个为 SNP位点
(图 1)。
表 1 供试的 3 个花生栽培品种及其对应的序列名
Table 1 Peanut cultivar names and the corresponding DNA sequences
亚种名
Subspecies
品种类型
Variety type
品种名
Accession
DNA序列名
DNA sequence name
珍珠豆型 var. vulgaris 丰花 2号 Fenghua 2 FhgSAD-1, FhgSAD-2 疏枝亚种 ssp. fastigiata
中间型 Irregular type 山花 7号 Shanhua 7 ShgSAD-1, ShgSAD-2
密枝亚种 ssp. hypogaea 普通型 var. hypogaea 濮阳大拖秧 Puyangdatuoyang PygSAD-1, PygSAD-2
2.2.2 DNA序列分析 由丰花 2号扩增得到的 2
条 DNA 序列 FhgSAD-1 和 FhgSAD-2 长度分别为
3 503 bp和 3 510 bp, 同源性 97.5%。Splign程序分
析表明, FhrSAD-1和 FhrSAD-2分别与 FhgSAD-1和
FhgSAD-2 外显子部分完全一致。FhgSAD-1 和
FhgSAD-2均含有 2个内含子, FhgSAD-1内含子位于
168~1 689、2 195~2 695 bp处, 大小分别为 1 522 bp
和 501 bp; FhgSAD-2内含子位于 165~1 695、2 201~
2 699 bp处, 大小分别为 1 531 bp和 499 bp。2个序
列所有内含子的剪切方式均符合GT-AG规则(图 1)。
FhgSAD-1和 FhgSAD-2内含子核苷酸序列差异
分析表明, 2个内含子分别存在 36和 17个差异位点,
其中 34个和 14个为 SNP (图 1)。全序列共有 69个
变异位点, 其中 62个 SNP, 占 90.0%。
用 DNAMAN 软件对序列分析发现, FhgSAD-1
具有 FhgSAD-2没有的 Bsm I、Nde I、Apa I和 Hind
III 4 种限制性酶的识别位点 , 而 FhgSAD-2 具有
FhgSAD-1没有的 Age I和 BstE II两种限制性酶的识
别位点(图 2)。
2.3 花生 SAD 核苷酸序列推导的氨基酸序列分
析
由 FhrSAD-1和 FhrSAD-2推导出编码蛋白的氨
基酸序列, 分别命名为 Ah-SAD1和 Ah-SAD2。二者
氨基酸序列同源性 99.8%, Ah-SAD1全长 406个氨基
酸, Ah-SAD2全长 405个氨基酸, Ah-SAD2在 N端
比 Ah-SAD1少一个丝氨酸。将参考的该基因编码蛋
白的氨基酸序列命名为 Ah-SAD3, Ah-SAD3 全长
409 个氨基酸。Ah-SAD1 和 Ah-SAD3 序列同源性
97.6%, 存在 9个氨基酸差异(图 5)。
以 Ah-SAD1和 Ah-SAD2两条序列的生物信息
学分析预测 Ah-SAD1 的理论分子量和等电点 ,
MW=46.229 kD, pI 6.43; Ah-SAD2的理论分子量和
等电点为 MW=46.31 kD, pI 6.43。二级结构分析表
明 Ah-SAD1 含 50.62%的 α 螺旋, 8.89%的延伸串,
5.43%的 β转角, 35.06%的不规则卷曲; Ah-SAD2含
50.74%的 α 螺旋, 9.16%的延伸串, 5.45%的 β 转角,
34.65%的不规则卷曲。Ah-SAD1 和 Ah-SAD2 蛋白
不存在明显的跨膜结构特征 , 为可溶性蛋白。
Ah-SAD1 和 Ah-SAD2 定位于叶绿体的概率为
0.950。
通过 NCBI的 protein blast功能、CD-Search 工
具及 Cn3D 4.1 软件进行蛋白质保守结构分析表明:
Ah-SAD1 和 Ah-SAD2 编码的多肽的保守性基本一
致, 都是以同型二聚体形式存在, 均含一个属于酰
1170 作 物 学 报 第 38卷
第 7期 东金玉等: 花生 Δ9-硬脂酰-ACP脱氢酶基因(SAD)的序列分析 1171
图 1 丰花 2 号 2 条 SAD 核苷酸序列比对分析
Fig. 1 Alignment of two genomic nucleotide sequences of SAD from Fenghua 2
下画线标注外显子部分; “· ”表示核苷酸缺失; 黑色阴影标注起始密码子 ATG和终止密码子 TAA; 灰色阴影标注 SNP位点。
Exon is underlined; “·”indicates nucleotide deletion; initiator codon ATG and the stop codon TAA are shaded by dark blocks, the sites of SNP
are shaded by gray.
基 ACP 脱氢酶家族和属于类铁蛋白家族的保守结
构域。位于 SAD保守区的 4个螺旋结构中埋藏着一
个由 2 个铁原子组成的二铁中心, Fe 原子的 6 个配
基即是四螺旋束的 6个氨基酸的侧链或其基团 : 其
中一个铁原子的配基是 E239、H285, 另一个铁的配
基是 E148、H189, 而 E186、E282 是 2 个铁原子的
桥连配基。两铁原子之间通过一个氧原子相联, 形
成非常对称的 Fe-O-Fe二铁氧簇结构。SAD每个亚
基表面有 33个多肽连接位点。推断的底物结合位点
包括 14个氨基酸的侧链或其基团(图 3 和图 5)。此
二铁中心及四螺旋束的氨基酸侧链形成 SAD 活性
中心。
2.4 3个栽培品种和 2个野生种间 SAD核苷酸序
列分析
以来自 3个栽培品种的 FhgSAD-1、FhgSAD-2、
ShgSAD-1、ShgSAD-2、PygSAD-1、PygSAD-2 以及
来自野生种的 gSAD-A和 gSAD-B构建的进化树表明,
FhgSAD-1、ShgSAD-1、PygSAD-1和 gSAD-A聚为一
组, FhgSAD-2、ShgSAD-2、PygSAD-2和 gSAD-B聚
为一组(图 4)。序列比对分析显示 , FhgSAD-1 和
ShgSAD-1 序列完全相同, FhgSAD-2、ShgSAD-2、
PygSAD-2 和 gSAD-B 完全相同。而 FhgSAD-1、
PygSAD-1 和 gSAD-A 共存在 4 个碱基差异, 均在内
含子部分, 其中在第 2 319、第 2 622个碱基处属于
转换, 第 310个碱基处属于颠换, 第 3 377个碱基处
属于缺失(表 2)。
2.5 花生与其他油料作物 SAD 编码的氨基酸序
列分析
将 Ah-SAD1、Ah-SAD2、Ah-SAD3 与 NCBI
蛋白数据库中注册的其他油料作物 SAD编码的氨基
酸序列比对, 结果显示花生 Ah-SAD1与大豆、麻风
树、芝麻、油茶、向日葵、甘蓝型油菜、拟南芥、
1172 作 物 学 报 第 38卷
图 2 FhgSAD-1 和 FhgSAD-2 部分核苷酸序列比对分析
Fig. 2 Alignment of partial genomic nucleotide sequences of FhgSAD-1 and FhgSAD-2
a: 黑色阴影所示序列是 Bsm I可识别的核苷酸序列; 灰色阴影所示序列是 Bsm I不能识别的核苷酸序列; b: 黑色阴影所示序列是 Nde I
可识别的核苷酸序列; 灰色阴影所示序列是 Nde I不能识别的核苷酸序列; c: 黑色阴影所示序列是 Apa I可识别的核苷酸序列; 灰色阴
影所示序列是 Apa I不能识别的核苷酸序列; d: 黑色阴影所示序列是 Hind III可识别的核苷酸序列; 灰色阴影所示序列是 Hind III不
能识别的核苷酸序列; e: 黑色阴影所示序列是 Age I可识别的核苷酸序列; 灰色阴影所示序列是 Age I不能识别的核苷酸序列; f: 黑色
阴影所示序列是 BstE II可识别的核苷酸序列; 灰色阴影所示序列是 BstE II不能识别的核苷酸序列。
a: endonuclease recognition site of Bsm I is shaded by dark blocks, the unrecognitive nucleotides by gray; b: endonuclease recognition site of
Nde I is shaded by dark blocks, the unrecognitive nucleotides by pale; c: endonuclease recognition site of Apa I is shaded by dark blocks, the
unrecognitive nucleotides by gray; d: endonuclease recognition site of Hind III is shaded by dark blocks, the unrecognitive nucleotides by
gray; e: endonuclease recognition site of Age I is shaded by dark blocks, the unrecognitive nucleotides by gray; f: endonuclease recognition
site of BstE II is shaded by dark blocks, the unrecognitive nucleotides by gray.
图 3 花生 Ah-SAD 理论三维结构
Fig. 3 Theoretical three-dimensional structure of Ah-SAD
a: SAD保守区的二铁中心; b: Fe原子的 6个配基; c: 亚基表面的
多肽连接位点; d: 推断的底物结合位点。
a: diiron center on conserved domain of SAD; b: six bidentate
ligand of Fe; c: polypeptide binding site; d: putative substrate
binding pocket.
油橄榄和蓖麻间 SAD 氨基酸序列同源性依次为
88.0%、85.2%、83.0%、82.8%、80.7%、80.2%、77.0%、
图 4 花生栽培品种和野生种 SAD 分子进化树
Fig. 4 Phylogenetic tree based on the nucleotide sequence of
SAD genes from the cultivated peanut and wild diploid
75.8%和 63.6%。SAD 在不同物种间的同源性很高,
所有 SAD的核心区段几乎完全相同, 仅在起始密码
子和终止密码子附近有较大的差异(图 5)。聚类分析
表明, 花生 SAD 与大豆的亲缘关系最近, 并与麻风
树、油茶和芝麻聚为一类, 又与向日葵聚为一大类;
油菜、拟南芥聚为一类, 油橄榄和蓖麻聚为一类。
这与各物种在经典分类学上的地位相一致(图 6)。
第 7期 东金玉等: 花生 Δ9-硬脂酰-ACP脱氢酶基因(SAD)的序列分析 1173
表 2 不同花生品种中 SAD 多态性位点
Table 2 Polymorphism sites of SAD in different peanut
cultivars
碱基位置
Nucleotide site
FhgSAD-1 ShgSAD-1 PygSAD-1 gSAD-A
310 A A T T
2319 G G A A
2622 G G G A
3377 T T — —
3 讨论
SAD 是高等植物中脂肪酸合成代谢的关键酶,
目前已从多种植物中分离获得 SAD的 cDNA。其中
油菜、芝麻、油茶、麻风树等大多数油料作物 SAD
基因的 ORF长 1 173~1 197 bp, 编码 390~398个氨
基酸[10,18-19]。本研究获得的 2个花生 SAD基因全长
分别为 3 503 bp、3 510 bp, 均包括 3个外显子和 2
1174 作 物 学 报 第 38卷
图 5 花生与主要油料作物 SAD 编码的氨基酸序列比较
Fig. 5 Alignment of SAD amino acid sequences of peanut and other major oil plants
Ah: 花生; Gm: 大豆; Si: 芝麻; Co: 油茶; Jc: 麻风树; Ha: 向日葵; At: 拟南芥; Bn: 甘蓝型油菜; Oe: 油橄榄; Rc: 蓖麻。“—”表示
该处氨基酸残基缺失; 灰色阴影标注 Ah-SAD1和 Ah-SAD3的氨基酸差异; 黑色阴影标注 14个底物结合位点; “*”表示该处氨基酸
完全相同。
Ah: Arachis hypogae; Gm: Glycine max; Si: Sesamum indicum; Co: Camellia oleifera; Jc: Jatropha curcas; At: Arabidopsis thaliana; Bn:
Brassica napus; Ha: Helianthus annuus; Oe: Olea europae; Rc: Ricinus communis. “—” represents absences of amino acids residual, the
difference amino acids between Ah-SAD1 and Ah-SAD3 are shaded by gray blocks; the sites of substrate binding pocket variations by dark.
“*” indicates that the amino acids are identical.
第 7期 东金玉等: 花生 Δ9-硬脂酰-ACP脱氢酶基因(SAD)的序列分析 1175
图 6 花生与 9 种主要油料作物 SAD 氨基酸序列的聚类分析
Fig. 6 Clustering of Ah-SAD and other SAD of nine oil plants based on amino acid sequence
Ah: 花生; Gm: 大豆; Si: 芝麻; Co: 油茶; Jc: 麻风树; Ha: 向日葵; At: 拟南芥; Bn: 甘蓝型油菜; Oe: 油橄榄; Rc: 蓖麻。
Ah: Arachis hypogae; Gm: Glycine max; Si: Sesamum indicum; Co: Camellia oleifera; Jc: Jatropha curcas; At: Arabidopsis thaliana;
Bn: Brassica napus; Ha: Helianthus annuus; Oe: Olea europae; Rc: Ricinus communis.
个内含子, 其编码区长 1 221 bp、1 218 bp, 分别编
码 406个、405个氨基酸。通过与其他植物 SAD氨
基酸序列比对可以发现, 花生 SAD氨基酸序列N端
存在一段特有的 17PSSSSSSSSSSFSL30 丝氨酸聚集
区, 并且 Ah-SAD2 比 Ah-SAD1 少一个丝氨酸。董
胜张等[20]和 Sappington等[21]研究发现大多数昆虫的
卵黄原蛋白(Vg)氨基酸序列中存在一段丝氨酸聚集
域, 通常位于进化速率较高的区域, 可能是某些激
酶(如磷酸化激酶)的底物。对于花生 SAD非保守的
丝氨酸聚集区的作用有待进一步研究。
Lindqvist 等[22]用 X-射线晶体衍射分析描述了
蓖麻 SAD的晶体结构, 张党权等[19]通过同源建模法
获得油茶 SAD 的理论三维结构, 均为同型二聚体,
亚基含有 11个 α-螺旋, 其中 9个 α-螺旋形成一个反
平行螺旋束, 该螺旋束上的 4 个 α-螺旋与 Fe2+共同
形成 SAD 的活性中心。本研究获得的花生 SAD 存
在同型二聚体亚基结合位点和底物作用位点, 具有
植物 SAD的空间结构特征。这为进一步从蛋白水平
研究花生 SAD的功能奠定了基础。
花生栽培种(Arachis hypogaea L.)是异源四倍体
(AABB)。花生区组除了栽培种和 A. monticola是四
倍体外, 其他都是二倍体野生种[23-24]。一般认为花
生栽培种是由 2个具有不同染色体组的二倍体野生
种通过自然杂交形成的杂种再经一次性加倍事件进
化形成[25]。探寻花生栽培种的二倍体野生种亲本一
直是有关学者的研究热点, Moretzsohn 等[26]通过微
卫星分析, Seijo等[27]利用 GISH技术, Milla等[28]采
用 AFLP方法均推断, A组野生种 A. duranensis和 B
组野生种 A. ipaensis为栽培种 A、B 2个染色体组的
供体。Fávero 等[29]成功构建了由二倍体种 A. dura-
nensis和 A. ipaensis组成的双二倍体, 并利用所获得
的双二倍体分别与栽培种几大植物学类型种质杂交,
得到了杂种后代植株, 进一步证明 A. duranensis 和
A. ipaensis可能是栽培种的祖先。Jung等[30]通过对
栽培种和野生种 Δ12-脂肪酸脱氢酶基因序列的研究,
发现 A. duranensis和 A. ipaensis与栽培种的 2个非
等位基因 AhFAD2A 和 AhFAD2B 分别有相同的基因
序列, 从而推断这 2个野生种最有可能是花生栽培
种的二倍体祖先种。本研究获得的 gSAD-1 和
gSAD-2同源性 97.5%。利用栽培品种和野生种 SAD
的核酸序列构建的系统进化树表明, 来自 3个栽培
品种 gSAD-1 序列与野生种 A. duranensis (AA)的
gSAD-A聚在一组, gSAD-2 序列与 A. ipaensis (BB)
的 SAD-B序列聚在一组。来源于 A染色体组的 4条
DNA 序列 (FhgSAD-1、 ShgSAD-1、PygSAD-1 和
gSAD-A)存在等位变异 , 但碱基差异位点均出现在
内含子区域, 并未导致编码氨基酸序列的改变。来
自 B染色体组的 SAD非常保守, 3个栽培品种 gSAD-
2序列与野生种 A. ipaensis (BB)的 gSAD-B序列完全
相同。推断栽培品种 gSAD-1和 gSAD-2分别来自花
生 A、B染色体组。
4 结论
利用同源克隆技术获得了花生区组 2 个二倍体
野生种和 3 个栽培品种的 SAD, 每个栽培品种有 2
个 SAD。同时获得丰花 2号 SAD的 2条全长 cDNA。
丰花 2号的 FhgSAD-1和 FhgSAD-2均含有 2个内含
子, 二者变异位点丰富。FhrSAD-1 和 FhrSAD-2 间
核苷酸序列共有 12个变异位点 , 编码的 Ah-SAD2
氨基酸序列与 Ah-SAD1 相比在 N 端的 17PSSSSS
SSSSSFSL30 丝氨酸聚集区少一个丝氨酸。gSAD-1
和 gSAD-A同源性为 99.9%, gSAD-2和 gSAD-B同源
1176 作 物 学 报 第 38卷
性为 100%。推测 gSAD-1 和 gSAD-2 分别来自花生
栽培品种的 A、B 2个染色体组。
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