全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2010, 36(9): 1585−1595 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由北京市自然科学基金项目(6103025)，国家食用豆产业技术体系建设项目(nycytx-18)和食用豆行业科技专项(nyhyzx07-017)资助。
*
通讯作者(Corresponding author): 程须珍, E-mail: chengxz@caas.net.cn, Tel: 010-62189159
Received(收稿日期): 2010-03-16; Accepted(接受日期): 2010-04-23.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2010.01585
Ceratotropis亚属基于 SSR标记和 ITS序列的分类与进化分析
马燕玲 程须珍* 王丽侠 王素华 赵 丹
中国农业科学院作物科学研究所, 北京 100081
摘 要: 利用 SSR分子标记和 ITS序列分析研究 Ceratotropis亚属已鉴定的 93份种质以及 Vigna亚属的 2份地方种
和 Glycine属的 1份野生种, 共 8个种及亚种的 96份材料的遗传差异。初步筛选出分布于 11个连锁群(linkage group,
LG)的 74 对小豆引物及 14 黒对 吉豆引物和第 9 连锁群的 5 对绿豆引物, 得到分辨力强的 27 对引物, 平均 PIC 值为
0.4914; UPGMA 聚类分析, 在 DICE 系数 0.021 处, 将 95 份参试材料(除 HAI_103)划分为两大类, 第 I 类包括
Ceratotropis组所有种质和 3个“过渡”种质; 第 II类包括 Angulares组所有种质, 且小豆引物通用性最高, 23对小豆引
物的转移能力达 88%以上。对参试材料中的 28份典型种质进行 ITS测序分析, 比较序列间 Kimura进化距离发现, V.
minima 和 V. umbellata 种间距离最小(0~0.005), V. radiata 种内分化程度最高; 利用 MEGA4.0 构建最大简约树
(maximum parsimony, MP)和邻接树(neighbor-joining, NJ), 将参试种质划分为 3大类, 这与形态学和 SSR标记分类一致。
关键词: Ceratotropis亚属; 分类; SSR标记; ITS序列; 进化
Classification and Evolution Analysis for Vigna Subgenus Ceratotropis Based on
SSR Markers and ITS Sequences
MA Yan-Ling, CHENG Xu-Zhen*, WANG Li-Xia, WANG Su-Hua, and ZHAO Dan
Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China
Abstract: Ninety-three materials in subgenus Ceratotropis, two landraces of subgenus Vigna and one accession of Glycine soja
from various regions of China were analyzed by using simple sequence repeat (SSR) makers and sequencing nrDNA internal
transcribed spacer (ITS) for the genetic evaluation. Twenty-seven specific SSR primers were selected by screening 74 azuki bean
primers and 14 blackgram primers that distributed in 11 linkage groups and five mungbean primers in linkage group 9 with the
average polymorphic information content (PIC) value 0.4914. In UPGMA cluster analysis, 95 materials excluding HAI_103 (G.
soja) were divided into Group I (including section Ceratotropis and three “transitional” materials) and Group II (section Angu-
lares). And the transferability of 23 primers from azuki bean reached 88%. As for ITS analysis, Kimura-2-parameter distance was
calculated based on ITS sequences of 28 representing materials. The shortest distance was found between V. minima and V. um-
bellata with 0–0.005 and V. radiata was the most intra-specific divergent. Phylogenetic trees constructed by maximum parsimony
(MP) and neighbor-joining (NJ) methods with MEGA 4.0 showed that 28 materials were divided into three groups. This result was
consistent with the classification results by phenotypes and SSR makers. Therefore, it is anticipated that more information for
classification of subgenus Ceratotropis can be provided by these two molecular methods and also a system for evaluation com-
bined by morphological characteristics can be established.
Keywords: Subgenus Ceratotropis; Classification, SSR markers; ITS sequences; Evolution
豇豆属 , 属于豆科(Leguminosae)菜豆族(Phaseoleae),
广泛分布于热带和亚热带地区。豇豆属包括 7 个亚属[1],
其中只在 Ceratotropis 亚属和 Vigna 亚属中存在栽培种,
Ceratotropis 亚属起源于亚洲, 又称亚洲豇豆亚属。该亚
属包括 21个种, 其中 5个主要栽培种为绿豆[Vigna radiata
L. R. Wilczek]、小豆[Vigna angularis Willd. Ohwi & Oha-
shi]、饭豆[Vigna umbellata Thunb. Ohwi & Ohashi]、黑吉
豆[Vigna mungo L. Hepper]和乌头叶菜豆[Vigna aconitifo-
lia Jacq. Marechal] [2-3]。据形态特征, Ceratotropis亚属又
分为 Angulares、Ceratotropis和 Aconitifoliae 3个组[4]。小
豆和饭豆属于 Angulares 组 , 黒绿豆和 吉豆属于
Ceratotropis 组。Ceratotropis 亚属的各豆种除 V. re-
flexo-pilosa是四倍体(2n=44, 4x)外, 其他都是二倍体(2n=
22, 2x), 是一个形态同类和高度特化的分类组群[5]。近 10
1586 作 物 学 报 第 36卷

年中 Ceratotropis 亚属野生资源的收集分类主要由日本
NIAS 机构进行; 亚欧地区的豇豆属资源综合收集机构为
比利时皇家植物园[6]。虽然我国 Ceratotropis 亚属物种丰
富, 但较日本、印度及一些豆类主产国, 分类与起源研究
仍属于起步阶段。
最初的形态学[7]、细胞学研究[8]以及基于生殖障碍的
研究将 Ceratotropis亚属分为两个组[9]。Tomooka 等[10]和
Doi 等 [11]分别通过 AFLP 标记和 ITS 序列分析, 将 V.
aconitifoli、V. trilobata、V. aridicola 和 V. stipulacea归为
第 3 组 Aconitifoliae, 现已采用该种分类体系[3]。Dixit 等[12]
利用反转录酶基因 Ty1-copia 和 Ty3-gypsy 的转座子保守
序列对绿豆种分析发现 LTR 可作为豆科植物分类学的有
效手段。Saini等[13]对 Ceratotropis亚属 25个种的 5S rDNA
的 IGS 序列分析发现, 除 V. umbellata 外, 大多种的野生
型和栽培型聚为一类, 并阐述了 5S rDNA 的 IGS 序列的
信息高通量优点以及在鉴定四倍体材料 V. glabrescens 的
二倍体祖先的重要性。
近年来, 在玉米、水稻等作物中, 运用 SSR (simple
sequence repeat)标记进行品种分类、杂种优势生态群划分
等方面作了大量的标记研究, 取得了很大的成功, 表明
SSR标记分类结果可靠[14]。吴晓雷等[15]利用 SSR标记研
究大豆属种间的亲缘进化关系, 表明 SSR 标记在系统分
类学研究中具有效性。Dikshit等[16]用 RAPD、URP、SSR
标记对豇豆属物种进行遗传分化研究时指出, SSR标记对
于检测豇豆属物种的遗传变异更为有效。由于 ITS (in-
ternal transcribed spacer, nrDNA的转录间隔区)进化速率
较快, 片段长度不大, 且协调进化使此片段在基因组不同
重复单元中十分一致, 易于用通用引物 PCR 扩增和测序,
ITS 序列分析方法在被子植物种质资源鉴定及分子系统
学中得到广泛应用[17]。Goel 等[18]通过 ITS 序列分析法解
决了豇豆属和菜豆属分类学方面存在的矛盾, 并确定 ITS
黒方法对于辨别绿豆、小豆、饭豆和 吉豆野生祖先具有效性。
本研究利用野外收集的已知野生种、地方种以及 4
个栽培品种, 以及 SSR 和 ITS 分析方法对中国 Ceratotropis
亚属种质进行分类和进化关系的研究与探讨 , 以期建立
与形态学相结合的鉴定体系。
1 材料与方法
1.1 试验材料
本试验材料包括自河北省、北京市、海南省、河南
省、云南省、江苏省、山东省采集的 92 份材料和 4 个栽
培品种, 共计 96份材料(表 1)。其中包括 8个种及亚种, V.
radiata var. sublobata、V. umbellata Thunb、V. minima
Roxb、V. angularis Willd.、V. nakashimae Ohwi.、V. radiata
L.属于 Ceratotropis亚属, Glycine soja和 V. unguiculata (非
洲豇豆亚属, Subgenus Vigna)作为参照。
1.2 DNA提取及 SSR扩增
每份参试种质选 6粒种子进行种植, 28℃下发芽, 选
择 10~15 d 的新鲜叶片, 利用 CTAB 法, 进行全基因组
DNA 提取。筛选分布于 11 个连锁群的 74 对小豆引物(X
系列), 14 黒对 吉豆引物(H系列)和第 9连锁群的 5对绿豆
引物(L 系列)进行 SSR 扩增, 得到 27 对多态性好的引物
(表 2)。SSR 反应体系为 20 μL 体系, 各组分终浓度为
1×Taq buffer, 0.15 mmol L–1 MgCl2, 0.2 mmol L–1 dNTP,
上下游引物各 0.15 μmol L–1, 15 ng基因组 DNA, 1 U Taq
DNA聚合酶。反应条件为 94 5 min; 94 30 s, 72 30 s, ℃ ℃ ℃
35个循环; 72℃延伸 5 min。PCR产物经 6%的聚丙烯酰胺
胶电泳, 及以梁宏伟等[19]的方法快速银染。
1.3 ITS序列扩增及测序
扩增 ITS序列采用通用引物 G1 (5′-GGAAGGAGAA
GTCGTAACAAGG-3′)和 C2 (5′-TCCTCCGCTTATTGATA
TGC-3′)[20]。扩增程序为 94 5 min; 94 30 s, 50 30 s, ℃ ℃ ℃
72 1 min, 35℃ 个循环; 72℃延伸 10 min。
扩增反应体系为 50 μL, 含 1×buffer, 0.15 mmol L–1
MgCl2, 0.2 mmol L–1 dNTP, G1和 C2引物各 0.2 μmol L–1,
2.5 U Taq DNA聚合酶。3 μL用于 1.0%琼脂糖凝胶检测,
45~47 μL产物送至 BioMed公司进行纯化测序。对所有序
列均进行双向测序。
1.4 数据统计与分析
将 SSR等变异按照电泳谱带的“有”、“无”转换为“1”、
“0”数据, 利用 NTSYSpc-2.1以非加权平均法(UPMGA)计
算种质间 DICE遗传相似系数, 并进行聚类及主坐标分析
[21], 从而分析 SSR标记在系统学分类分析的可靠性。
对 ITS序列的分析先用 ClustalX 1.8排定 DNA序列,
并进行人工核查; 用MEGA4.0软件基于 Kimura-2参数采
用 MP (maximum parsimony)法和 NJ (neighbor-joining)法
构建分子系统树, 并计算序列间进化距离。系统树各分支
的置信度由 1 000次自举法(bootstrap)重复检测[22]。
2 结果与分析
2.1 SSR引物扩增片段的多态性
91 对 SSR 引物中有 27 对可扩增产生稳定的多态性
产物, 即分辨力强。其中小豆引物 26对, 绿豆引物 1对(表
2)。其中, 26个引物均可以检测到 7个以上的等位变异, 16
对引物可检测到 10个以上的等位变异。27对引物共扩增
出 287个等位变异, 平均每位点 10.8个。检测到等位变异
数最多的引物为位于第 2连锁群的 X55 (17个等位变异)。
PIC值的变化从 0.3032到 0.8347, 平均 PIC值是 0.4914。
其中, 多态性最高和最低的引物是位于第 2 连锁群和第 8
连锁群的 X55(0.8502)和 X141(0.3139)。且 27个引物的转
移能力(通用性)差异较大(表 3), 其中 X81 和 X168 在 96
份参试材料中转移能力达到 100%。
2.2 SSR聚类结果分析
利用以 287 条 SSR 条带所得的遗传相似性矩阵, 构
建 UPGMA聚类树状图(图 1)。野生大豆 HAI_103能够与
其他材料明显区分开。以遗传相似系数 0.021为界, 95份
第 9期 马燕玲等: Ceratotropis亚属基于 SSR标记和 ITS序列的分类与进化分析 1587


表 1 参试材料来源及所属种
Table 1 Species and origin of accessions used in this study
序号
No.
采集编号/名称
Collection code/name
来源
Origin
类型
Type
所属种
Species
1 HB_2 河北省雄县 Xiong County, Hebei Province Wild V. radiata var. sublobata
2 HB_49 河北省雄县 Xiong County, Hebei Province Wild V. radiata var. sublobata
3 HB_50 河北省雄县 Xiong County, Hebei Province Wild V. radiata var. sublobata
4 HB_51 河北省雄县 Xiong County, Hebei Province Wild V. radiata var. sublobata
5 HB_52 河北省雄县 Xiong County, Hebei Province Wild V. radiata var. sublobata
6 HB_53 河北省雄县 Xiong County, Hebei Province Wild V. radiata var. sublobata
7 HB_54 河北省雄县 Xiong County, Hebei Province Wild V. radiata var. sublobata
8 HB_55 河北省雄县 Xiong County, Hebei Province Wild V. umbellate (wild) Thunb.
9 HB_56 河北省雄县 Xiong County, Hebei Province Wild V. radiata var. sublobata
10 HB_57 河北省雄县 Xiong County, Hebei Province Wild V. radiata var. sublobata
11 HB_58 河北省雄县 Xiong County, Hebei Province Wild V. radiata var. sublobata
12 HB_59 河北省雄县 Xiong County, Hebei Province Wild V. radiata var. sublobata
13 HB_60 河北省清东陵 Qingdongling, Heibei Province Wild V. radiata var. sublobata
14 HB_61 河北省清东陵 Qingdongling, Heibei Province Landrace V. angularis Willd.
15 HB_62 河北省清东陵 Qingdongling, Heibei Province Wild V. radiata var. sublobata
16 HB_63 河北省清东陵 Qingdongling, Heibei Province Wild V. radiata var. sublobata
17 HB_64 河北省清东陵 Qingdongling, Heibei Province Wild V. nakashimae Ohwi.
18 HB_65 河北省清东陵 Qingdongling, Heibei Province Wild V. radiata var. sublobata
19 HB_66 河北省清东陵 Qingdongling, Heibei Province Wild V. radiata var. sublobata
20 HB_67 河北省清东陵 Qingdongling, Heibei Province Wild V. radiata var. sublobata
21 HB_68 河北省清东陵 Qingdongling, Heibei Province Wild V. nakashimae Ohwi.
22 HB_69 河北省清东陵 Qingdongling, Heibei Province Wild V. radiata var. sublobata
23 HB_70 河北省清东陵 Qingdongling, Heibei Province Wild V. nakashimae Ohwi.
24 HB_71 河北省清东陵 Qingdongling, Heibei Province Wild V. radiata var. sublobata
25 HB_72 河北省清东陵 Qingdongling, Heibei Province Wild V. radiata var. sublobata
26 HB_73 河北省清东陵 Qingdongling, Heibei Province Wild V. radiata var. sublobata
27 HB_74 河北省清东陵 Qingdongling, Heibei Province Wild V. nakashimae Ohwi.
28 HB_75 河北省清东陵 Qingdongling, Heibei Province Wild V. radiata var. sublobata
29 HB_76 河北省清东陵 Qingdongling, Heibei Province Wild V. radiata var. sublobata
30 HB_77 河北省清东陵 Qingdongling, Heibei Province Wild V. radiata var. sublobata
31 HB_78 河北省清东陵 Qingdongling, Heibei Province Wild V. radiata var. sublobata
32 HB_79 河北省清东陵 Qingdongling, Heibei Province Wild V. radiata var. sublobata
33 HB_80 河北省清东陵 Qingdongling, Heibei Province Wild V. radiata var. sublobata
34 HB_81 河北省清东陵 Qingdongling, Heibei Province Wild V. radiata var. sublobata
35 HB_82 河北省清东陵 Qingdongling, Heibei Province Wild V. radiata var. sublobata
36 HB_83 河北省清东陵 Qingdongling, Heibei Province Wild V. radiata var. sublobata
37 HB_84 河北省清东陵 Qingdongling, Heibei Province Wild V. radiata var. sublobata
38 HB_85 河北省清东陵 Qingdongling, Heibei Province Wild V. radiata var. sublobata
39 HB_86 河北省清东陵 Qingdongling, Heibei Province Wild V. radiata var. sublobata
40 HB_87 河北省清东陵 Qingdongling, Heibei Province Wild V. umbellata (wild) Thunb.
41 HB_88 河北省清东陵 Qingdongling, Heibei Province Wild V. umbellata (wild) Thunb.
42 HB_89 河北省清东陵 Qingdongling, Heibei Province Landrace V. angularis Willd.
43 HB_90 河北省玉田县 Yutian, Hebei Province Wild V. radiata var. sublobata
44 HB_91 河北省玉田县 Yutian, Hebei Province Wild V. radiata var. sublobata
1588 作 物 学 报 第 36卷

(续表 1)
序号
No.
采集编号/名称
Collection code/name
来源
Origin
类型
Type
所属种
Species
45 HB_92 河北省玉田县 Yutian, Hebei Province Wild V. radiata var. sublobata
46 HB_93 河北省玉田县 Yutian, Hebei Province Wild V. radiata var. sublobata
47 HB_94 河北省玉田县 Yutian, Hebei Province Wild V. radiata var. sublobata
48 HB_95 河北省玉田县 Yutian, Hebei Province Wild V. radiata var. sublobata
49 HB_96 河北省玉田县 Yutian, Hebei Province Wild V. radiata var. sublobata
50 HB_97 河北省玉田县 Yutian, Hebei Province Wild V. radiata var. sublobata
51 HB_98 河北省玉田县 Yutian, Hebei Province Wild V. radiata var. sublobata
52 HB_99 河北省玉田县 Yutian, Hebei Province Wild V. radiata var. sublobata
53 HB_100 河北省玉田县 Yutian, Hebei Province Wild V. radiata var. sublobata
54 HB_101 河北省玉田县 Yutian, Hebei Province Wild V. radiata var. sublobata
55 HB_102 河北省玉田县 Yutian, Hebei Province Wild V. radiata var. sublobata
56 HB_103 河北省玉田县 Yutian, Hebei Province Wild V. radiata var. sublobata
57 HB_104 河北省玉田县 Yutian, Hebei Province Wild V. radiata var. sublobata
58 HB_105 河北省玉田县 Yutian, Hebei Province Wild V. radiata var. sublobata
59 HB_106 河北省玉田县 Yutian, Hebei Province Wild V. radiata var. sublobata
60 HB_107 河北省玉田县 Yutian, Hebei Province Wild V. radiata var. sublobata
61 HB_108 河北省玉田县 Yutian, Hebei Province Wild V. radiata var. sublobata
62 HB_109 河北省玉田县 Yutian, Hebei Province Wild V. radiata var. sublobata
63 HB_115 河北省涞水县 Laishui, Hebei Province Wild V. radiata var. sublobata
64 中绿 1号 Zhonglü 1 国家种质库 National Genebank of China Cultivar V. radiata L.
65 中绿 2号 Zhonglü 2 国家种质库 National Genebank of China Cultivar V. radiata L.
66 中红 2号 Zhonghong 2 国家种质库 National Genebank of China Cultivar V. angularis Willd.
67 中豇 1号 Zhongjiang 1 国家种质库 National Genebank of China Cultivar V. unguiculata
68 YN_114 云南省施甸县 Shidian, Yunnan Province Wild V. radiata var. sublobata
69 YN_115 云南省龙陵县 Longling, Yunnan Province Wild V. radiata var. sublobata
70 YN_121 云南省龙陵县 Longling, Yunnan Province Wild V. radiata var. sublobata
71 YN_27 云南省澜沧县 Lancang,Yunnan Province Wild V. umbellate (wild) Thunb.
72 YN_29 云南省临沧县 Lincang, Yunnan Province Wild V. umbellate (wild) Thunb.
73 YN_30 云南省临沧县 Lincang, Yunnan Province Wild V. umbellate (wild) Thunb.
74 YN_122 云南省永德县 Yongde, Yunnan Province Wild V. radiata var. sublobata
75 YN_43 云南省大理州 Dali, Yunnan Province Wild V. radiata var. sublobata
76 JS_116 江苏省 Jiangsu Province Wild V. minima Roxb.
77 JS_117 江苏省 Jiangsu Province Wild V. minima Roxb.
78 JS_98 江苏省 Jiangsu Province Wild V. minima Roxb.
79 HAI_118 海南省东方市 Dongfang, Hainan Province Wild V. radiata L.
80 HAI_103 海南省东方市 Dongfang, Hainan Province Wild G. soja
81 HN_89 河南省南阳市 Nanyang, Henan Province Landrace V. radiata L.
82 HN_119 河南省南阳市 Nanyang, Henan Province Landrace V. radiata L.
83 HN_120 河南省南阳市 Nanyang, Henan Province Landrace V. radiata L.
84 HN_121 河南省南阳市 Nanyang, Henan Province Landrace V. radiata L.
85 HN_122 河南省南阳市 Nanyang, Henan Province Landrace V. radiata L.
86 HN_123 河南省南阳市 Nanyang, Henan Province Landrace V. radiata L.
87 HN_124 河南省南阳市 Nanyang, Henan Province Wild V. radiata var. sublobata
88 HN_125 河南省南阳市 Nanyang, Henan Province Landrace V. unguiculata
89 HN_126 河南省南阳市 Nanyang, Henan Province Landrace V. radiata L.
第 9期 马燕玲等: Ceratotropis亚属基于 SSR标记和 ITS序列的分类与进化分析 1589


(续表 1)
序号
No.
采集编号/名称
Collection code/name
来源
Origin
类型
Type
所属种
Species
90 HN_127 河南省南阳市 Nanyang, Henan Province Landrace V. radiata L.
91 SD_2 山东省东营市 Dongying, Shandong Province Wild V .minima Roxb.
92 SD_5 山东省青岛市 Qingdao, Shandong Province Wild V. radiata var. sublobata
93 SD_20 山东省即墨市 Jimo, Shandong Province Wild V. minima Roxb.
94 BJ_63 北京市平谷区 Pinggu, Bejing Wild V. minima Roxb.
95 BJ_68 北京市平谷区 Pinggu, Bejing Landrace V. umbellata Thunb.
96 BJ_78 北京市平谷区 Pinggu, Bejing Wild V. radiata var. sublobata

表 2 96份材料中检测到稳定多态性的27对SSR引物
Table 2 LG distribution and primer sequence of the 27 polymorphic SSRs detected in 96 accessions
SSR引物
SSR primer
连锁群
LG
引物序列
Primer sequences (5′–3′)
SSR引物
SSR primer
连锁群
LG
引物序列
Primer sequences (5′–3′)

X26 1 GCCAAGGTGAACGGTGGTG GAGCGAGAATGGCGGAAGG X105 5
CTTGAGAACCAACTCGAACTTC
GGGAAATCGAAGAGGGACAG

X32 1 GGGAAGAAGGAAGAAGGAACC GTGACAAAACACCTGTAGCCATCC X109 5
GATTCCCTTCCTAGCTATGG
CTGCTGGACATGAAGATTCAG

X36 1 CCTTGGTTGGAGCAGCAGC CACAGACACCCTCGCGATG X113 6
GAAGAAGAACCCTACCACAG
CACCAAAAACGTTCCCTCAG

X37 1 CACTCACTGCAAAGAGCAAC CTACCTATCTGAGGGACAC X141 8
GGTCCATTGAGACGGATCGAG
TCCCACCTCAGCGGAATCC

X41 2 GCAGCAACGCACAGTTTCATGG GCAAAACTTTTCACCGGTACGACC X148 8
CGCGTATTGGTGACTAGGTATG
CTTAGTGTTGGGTTGGTCGTAAGG

X55 2 GCATATAAGAAAAGCTTATCC CTCTTGGAGTGATTTGATC X152 8
GTAGACACTGATCATCACC
GACCATCATCGATACGATTC

X58 2 GGTGCTAACGTTGGAAACTGAG CACTCCATTCTGAGGATCAATCC X154 8
GACTACTCTCAAGACCAAAG
GATGGTTGTAGATAACACTCC

X74 4 GGTTGGTAGTGTCTTTGCTGAGG CCTTGCTTTAAGCTCAGAACTCG X162 9
CATCTTCCTCACCTGCATTC
TTTGGTGAAGATGACAGCCC

X76 4 CAAACACTTTTGTAACTCCC GCTTCTAACCTTGATCCTTC X166 9
GCTGACGTAGGTGACAACC
CGGCTTGTGCTTCATTGTCTG

X81 4 TCTTGTCATTTAGCACTTAGCACG TTGTTGTTTACTAAGAGCCCGTGT X168 9
GTCGTTTCCGGAAACTGTTC
GATCCGAACCTCTTTCTGC

X88 4 GCTCTGTCAGTTCCCACTAC GGTCCTGAACCCAGATGAAC X172 9
ACCACTTCATAATCCCTGAG
GTTGCATGCTATATTTTGGTTCAC

X90 4 CCACCAACACTAACCAGTGAAG GTTCTCCCCACACACACCATAC L83 9
CAATGGGATAACTAGATAGCC
GCTGATCTCTAGTTCCTTCG

X101 5 GGCTCATTGTACCACTGGATAT ATGCCTCCTTTCAGGTGATTGT X177 10
GCCTTTGACTCTGACCCTCTT
AGCCTCCTCAGGGATGACTTT

X102 5 AGCAAATTATTGGATGAAAG TTATTTGGAATACGGATTGT

表 3 27对 SSR引物在 96份参试种质中的转移能力
Table 3 Transferability of the 27 SSR primers across the 96 accessions
SSR引物
SSR primer
转移能力
Transferability (%)
SSR引物
SSR primer
转移能力
Transferability (%)
SSR引物
SSR primer
转移能力
Transferability (%)
X26 94.79 X81 100.00 X148 83.33
X32 97.92 X88 96.88 X152 88.54
X36 65.63 X90 92.71 X154 98.96
X37 92.71 X101 95.83 X162 91.67
X41 83.33 X102 96.88 X166 97.92
X55 93.75 X105 98.96 X168 100.00
X58 92.71 X109 97.92 X172 95.83
X74 95.83 X113 95.83 L83 71.88
X76 97.92 X141 88.54 X177 98.96
1590 作 物 学 报 第 36卷



图 1 96份材料的UPGMA聚类图
Fig. 1 Dendrogram of 96 accessions based on UPGMA
第 9期 马燕玲等: Ceratotropis亚属基于 SSR标记和 ITS序列的分类与进化分析 1591


供试材料(HAI_103 除外)可被明显划分为 I、II 两大类。
在遗传相似系数 0.18 处, 第 I 类为所有的绿豆种质(野生
型和栽培型), 即 Ceratotropis 组和“过渡”种质, 包括 2 个
Vigna亚属的种质(HN_125和中豇 1号)以及中红 1号。在
遗传相似系数为 0.71 处, 73 份栽培型绿豆(V. radiata L.)
和野生型绿豆(V. radiata var. sublobata)种质能基本区分
开。野生型绿豆种质种内也存在明显差异 , 相似系数为
0.74~ 1.00。第 II类包括所有的 Angulares组种质。
上述结果表明 SSR 标记可以将 Ceratotropis 组(绿豆
组)和 Angulares 组(小豆组)种质明显区分开来, 并各自聚
成一类。这与二维主坐标分析结果一致(图 2), 说明 SSR
数据存在足够的遗传变异用于该亚属种质的鉴别和分类。



图2 基于SSR 数据对96份材料的两维主坐标分析
Fig. 2 PCOA analysis for 96 accessions based on the SSR
fingerprints

2.3 序列间进化距离分析
对 28 份种质进行 ITS 序列分析。ITS 序列扩增长度
631~696 bp, 对位排列后长度 723 bp, 包括 444个变异位
点, 其中 355 个为信息位点。根据 Kimura-2 参数遗传距
离模型计算(表 4)。Angulares 组(小豆组)中 V. minima 和
V. umbellata种间进化距离最小, 为 0~0.005, V. angularis
与 V. umbellata种间进化距离为 0.029~0.249; Ceratotropis
组(绿豆组)中 V. radiata var. sublobata种内进化距离可达
0.003~0.359, V. radiata var. sublobata (野生型)与 V. radiata
L.(栽培型 )的进化距离最大 , 可达 0.426 (HB_99 与
YN_114)。2个不同的组中, V. angularis和 V. radiata种间
进化距离 0.110~0.451, V. minima和 V. radiata种间进化距
离为 0.114~0.478。
2.4 系统发育分析
对 ITS 分别采用最大简约法(MP)和邻接法(NJ)进行
系统发育分析, 构建进化树。在分支结构上前者与后者基
本一致, 自展支持率略有不同。严格一致树长为 712, CI
为 0.726124, RI为 0.865145。MP树中(图 3)基于 ITS序列
差异 28 份材料被划分为 : Ceratotropis 组 (绿豆组 )、
Angulares组(小豆组)和过渡类群。V. minima、V. umbellata、
V. radiata与 V. angularis各种间可被明显区分开, 并各自
构成子群, 而 V. nakashimae未能与 V. minima区分开。“过
渡”子群包含 HAI_103、中豇 1号、HN_125和中红 2号 4
份材料。除 HAI_103为已知的野生大豆外, 其余 3种均为
栽培类型的种质。图 4 中 NJ 树的系统树分支情况与 MP
树吻合度较高, 不再具体分析。
3 讨论
本研究中, 利用 SSR 标记分析方法能将参试材料中
的 8 个不同的种, 野生型和栽培型基本区分开, 而且各种
间的遗传距离差异明显。可将亲缘关系较远的 G. soja
(HAI_103)与其他 7 个种明显分开(DICE 系数仅为 0.02),
将 Angulares 组中 4 个种 V. umbellata、V. minima、V.
angularis、V. nakashimae完全分开。但也出现与预期结果
不一致的现象 , 即在 UMPGA 聚类图中 , 中豇 1 号(V.
unguiculata, Vigna亚属)与中红 2号(V. angularis, Ceroto-
tropis亚属)聚为一类, 这可能与近缘种 SSR标记在 2个材
料间等位变异较少有关, 但相似系数仅为 0.51, 表明 2个
材料之间在 DNA水平仍存在较大差异。且 SSR标记可精
确至种的分类水平, 却未能将同种(V. radiata var. sublo-
bata)的不同地理来源的材料区分开, 即种内鉴别能力较
差, 这可能与实验材料取样点生态条件较为相似有关。同
时, 筛选的 91 对近缘 SSR 引物中有效小豆引物比例为
35.14%, 且除引物 X36、X41、X148外, 23对小豆引物在
96 份参试材料间转移能力均在 88%以上。有效绿豆引物
仅有 L83, 这与待筛选绿豆引物基数较少有关, 但由于参
试材料中绿豆种(含栽培型和野生型)比例达 79.2%, 且其转
移能力较低(71.88%), 以及绿豆种个体间存在较大变异[20],
笔者认为小豆引物较绿豆引物在 Cerototropis 亚属不同
种的通用性更高, 这与 Vir[23]研究结论一致。同时应开发
多种均匀分布于 11 个连锁群的近缘种 SSR 标记, 以得到
更准确的分类结果。
ITS 分析方法将 28 份材料分为 Ceratotropis 组(绿豆
组)、Angulares 组(小豆组)和过渡类群, 与形态学和 SSR
标记分析结果基本一致。但不同于 SSR分析结果, ITS法
将 HAI_103 划分为过渡子群, 且未能区分栽培型和野生
型, NJ树中中绿 2号(栽培型)与 YN_114 (野生型)聚在一
起形成单系分支, 并获得 100%的自展支持率, 再与其他
4个绿豆种野生材料构成姊妹群。序列间进化距离分析表
明, V. minima和 V. umbellata种间进化距离最小, 即亲缘
关系最近。这与前人研究结果一致, Marechal等[1]认为 V.
minima 与野生型 V. umbellata亲缘关系密切, 并可能为 V.
umbellata 的野生祖先[24]。不同种的种内进化距离比较可
知, V. radiata种分化程度最高, 这可能与V. radiata种植普
遍度、利用率高有关[25], 因此遗传物质交换几率高, 变异
程度大, 这也间接证明了绿豆 SSR序列保守性较低, 不宜
作为 Ceratotropis 亚属分类的分子标记[13]。从 MP 树和
NJ树可看出, V. minima种未能与V. nakashimae区分开, 表明


表4 ITS序列间的Kimura进化距离
Table 4 Pairwise divergence of ITS sequences using Kimura-2-parameter distance
1a 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
HB_89
JS_98 0.048
HB_74 0.050 0.003
YN_30 0.029 0.045 0.047
YN_27 0.029 0.045 0.047 0.000
HB_87 0.029 0.047 0.045 0.003 0.003
HN_125 0.238 0.254 0.252 0.251 0.251 0.247
ZJ1 0.241 0.251 0.247 0.249 0.249 0.246 0.005
ZH2 0.241 0.252 0.247 0.249 0.249 0.247 0.003 0.002
HAI_103 0.262 0.256 0.256 0.251 0.251 0.253 0.253 0.248 0.251
ZL2 0.211 0.222 0.222 0.203 0.203 0.205 0.390 0.386 0.386 0.396
ZL1 0.122 0.126 0.128 0.112 0.112 0.112 0.300 0.299 0.300 0.297 0.153
HN_124 0.116 0.132 0.128 0.116 0.116 0.114 0.282 0.282 0.282 0.297 0.102 0.074
BJ_78 0.146 0.158 0.158 0.145 0.145 0.142 0.314 0.312 0.312 0.332 0.093 0.097 0.043
YN_114 0.272 0.285 0.285 0.259 0.259 0.261 0.440 0.436 0.436 0.439 0.099 0.217 0.165 0.173
YN_115 0.114 0.122 0.118 0.106 0.106 0.104 0.284 0.279 0.279 0.286 0.104 0.063 0.017 0.050 0.166
HB_105 0.110 0.118 0.114 0.102 0.102 0.101 0.279 0.274 0.275 0.281 0.104 0.061 0.013 0.048 0.163 0.003
HB_99 0.473 0.474 0.478 0.454 0.454 0.454 0.652 0.651 0.652 0.650 0.374 0.364 0.364 0.356 0.426 0.353 0.353
HB_94 0.371 0.383 0.386 0.359 0.359 0.359 0.550 0.556 0.557 0.552 0.311 0.305 0.279 0.299 0.367 0.277 0.280 0.128
HB_51 0.451 0.464 0.465 0.438 0.438 0.435 0.631 0.630 0.631 0.626 0.360 0.360 0.355 0.338 0.401 0.341 0.344 0.084 0.129
HB_49 0.283 0.291 0.286 0.269 0.269 0.267 0.444 0.437 0.437 0.443 0.210 0.204 0.184 0.192 0.258 0.175 0.177 0.176 0.128 0.161
HB_60 0.152 0.163 0.163 0.145 0.145 0.147 0.326 0.323 0.324 0.332 0.101 0.101 0.047 0.070 0.149 0.045 0.043 0.345 0.282 0.325 0.171
HB_71 0.153 0.165 0.161 0.149 0.149 0.147 0.315 0.310 0.310 0.32 0.080 0.095 0.038 0.040 0.147 0.047 0.047 0.359 0.305 0.348 0.184 0.067
HB_86 0.154 0.166 0.164 0.151 0.151 0.146 0.322 0.322 0.322 0.335 0.097 0.097 0.043 0.036 0.164 0.047 0.048 0.358 0.302 0.347 0.197 0.068 0.047
HB_64 0.050 0.003 0.002 0.047 0.047 0.043 0.249 0.249 0.249 0.256 0.222 0.126 0.130 0.158 0.285 0.120 0.116 0.474 0.383 0.462 0.289 0.163 0.163 0.162
SD_2 0.050 0.003 0.002 0.047 0.047 0.043 0.249 0.249 0.249 0.256 0.222 0.126 0.130 0.158 0.285 0.120 0.116 0.474 0.383 0.462 0.289 0.163 0.163 0.162 0.000
JS_116 0.050 0.003 0.000 0.047 0.047 0.045 0.252 0.247 0.247 0.256 0.222 0.128 0.128 0.158 0.285 0.118 0.114 0.478 0.386 0.465 0.286 0.163 0.161 0.164 0.002 0.002
SD_20 0.050 0.003 0.000 0.047 0.047 0.045 0.252 0.247 0.247 0.256 0.222 0.128 0.128 0.158 0.285 0.118 0.114 0.478 0.386 0.465 0.286 0.163 0.161 0.164 0.002 0.002 0.000
a: 横排编号1~28分别代表竖排HB_89至SD_20共28份种质。ZJ1、ZL1、ZL2、ZH2分别代表中豇1号、中绿1号、中绿2号、中红2号(下图同)。
a: 1–28 in the first row represents materials in the first column from HB_89 to SD_20, respectively.
第 9期 马燕玲等: Ceratotropis亚属基于 SSR标记和 ITS序列的分类与进化分析 1593




图3 ITS序列的最大简约树
Fig. 3 Maximum parsimony tree based on ITS
I: Ceratotropis组; II: Angulares组; III: 过渡类群。分支上的数字为自展支持率。
I: section Ceratotropis; II: section Angulares; III: transitional group. Numbers above branches indicate bootstrap values.



图4 ITS序列的邻接树
Fig. 4 Neighbor-joining tree based on ITS
I: Ceratotropis组; II: Angulares组; III: 过渡类群。分支上的数字为自展支持率。
I: section Ceratotropis; II: section Angulares; III: transitional group. Numbers above branches indicate bootstrap values.
1594 作 物 学 报 第 36卷

2 个种的亲缘关系极近, 这与形态学鉴定相吻合[26]——2 个
种仅在花的大小和色泽上有较大差异, 即 V. nakashimae
可划分为 V. minima的亚种。
而分类和进化研究中, 除 SSR标记和 ITS方法, 也可
利用其他的分子标记 , 如基于表观遗传学研究的 MSAP
(methyl-sensitive amplification polymorphism)方法[27], 也
可利用细胞学方法进行核型分析[28-29]等。野生资源在分化
和多样化过程中能适应各种环境 , 含有栽培种质缺少的
优异基因。我国 Cerototropis 亚属物种丰富, 收集和鉴定
其野生近缘种具有重要的意义。采用多手段综合全面分析,
发掘新的研究方法将对资源鉴定评价 , 新品种选育产生
重要作用。
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