全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(12): 2099−2105　 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

基金项目: 中国农业科学院杰出人才科研启动经费资助
作者简介: 邓欣(1980−), 女, 汉族, 湖南衡阳人, 硕士, 主要从事亚麻的分子生物学研究。Tel: 0731-7314036; E-mail: kitty_amao@yahoo.com.cn
*
通讯作者(Corresponding author): 陈信波, 男, 湖南长沙人, 博士生导师。E-mail: chenxinbo@hotmail.com
Received(收稿日期): 2008-05-04; Accepted(接受日期): 2008-07-15.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.02099
用磁珠富集法分离亚麻基因组微卫星分子标记
邓 欣 1 陈信波 1,2,* 龙松华 1 王孝纯 3 高 原 1,2 何东锋 1,2 王 进 1
王玉富 1
(1 中国农业科学院麻类研究所 / 农业部麻类遗传改良与工程微生物重点实验室, 湖南长沙 410205; 2 湖南农业大学 / 作物基因工程
湖南省重点实验室, 湖南长沙 410128; 3 黑龙江大学资源与环境研究室, 黑龙江哈尔滨 150080)
摘 要: 应用 Dynal磁珠-生物素标记的微卫星探针(CT)15与亚麻基因组 DNA酶切片段杂交, 捕获 300~1 500 bp含有
微卫星序列的 DNA 片段, 连接到 pMD18-T 载体中, 构建富集微卫星序列的小片段插入文库。利用接头引物和根据
微卫星核心序列设计的引物VRV(CT)15使用 PCR方法直接对文库筛选, 从 422个转化子中获得了 104个阳性克隆, 对
其进行测序分析, 获得了 97 个微卫星序列, 微卫星序列的富集效率达到 22.99%, PCR 扩增筛选效率 93.27%。对 97
个微卫星序列进行比对分析, 其中 51 个重复序列的两端序列高度相似, 据其设计的特异引物对阳性克隆进行 2次筛
选, 能淘汰相似度高的同类序列, 提高筛选亚麻微卫星标记的效率。
关键词: 亚麻; 微卫星; 磁珠富集
Microsatellite Molecular Marker Enrichment by Magnetic Beads in Flax
DENG Xin1, CHEN Xin-Bo1,2,*, LONG Song-Hua1, WANG Xiao-Chun3, GAO Yuan1,2, HE Dong-Feng1,2,
WANG Jin1, and WANG Yu-Fu1
(1 Key Laboratory of Genetic Improvement & Engineering Microbiology for Bast Fiber Crops, Ministry of Agriculture / Institute of Bast Fiber Crops,
Chinese Academy of Agricultural Sciences, Changsha 410128, Hunan; 2 Crop Gene Engineering Key Laboratory of Hunan Province / Hunan Agricul-
tural University, Changsha 410128, Hunan; 3 College of Agricultural Resources and Environmental Sciences, Heilongjiang University, Harbin 150080,
Heilongjiang, China)
Abstract: Flax (Linum usitatissimum L.) is one of the important oil and fiber crops in the world and can be used as a model plant
for bast fiber genomics. The objectives of this study were to set up an efficient protocol to develop microsatellite markers for flax
genetic linkage map construction, gene mapping, and marker-assisted selection (MAS). The 300–1 500 bp flax DNA fractions
containing microsatellite sequences were captured by hybridizating the digested genomic DNA fragments with the oligonucleotide
probes (CT)15 attached to streptavadin coated magnetic beads (Dynal). The enriched DNA fragments were ligated into pMD18-T
vector and then transformed into E. coli Top10 competent cells to form an enriched microsatellite sequence library. PCR screen-
ing using adaptor primer and VRV (CT)15 as primers identified 104 microsatellite clones from 422 transformants in the libraries.
Sequence analysis of these positive clones confirmed 97 microsatellite sequences, with a high enrichment efficiency of 22.99%
and PCR screening efficiency of 93.27%. Comparative analysis of the 97 microsatellite sequences showed that 51 among them
were of high similarity for microsatellite sequences. PCR amplification using a pair of primers designed from these 51 sequences
could successfully identify clones with these high similar microsatellite sequences before sequencing. This method can be used as
an efficient tool to eliminate high copy microsatellite clones in screening microsatellite library.
Keywords: Flax; Microsatellite; Enrichment by magnetic beads
2100 作 物 学 报 第 34卷

微卫星 (microsatellite), 又称为简单序列重复
(simple sequence repeat, SSR)或短串联重复 (short
tandem repeat, STR), 是以少数几个核苷酸(1~6个)
为重复单位的串联重复 DNA序列[1]。由于微卫星具
有高水平的杂合性和突变率、双亲遗传模式等优势,
加之便于检测, 费用低廉, 因此广泛用于遗传图谱
构建、基因定位、标记辅助育种、家系分析、品种
鉴定以及进化分析等研究 [2-5]。亚麻 (Linum usita-
tissmum L.)是亚麻科(Linaceae)亚麻属(Linum)的一
年生草本纤维植物, 已经有六、七千年的栽培历史。
亚麻既是世界第三大纤维作物, 又是五大油料作物
之一。作为一种重要的经济作物, 亚麻在微卫星分
子标记方面的研究远远滞后于其他作物, 大豆、棉
花、水稻、葡萄、花生的 SSR标记已有许多研究, 并
公开发表了大量可以直接利用引物序列[6-8], 而现有
亚麻的微卫星标记数量非常有限, 仅有法国科学家
Roose-Amsaleg 等分离的 28个微卫星标记 [9]。这严
重制约了微卫星标记在亚麻遗传学、分子生物学方
面的研究和应用。因此, 迫切需要获得更多独立分
离的、多态性丰富的亚麻微卫星标记。
用生物素包被的磁珠富集法分离微卫星分子标
记是一种简单高效的方法[11], 它是用生物素(biotin)
标记重复序列特异探针与基因组 DNA 酶切片段杂
交, 利用生物素与链亲和素(streptavidin)亲和性强的
特性, 用包被链亲和素的磁珠进行磁力吸附完成重
复序列目标片段的富集[12-14]。磁珠富集后获得重复
序列片段的效率大幅度提高, 使克隆测序量大幅下
降, 现已应用到一些植物和动物微卫星分子标记的
分离[8-10,13-16]。本研究拟建立筛选亚麻的微卫星分子
标记的生物素-磁珠富集法, 以提高其筛选效率。
1 材料与方法
1.1 亚麻基因组 DNA的提取和酶切
以亚麻品种白花幼苗为材料 , 采用改进的
CTAB法提取亚麻基因组 DNA[17]。用限制性内切酶
Mse I酶切 10 μg亚麻基因组 DNA, 100 μL的酶切反
应体系中包含 30 U的 Mse I (Fermentas)、10 μL的
10×buffer M 及 10 μg 基因组 DNA。65℃水浴酶切
2 h后, 经 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测, 用天根生化科
技的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收 300~1 500 bp 的
DNA片段。
1.2 单链寡核苷酸接头制备
将浓度均为 50 μmol L−1 的单链寡核苷酸
primer A 和 primerＢ等比例混合, 使其终浓度为 25
μmol L−1, 95℃变性 5 min, 60℃退火 1 h, 形成具有黏
性末端的接头。单链寡核苷酸 primer A 为
5′-AGATGGAATTCGTACACTCGT-3′, primer B 为
5′-TAACGAGTGTACGAATTCCATCT-3′。
1.3 DNA片段与接头连接
建立 20 μL 的连接体系(10×buffer 2 μL, 酶切
DNA片段 2 μL, 接头 25 μmol L−1 10 μL, T4 DNA连
接酶 6 U, 无菌去离子水补足至 20 μL), 16℃过夜连
接 12~14 h。连接产物加无菌去离子水至 500 μL, 用
等体积的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)抽提, 用冰乙
醇纯化沉淀 DNA, 加入 15 μL去离子水溶解。
1.4 接头连接片段的 PCR扩增
连接产物以 primer A为引物进行 PCR扩增。25
μL反应体系中含连接产物 1 μL, 10 nmol L−1引物 2
μL, 2.5 mmol L−1 dNTP 2 μL, 10×PCR buffer 2.5 μL,
Taq DNA 聚合酶 1 U(天根生化科技)。PCR 程序为
94℃预变性 2 min; 随后 36 个循环, 每个循环 94℃
变性 45 s, 60℃退火 45 s, 72℃延伸 1 min; 最后 72℃
延伸 10 min。用试剂盒纯化 PCR 产物(天根), 并将
其浓缩至 15 μL。
1.5 微卫星文库的构建
1.5.1 杂交 用生物素标记的探针(CT)15 与纯化
的接头连接 DNA片段杂交。建立 50 μL杂交混合液
反应体系含 5 μL探针(10 μmol L−1), 5 μL primer A,
15 μL 20×SSC, 10% SDS 0.5 μL及 12.5 μL ddH2O,
68℃预热。将 15 μL 连接产物 DNA 片段于 95℃变
性 5 min, 再加预热的杂交混合液, 于 68℃杂交 1 h。
杂交过程中摇匀。
1.5.2 磁珠的平衡 将链霉亲和素包被的磁珠
(Dynal M-280)轻轻摇匀, 取 100 μL加入 1.5 mL的离
心管中, 放在磁力架上 1~2 min, 轻轻吸出盐溶液。
用 200 μL B&W洗液(10 mmol L−1 Tris-HCl, 1 mmol
L−1 EDTA, 2 mol L−1 NaCl)洗涤 2次, 再用 200 μL洗
液 I (6×SSC, 0.1%SDS)反复洗涤平衡, 直到磁珠表
面变得顺滑易洗脱。加入 200 μL 洗液 I, 室温放置
备用。
1.5.3 磁珠吸附富集 磁珠上包被的链霉亲和素
可与探针上的生物素结合, 从而通过磁力将探针连
同所需的微卫星序列一同分离出来。将杂交液加入
平衡好的磁珠中, 于 25℃温育 20 min, 并轻轻摇动,
使生物素和链霉亲和素充分结合。温育后将离心管
置磁力架上使磁珠被吸附到管壁, 去除溶液。依次
第 12期 邓 欣等: 用磁珠富集法分离亚麻基因组微卫星分子标记 2101


用 200 μL洗液 I、洗液 II (3×SSC, 0.1% SDS)、洗液
III (6×SSC)洗涤磁珠, 去除不含微卫星的序列。方法
是用洗液 I在室温洗 2次, 每次静置 8 min; 洗液 II
在 68℃洗 2次, 每次静置 15 min; 洗液 III在室温快
速洗 2次。
1.5.4 捕获含有微卫星序列的单链 DNA 用
0.1×TE 200 μL在室温快速洗 2次, 加 0.1×TE 50 μL,
95℃变性 10 min, 释放出含有微卫星序列的单链
DNA, 放在磁力架上 , 将磁珠吸附到管壁 , 吸出含
微卫星序列的单链 DNA溶液备用。
1.6 PCR扩增含有微卫星序列的 DNA片段
以 primer A为引物进行 PCR扩增。25 μL反应
体系中包括含微卫星序列的单链 DNA溶液 1 μL, 10
nmol L−1引物 2 μL, 2.5 mmol L−1 dNTP 2 μL, 10×PCR
buffer 2.5 μL, Taq DNA聚合酶 1 U(天根生化科技)。
PCR程序为 94℃预变性 2 min; 随后 36个循环, 每
个循环 94℃变性 45 s, 60℃退火 45 s, 72℃延伸 1 min;
最后 72℃延伸 10 min。用试剂盒纯化 PCR产物(天
根生化科技), 并将其浓缩至 15 μL。
1.7 连接 T-载体与克隆
建立 10 μL连接反应体系, 加 solution I 5 μL,
pMD18-T vector 1 μL(大连宝生物)和富集的微卫星
序列 DNA 片段 2 μL, 加无菌去离子水补足 10 μL,
4℃连接过夜。用连接产物转化大肠杆菌 Top10感受
态细胞(天根), 转化液涂抹在含有 IPTG 和 X-gal 的
LB固体培养基平板上进行蓝白斑筛选, 得到微卫星
基因组文库。
1.8 用 PIMA法筛选含微卫星的阳性克隆
挑取白色单菌落接种到 1 mL LB培养液中, 于
37℃培养过夜, 用菌液做模板, 用 primer A 及微卫
星特异序列 primer C [VRV(CT)15]筛选阳性克隆。20
μL反应体系中含有菌液 1 μL, 10 nmol L−1引物各 1
μL, 2.5 mmol L−1 dNTP 1 μL, 10×PCR buffer 2 μL,
1 U Taq DNA聚合酶(天根生化科技)。PCR程序为
94℃预变性 2 min; 94℃变性 45 s, 62℃退火 45 s, 72℃
延伸 1 min; 36个循环, 最后 72℃延伸 10 min[18]。
1.9 序列分析与微卫星引物设计及筛选
经 PIMA 法筛选出的阳性克隆送北京华大基因
科技股份有限公司测序, 采用 SSR Hunter 1.3 软件
分析序列, 并用 Bioedit Sequence Alignment Editor
软件对所有序列进行比对分析、归类, 再用 Premier
Primer 5.0 软件进行引物设计。对高度相似的一类
微卫星序列设计特异引物, 对阳性克隆进行 PCR 扩
增, 验证引物的特异性。
2 结果与分析
2.1 酶切及加接头扩增
选用Mse I限制性内切酶酶切亚麻基因组 DNA,
获得了较为理想的效果(图 1)。连接人工接头后进行
PCR扩增, 产物片段多集中在 300~1 500 bp范围内
(图 2), 满足实验要求。

图 1 限制性内切酶 Mse I酶切亚麻基因组 DNA
Fig. 1 Flax genomic DNA digestion by restriction endonucle-
ase Mse I
M: marker (100 bp DNA ladder); 1~2: 酶切产物。
M: marker (100 bp DNA ladder); 1–2: Mse I digested products.

图 2 连接产物 PCR扩增
Fig. 2 PCR products of ligated DNA
M: marker (100 bp DNA ladder); 1~2: 扩增产物。
M: marker (100 bp DNA ladder); 1–2: PCR products.

2.2 SSR富集及克隆测序
以富集反应得到的含有微卫星序列的单链 DNA
溶液作为模板, primer A为引物进行PCR扩增, 将PCR
纯化产物与 T载体连接后转化大肠杆菌 Top10感受态
细胞。在 422个有插入片段的克隆中, 用 primer A及
特异引物 primer C进行菌落插入片段 PCR检测, 其中
104个克隆产生了 2条或 2条以上的扩增带, 表明可能
含有微卫星序列(图 3)。测序结果表明其中 97 个克隆
2102 作 物 学 报 第 34卷

含有微卫星序列, PCR 筛选的微卫星序列准确率达到
93.27%, 富集效率达到 22.99%。其中以 CT 为单位的
重复序列 96 个, 占了绝大多数(98.97%)。重复次数在
10~20次间的 20个(20.62%), 20次以上的微卫星 75个
(77.32%), 最高重复数为 50 次。其中, 完全型微卫星
75 个(77.32%), 非完全型微卫星 20 个(20.62%), 复合
型微卫星 2 个(2.06%)。除探针中使用的重复单元外,
还观察到 ccg、ggc、ttc、ttg的重复序列。

图 3 引物A及特异引物 C PCR扩增筛选微卫星阳性克隆
Fig. 3 PCR screening of positive microsatellite clones with primer A and specific primer C
M: marker (100 bp DNA ladder); 1~15: 有插入片段克隆 PCR扩增。
M: marker (100 bp DNA ladder); 1–15: PCR results of clones with insert fragments.

2.3 引物设计及高度相似微卫星序列的筛选验
证
用 Bioedit Sequence Alignment Editor软件对 97
个含微卫星的序列进行比对分析、归类, 发现其中
51 个序列除重复序列部分的重复次数有异 , 其两
端序列高度相似。另有少量序列比对相似性达到
100%, 其中重复出现 2 次的序列 4 类, 重复出现 3
次的序列 1 类。对除 51 个高度相似微卫星序列以
外的序列用 Premier Primer 5.0软件进行引物设计,
除一个序列因其本身结构不能设计引物外, 共设计
出 42 对微卫星特异引物。为在后续分离微卫星序
列时排除因其两端序列高度相似或相同而不能
用于分子标记的序列, 针对51个高度相似的重复序列
设计了一对特异引物, COMr 为 5′-TCCCYTTATT
CCCCTTTGCT-3′, COMf为 5′-CCAAACGCCATTG
GAKAAAG-3′(图 4)。用这对引物对含微卫星序列
的阳性克隆进行扩增, 其中含同类相似序列的克隆
能扩增出清晰的条带 , 其他则没有得到扩增条带
(图 5), 表明引物特异性好, 可以用于淘汰这类高度
相似微卫星序列。
3 讨论
3.1 磁珠吸附富集法用于高效开发亚麻微卫星
分子标记
微卫星 DNA 标记可从已公布的核酸序列检索
开发 SSR标记、借用相关物种已有的微卫星标记、
基因组 DNA分离测序 3种途径。由于亚麻已公布核
酸序列少, 而且缺乏近源物种核酸序列信息, 可检
索利用的资源相对有限, 需要从基因组DNA分离获
取。最常用的微卫星 DNA标记分离方法是构建富含
微卫星位点的基因组文库, 通过杂交筛选出含有微
卫星序列的克隆[19]。以往用人工合成带放射性同位
素或非放射性标记的探针进行杂交, 然后筛选阳性
克隆测序, 但是筛选效率极其低下, 植物中已报道
的阳性克隆比率约为 2%~3%, 且需要大量的人力和
资金的投入[20]。本研究建立的用生物素包被的 Dynal
磁珠富集分离亚麻微卫星分子标记方法, 得到的 CT
插入文库中微卫星的阳性克隆率达>22.99%, 远远
高于常规方法的阳性克隆率。Weber[21]认为, 只有在
双碱基重复序列重复次数大于 12次时, 微卫星标记
才有可能表现出较高 PIC (polymorphic information
content)值。Orit 等[22]则认为当 n≥16 时, 可提供的
PIC 在 0.5 以上才可以进行相应的多态性分析。
Smulders 等[23]认为重复次数多的微卫星既能在种间
又能在种内产生多态性 , 但重复次数少的微卫星 ,
仅能在种间产生多态性。因此, 研究所选用的微卫
星序列其核心序列重复次数应当在较高的水平上 ,
才可避免由于微卫星核心序列过短, 造成微卫星标
记筛选中多态性引物的比例过低。本研究所得到的
微卫星序列重复数在 12 次以上的有 95 个, 占总数的
97.94%, 重复数在 16次以上的达到 94个, 占总数的
96.90%。这可提高获得多态性微卫星分子标记的概
率。因此本研究建立的磁珠富集法可高效分离具多
态性的亚麻微卫星分子标记。
第 12期 邓 欣等: 用磁珠富集法分离亚麻基因组微卫星分子标记 2103



图 4 部分高度相似微卫星序列的比对分析
Fig. 4 Comparative analysis of microsatellite sequences with high similarity
−: 位点缺失; *: 相同; _: 引物设计位置。
−: missing; *: identity; _: positions of primers designed.
2104 作 物 学 报 第 34卷


图 5 特异引物 COMf和 COMr筛选高度相似微卫星序列克隆
的扩增
Fig. 5 PCR products of clones with high similar microsatellite
sequences using specific primer COMf and COMr
M: marker (100 bp DNA ladder); 1~4: 不含高度相似微卫星序列
的克隆; 5~8: 含高度相似微卫星序列的克隆。
M: marker (100 bp DNA ladder); 1–4: clones without high similar
microsatellite sequences; 5–8: clones with high similar microsatel-
lite sequences.

3.2 影响磁珠吸附法微卫星序列富集效率的因
素
磁珠富集法分离微卫星是个连续且相互依存的
过程, 其关键步骤的操作直接影响其富集效率。高
质量基因组 DNA的获得、接头连接效率和连接产物
的纯化效果都影响到后面扩增和载体连接等步骤。
但最关键的一步还是磁珠富集的效率和特异性, 它
直接影响微卫星序列获得的效率。磁珠富集法的最
大障碍是不含 SSR 的 DNA 也被吸附到磁珠表面或
与 SSR探针非特异结合, 杂交的温度、DNA及探针
的纯度是影响杂交特异性的重要因素, 而杂交温度
应根据探针序列的 Tm值决定[8]。本实验将杂交温度
和首次洗涤温度提高到 68 , ℃ 获得了较满意的效果。
磁珠的平衡及洗液和洗涤温度则是富集的关键, 须
严格控制, 磁珠用前需要用盐溶液反复平衡, 直到
磁珠顺滑; 整个富集过程要严格控制温度, 以尽可
能地洗掉那些不含有微卫星的多余片段, 仅保留富
含微卫星序列的目的片段。因此在对不同的物种建
立 SSR 富集文库时, 应对杂交和洗涤的温度进行试
验优化。
3.3 提高从微卫星文库中筛选微卫星序列效率
的方法
为提高微卫星序列的筛选效率, 大量研究用同位
素探针通过原位杂交对微卫星文库进行筛选 [14-15,19]
或利用磁珠富集 AFLP 片段中的含微卫星的片段,
再从电泳胶上切取差异片段直接进行测序来筛选[8]。
但这些方法费时费力, 且实验成本较高。本研究采
用 PIMA法, 用 primer A及特异引物 primer C进行
微卫星 PCR 扩增筛选。在扩增结果中, 无扩增带的
菌落则不含插入片段, 有一条扩增带的即为插入片
段全长带, 能扩增出两条及以上带的, 则可能包括
接头引物扩增出的插入片段全长带和 primer A与特
异引物 primer C扩增出的小于插入片段的含微卫星
序列带。我们对能扩增出两条及以上带的 104个克隆
测序分析得到了 97个含有微卫星序列, 筛选的微卫
星序列准确率达到 93.27%。这种方法通过一次 PCR
扩增即可从大量转化子中筛选含微卫星的阳性克隆,
操作简单快捷 , 成本较低 , 准确性高 , 非常适合大
量微卫星序列的筛选。
3.4 微卫星文库筛选时去除多拷贝或高度重复
微卫星序列克隆的方法
富集微卫星序列的操作过程中, 目的片段的拷
贝数也同时大量扩增。这使得阳性克隆重复出现的
概率大幅提高。Zane等 [20]的研究表明 , 富集文库中
约有 50%的阳性克隆重复出现了 5~20次。在本研究
中也出现了一些重复克隆, 但更多的是大量重复序
列两端高度相似的克隆序列, 且占获得的微卫星序
列的 52.58%。但在其他植物的同类研究中, 未见有
如此高比例的相似微卫星序列的筛选报道, 因此我
们认为这类序列可能在亚麻基因组 DNA 中多位点
存在, 或来源于染色体的端粒和着丝粒的关联 DNA
中存在的大量高度重复序列区域[6]。大量的高度相
似序列及重复序列不但增加了工作量, 还大大增加
了后续的测序和微卫星鉴定等一系列研究的费用。
为避免重复, 提高筛选效率, 可尽量从不同的文库
板中挑取阳性克隆; 或通过电泳检测菌落 PCR 获得
的片段大小, 使送测序样品大小不同; 或对样品进
行多批测序, 对发现的高度相似的序列设计特异引
物, 在 PIMA 法筛选的阳性克隆基础上进行二次筛
选, 淘汰后续实验中的同类克隆。在我们第 2批 PIMA
法筛选的 78个微卫星序列阳性克隆中, 通过二次筛
选淘汰了 38个克隆, 占 48.72%, 接近第 1批阳性克
隆的高度相似微卫星序列比例。筛选淘汰后的 40个
克隆测序结果仅 2 个为高度相似微卫星序列。表明
在出现高比例高度相似或相同微卫星序列克隆时 ,
二次筛选的效果非常有效。
4 结论
用磁珠富集法构建富集亚麻基因组微卫星序列
的小片段插入文库 , 并以 PIMA法对文库筛选 , 获
得了 97个亚麻微卫星序列, 其富集效率达到 22.99%,
第 12期 邓 欣等: 用磁珠富集法分离亚麻基因组微卫星分子标记 2105


PIMA法筛选效率达 93.27%。在获得的亚麻微卫星
序列中发现大量两端序列高度相似的重复序列, 据
其设计特异引物对阳性克隆进行 2次筛选, 能淘汰
相似度高的同类序列, 显著提高开发亚麻微卫星标
记的效率。建立的磁珠富集法分离具多态性的亚麻
微卫星分子标记, 可对微卫星序列特异富集、采用
PIMA 法扩增筛选微卫星和设计特异引物进行阳性
微卫星克隆 2 次筛选淘汰高频出现的相似和相同序
列克隆, 可提高特异微卫星序列筛选效率。该方法
还具有操作简单快捷, 成本较低, 准确性高等特点,
非常适合大量亚麻微卫星序列的筛选。
References
[1] Akagi H, Yokozeki Y, Inagali A, Fujimura T. Microsatellite
DNA markers for rice chromosomes. Theor Appl Genet, 1996,
93: 1071−1077
[2] Tautz D. Hyper variability of simple sequence as a general
source for polymorphic DNA markers. Nucl Acids Res, 1989,
17: 6463−6471
[3] Liu F(刘峰), Dong-Fang Y(东方阳), Zou J-J(邹继军), Chen
S-Y(陈受宜), Zhuang B-C(庄炳昌). Soybean germplasm di-
versity and genetic variance detected by microsatellite mark-
ers. Acta Genet Sin (遗传学报), 2000, 27(7): 628−633(in
Chinese with English abstract)
[4] Chu M-X(储明星), Wang J-Z(王吉振), Wang A-G(王爱国),
Li L(李宁), Fu J-L(傅金恋). Cloning and sequencing of four
microsatellite loci in small tail han sheep. Acta Genet Sin (遗
传学报), 2002, 29(5): 402−405(in Chinese with English ab-
stract)
[5] Xue H-B(薛华柏 ), Qiao Y-S(乔玉山 ), Xu K-Y(许宽勇 ),
Zhang Z(章镇 ). DNA fragment isolation of genomic mi-
crosatellite in Prunus salicina by magnesphere. Acta Bot Bo-
reali-Occident Sin (西北植物学报), 2006, 26(7): 1320−1325
(in Chinese with English abstract)
[6] Chai S-C(柴守诚), Yuan H-Y(员海燕). Characteristics of
various repeated DNA sequences in higherplants. Acta Bot
Boreali-Occident Sin (西北植物学报), 1999, 19(3): 555−563
(in Chinese with English abstract)
[7] Xu L(徐莉), Zhao G-F(赵桂仿). Microsatellite DNA marker
and its application in genetic diversity research. Acta Bot Bo-
reali-Occident Sin (西北植物学报), 2002, 22(3): 714−722(in
Chinese with English abstract)
[8] Gao G-Q(高国庆), He Guohao, Li Y-R(李杨瑞). Microsatel-
lite enrichment from AFLP fragments by magnetic beads. J
Peanut Sci (花生学报), 2003, 32 (suppl): 272−276(in Chinese
with English abstract)
[9] Roose-Amsaleg C, Cariou-Pham E, Vautrin D, Tavernier R,
Solignac M. Polymorphic microsatellite loci in Linum usita-
tissimnm. Mol Ecol Notes, 2006, 6: 796−799
[10] Brown J, Hardwick L J, Wright A F. A simple method for
rapid isolation of microsatellites from yeast artificial chro-
mosomes. Mol Cell Probes, 1995, 9: 53−58
[11] Carol A R, Arcangeli L, Block A B. Development of 11 mir-
crosatellite loci for population studies in the swordfish
Xiphias gladius (Teleostei: Scombridae). Mol Ecol Notes,
2003, 3: 147−149
[12] Zane L, Bargelloni L, Patarnello T. Strategies for microsatel-
lite isolation: A review. Mol Ecol, 2002, 11: 1−16
[13] Xue H(薛辉), Wu X-B(吴孝兵), Yan P(晏鹏). Application of
microsatellite DNA in molecular ecology and strategies for
loci isolation. Chin J Appl Ecol (应用生态学报), 2005, 16(2):
385−389 (in Chinese with English abstract)
[14] Lu C-Y(鲁翠云), Sun X-W(孙效文), Cao J(曹洁), Liang
L-Q(梁利群). Microsatellite enrichment by magnetic beads in
silver carp (Hypophthalmichtys molitrix). J Agric Biotechnol
(农业生物技术学报), 2005, 13(6): 772−776(in Chinese with
English abstract)
[15] Shen F-J(沈富军), Phill W, Zhang Z-H(张志和), Stephanie S,
Kemp S J, Yue B-S(岳碧松). Enrichment of giant panda mi-
crosatellite markers using dynal magnet beads. Acta Genet Sin
(遗传学报), 2005, 32(5): 457−462(in Chinese with English
abstract)
[16] Sun X-W(孙效文), Lu C-Y(鲁翠云), Liang L-Q(梁利群).
Isolation of microsatellite with enrichment by magnetic beads
in grass carp, Ctenopharyngodon idella. J Fish China (水产
学报), 2005, 29(4): 482−486(in Chinese with English ab-
stract)
[17] Deng X(邓欣), Chen X-B(陈信波), Long S-H(龙松华), Wang
Y-F(王玉富). Genetic diversity analysis of ten flax cultivars
with RAPD markers. Plant Fiber Sci China (中国麻业科学),
2007, 29(4): 184−188(in Chinese with English abstract)
[18] Lunt D H, Hutchinson W F, Carvalho G R. An efficient
method for PCR-based isolation of microsatellite arrays
(PIMA). Mol Ecol, 1999, 8: 891−894
[19] Quan Y-C(全迎春), Sun X-W(孙效文), Liu W(刘伟), Liang
L-Q(梁利群), Lu C-Y(鲁翠云). Microsatellite enrichment by
magnetic beads in Silurus meriaionalis. J Fish China (水产学报),
2006, 30(2): 185−191(in Chinese with English abstract)
[20] Zane L, Bargelloni L, Patarnello T. Strategies for microsatel-
lite isolation:a review. Mol Ecol, 2002, 11: 1−16
[21] Weber J L. Informativeness of human (dC-dA)n·(dG-dT)n
polymorphisms. Genomics, 1990, 7: 524−530
[22] Orit G, Pearse D E, Avise J. Phylogenetic assessment of
length variation at a microsatellite locus. Proc Natl Acad Sci
USA, 1997, 94: 745−749
[23] Smulders M J M, Bredemeijer G, Rus-Kortekaas W, Arens P,
Vosman B. Use of short microsatellites from database se-
quences to generate polymorphisms among Lycopersicon es-
culentum cultivars and accessions of other Lycopersicon spe-
cies. Theor Appl Genet, 1997, 97: 264−272