全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(7): 1153−1159 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

基金项目: 陕西省教育厅基金项目(JH06238); 陕西省高校重点实验室重点项目(05JS48); 陕西省自然科学基金项目(2007c104)
作者简介: 赵宇玮(1977–), 男, 北京市人, 讲师, 博士, 专业植物生物技术。
*
通讯作者(Corresponding author): 贾敬芬(1938–), 女, 河北省深泽县人, 教授, 博士生导师, 主要研究方向为植物细胞工程。
E-mail: Jiajf38@nwu.edu.cn
Received(收稿日期): 2007-10-31; Accepted(接受日期): 2008-02-19.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.01153
青稞 HvBADH1基因的克隆及其转化烟草的初步研究
赵宇玮 郝建国 步怀宇 王英娟 贾敬芬*
(西北大学生命科学学院 / 陕西省生物技术重点实验室 / 西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室, 陕西西安 710069)
摘 要: 应用 RT-PCR 结合 RACE 技术, 从青稞总 RNA 中扩增得长度为 1 512 bp 的甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因
cDNA 全长编码序列。通过氨基酸同源性比对, 发现该序列的推定表达产物与大麦 BADH 同工酶 BBD2 的同源性为
98.4%, 而与小麦、玉米和水稻等禾本科作物的 BADH同源性分别为 97.0%、84.7%和 85.1%。将克隆到的青稞 cDNA
序列命名为 HvBADH1, 投递到 GenBank, 获得收录号 EF492983。HvBADH1可以在原核表达系统 TB1-pMAL c2x中
正常表达出分子量为 54.2 kD的多肽链。将 HvBADH1的编码 ORF, 插入到添加了植物表达 CaMV 35S启动子和 Nos
polyA终止子调控元件的植物表达载体 pCAMBIA1301质粒相应的克隆位点中, 构建了 HvBADH1基因的农杆菌植物
转化系统 LBA4404(pCAM-ba)。进而采用农杆菌介导法, 将 HvBADH1基因导入烟草中, 对所获得的潮霉素抗性烟草
株系进行 PCR、Southern blot和 RT-PCR等分子生物学检测, 结果表明, 在得到的 2个转基因株系中, HvBADH1基因
已整合到受体植物基因组中, 并且可以在 mRNA水平上进行转录。
关键词: 青稞; HvBADH1; 基因克隆; 遗传转化; 耐盐性; RT-PCR; RACE
Cloning of HvBADH1 Gene from Hulless Barley and Its Transformation
in Nicotiana tabacum
ZHAO Yu-Wei, HAO Jian-Gao, BU Huai-Yu, WANG Ying-Juan, and JIA Jing-Fen*
(College of Life Science, Northwest University / Shaanxi Provincial Key Laboratory of Biotechnology / Key Laboratory of Resource Biology and
Biotechnology in Western China, Ministry of Education, Xi’an 710069, Shaanxi, China)
Abstract: Glycine betaine is a nontoxic osmolyte accumulated in the cytoplasm of salt or drought stressed plants, marine animals,
and microorganisms. Betaine aldehyde dehydrogenase (BADH) catalyzes the final step in the synthesis of glycine betaine from
choline in many plants. In order to reveal the relationship between the BADH expression and salt stress resistance of hulless bar-
ley (Hordeum vulgare L. var. nudum Hook.f.), a 1 512 bp cDNA encoding BADH was cloned from hulless barley using the
methods of RT-PCR and RACE. This cDNA encoded a 54.2 kD protein containing 232 amino acid residues and HvBADH1 was
designated with the accession number of EF492983 in GenBank. HvBADH1 exhibited the highest homology (98.4%) in amino
acid sequence with BBD2 gene encoding an isoenzyme of BADH from barley. It also shared highly homology of 97.0%, 84.7%,
and 85.1% with BADH wheat, maize, and rice respectively. The HvBADH1 gene was inserted into pMAL c2x and transformed
into E.coli cells (TB1) for expression. The recombinant TB1 (harboring pMAL c2x-HvBADH1) cells and control TB1 (harboring
empty pMAL c2x) cells were then induced with IPTG. The results revealed that the recombinant E. coli cells could express a fu-
sion protein with molecular weight of 96.3 kD. This fusion protein was fused by maltose binding protein (MBP, about 42.1 kD)
and the peptide (about 54.2 kD) encoded by HvBADH1. The ORF of HvBADH1 was inserted between CaMV 35S promoter and
NOS polyA in T-DNA region of binary expression vector pCAMBIA1301. The recombinant plasmid, designated as pCAM-ba,
was transformed into Agrobacterium tumefaciens LBA4404. The HvBADH1 gene was transformed to tobacco mediated by Agro-
bacterium. Two hygromycin B (Hyg) resistant regenerated plant strains were selected. PCR detection and Southern blot analysis
indicated that all the Hyg resistant tobacco plants contained the alien BADH gene. RT-PCR analysis showed that HvBADH1 gene
normally expressed on the mRNA level in the transgenic tobacco plants. The results suggest that HvBADH1 gene is related with
1154 作 物 学 报 第 34卷

the salt tolerance in hulless barley and can express in transgenic plants.
Keywords: Hordeum vulgare L. var. nudum Hook.f.; HvBADH1; Gene clone; Genetic transformation; Salt-tolerant resistance;
RT-PCR; RACE
甜菜碱是广泛存在于生物界的一种组织相容性
的渗透调节剂[1-2]。许多高等植物, 特别是藜科和禾
本科植物, 在受到水/盐胁迫时积累大量甜菜碱。在
大麦 [3]和玉米 [4]中的研究结果表明甜菜碱在增强植
物抗盐性中起至关重要作用。高等植物体内甜菜碱
由胆碱经过连续两步不可逆氧化而合成。首先, 胆
碱单加氧酶(choline monooxigenase, CMO)催化胆碱
氧化合成甜菜碱醛; 继而在甜菜碱醛脱氢酶(betaine
aldehyde dehydrogenase, BADH)的作用下 , 被氧化
成甘氨酸甜菜碱[5]。通常认为, 植物体在盐胁迫条件
下内源甜菜碱积累量上升, 主要是通过上调 BADH
基因表达而实现[6-7]。传统农作物中耐盐性最强的是
大麦[8], 青稞(Hordeum vulgare L. var. nudum Hook.
f.)属于禾本科大麦属作物, 其突出的农艺特点是环
境适应性强, 在高海拔、高寒、缺水地区都能种植,
表现出极高的抗逆特性。甜菜碱积累量与大麦耐盐
性之间的密切关系已得到证实, Nakamura 等[9]的研
究结果表明不同品种大麦体内的甜菜碱积累量与品
种的耐盐性呈正相关。我们的实验通过 RT-PCR 结
合 RACE技术克隆到青稞 BADH基因 cDNA编码区,
并进一步构建了双元植物表达载体, 通过农杆菌介
导的叶圆盘法将 HvBADH1 导入烟草。为下一步研
究 HvBADH1 基因的表达特性及其与植物耐盐性的
关系奠定基础。
1 材料与方法
1.1 植物材料
青稞品种青 4 种子购自青海省西宁市农牧局; 烟
草(Nicotiana tabacum)品种秦烟 95 种子购自陕西省
烟草研究所。
1.2 青稞甜菜碱醛脱氢酶基因(HvBADH1)的克隆
1.2.1 cDNA 中间保守区的克隆和序列测定 选
取常规表面消毒后的青稞种子在无菌水浸润的滤纸
上室温萌发。萌发 7 d后, 用 200 mmol L−1 NaCl溶
液浇灌一次。72 h 后切取青稞幼苗叶片, 以 Trizol
法提取总 RNA, 并用 DNase I (RNase Free)去除其中
混杂的基因组 DNA, 使用 MBI 公司的 RevertAidTM
H Minus First Strand cDNA Synthesis kit #K1631
M-MLV cDNA 第一链合成试剂盒合成 cDNA 第一
链。参照大麦、小麦、玉米、菠菜、高粱、拟南芥
6 种植物的 BADH 基因保守区序列设计的一对简并
引物引发 PCR扩增青稞 BADH基因 cDNA中间保守
区,选用 TaKaRa公司的 LA Taq DNApolymase。简并
引物序列, APsen为 ATH ACN CCN Tgg AAY TAY
CC, APantisen为 ACT ggN CCR AAN ACY TCYTC,
H=ATC; N= AcgT; Y=CT; R=Ag。反应程序为: 94℃
预变性 180 s; 94℃变性 50 s, 50℃退火 40 s, 72℃延
伸 70 s, 35个循环; 72℃延伸 480 s。随机选择 PCR
产物和 pMD18-T载体质粒连接的重组质粒克隆, 由
大连 TaKaRa公司测序。
1.2.2 青稞 BADH 基因 3′端序列的克隆 按照
TaKaRa公司 3′-Full RACE Core set 1.0试剂盒说明书
进行青稞 BADH基因 cDNA 3′端序列的克隆, 青稞幼
苗的 NaCl胁迫处理、总 RNA提取和 PCR产物的克
隆、测序的方法同 1.2.1。3′-RACE的特异性 PCR引
物 Q3R序列为 CCACAATCACTgACATCAACAC。
1.2.3 青稞 BADH基因 5′端部分序列的克隆 用
1.2.1 方法提取 NaCl 胁迫处理的青稞总 RNA。在
RNA溶液中加入相当于总体积 7.5%的 DMSO, 99℃
热激 1 min, 冰浴 2~5 min。取适量变性后的总 RNA,
由购自 TaKaRa公司的 PrimeScript reverse transcrip-
tase 催化逆转录合成 cDNA 第一链, 反向序列定位
于中间保守区 5′端的特异性引物 Qrtp5 的序列为
gTCgACgTCAgg。逆转录反应程序为：55℃延伸 30
min; 42℃延伸 30 min; 70℃ 15 min中止反应。以逆
转录产物为模板 5′RACE[10]扩增青稞 BADH 基因 5′
端部分序列。
1.3 青稞 BADH基因 cDNA编码区的获得
根据 5′和 3′-RACE的结果并参考大麦 BADH同
工酶 BBD2 基因 cDNA 序列, 设计用于克隆青稞
BADH 基因的上游引物 Qbamh1 和下游引物 Qxba1,
Qbamh1 序列为 5′-CgggATCCATggTCgCgCCggCCA
AgATCC-3′; Qxba1 序列为 5′-gCTCTAgACTAgCCg
gAgCCTTgTAC-3′。用 1.2.3方法合成 cDNA第一链
为模板, 以 Qbamh1和 Qxba1为引物 PCR 扩增青稞
BADH 基因编码区序列。测序正确的 BADH-cDNA
第 7期 赵宇玮等: 青稞 HvBADH1基因的克隆及其转化烟草的初步研究 1155


序列被命名为 HvBADH1。
1.4 HvBADH1基因的原核表达
1.4.1 HvBADH1 基因的原核表达载体构建 将
HvBADH1 根据事先设计在引物两端的 BamH I 和
Xba I等酶切位点, 插入到 pMAL c2x质粒的多克隆
位点, 重组质粒记为 pMAL-Qba。取适量 pMAL-Qba
质粒转化宿主大肠杆菌 TB1 感受态细胞, 获得的携
带 pMAL-Qba 质 粒 的 TB1 大 肠 杆 菌 记 为
TB1(pMAL-Qba)。
1.4.2 HvBADH1 在大肠杆菌 TB1 中的诱导表达和
SDS-PAGE 检测 按 NewEngland 公司说明书进
行大肠杆菌 TB1(pMAL-Qba)的诱导表达和表达产
物的 SDS-PAGE。SDS-PAGE浓缩胶浓度为 5%, 分
离胶浓度为 10%。凝胶电泳胶片用考马斯亮蓝 R-250
染色, 光密度扫描仪扫描确认结果。
1.5 农杆菌介导的 HvBADH1基因对烟草的遗传
转化
1.5.1 HvBADH1 基因植物表达载体的构建 将
CaMV 35S启动子序列、HvBADH1和 NOS polyA终
止子序列串连在一起构建 HvBADH1 基因表达盒 ,
然后将其插入双元植物表达载体 pCAMBIA-1301质
粒 T-DNA 区 , 构建重组双元植物表达载体质粒
pCAM-ba(图 1)。用液氮冻融法将 pCAM-ba 质粒导
入农杆菌 LBA4404感受态细胞, 获得用于植物遗传
转化实验的工程农杆菌 LBA4404(pCAM-ba)。



图 1 植物双元表达载体 pCAM-ba质粒结构示意图
Fig. 1 The sketch map of the binary expression vector
plasmid of pCAM-ba

1.5.2 转 HvBADH1 基因烟草的获得 农杆菌
LBA4404(pCAM-ba)在附加 Str 100 μg mL−1、Rif 20
μg mL−1和 kan 50 μg mL−1的 YEB液体培养基中常
规活化, 培养至 OD600≈0.5。将烟草无菌苗叶片剪成
0.5 cm×0.5 cm 圆盘, 放入农杆菌悬液侵染 8~12
min, 共培养 2 d, 然后转至含 30 mg L−1潮霉素、300
mg L−1头孢霉素的 Y1培养基(附加 1 mg L−1 6-BA的
MS培养基)上, 温度 25℃±2℃, 光强 400 μmol m−2
s−1, 光照 16 h d−1, 诱导芽的分化。将分化后的小芽
转入 1/2 MS0 培养基继代和生根培养, 每 21 d继代
培养一次。再生苗经炼苗, 移栽至混合土(营养土和
沙土之比为 1∶1)中温室培养。
1.5.3 转基因苗 PCR 扩增分析 用十六烷基三
乙基溴化铵(CTAB)法分别提取烟草转基因苗和野
生型植株基因组 DNA。以 PCR检测 HvBADH1基因
和 hpt II基因在转基因植物基因组中的插入状况。
1.5.4 转基因苗 RT-PCR分析 用 1.2.1方法提取
烟草转基因苗和野生型植株总 RNA, 用 M-MLV 第
一链 cDNA 合成试剂盒进行逆转录。以 sscDNA 的
为模板, PCR扩增目的基因 HvBADH1。
1.5.5 转基因苗的 Southern blot杂交检测 分别
提取 30~40 μg 烟草转基因苗和野生型植株基因组
DNA, 以 HvBADH1基因中间 509 bp特异性序列为
探针, 按 Roche 公司的 DIG High Primer DNA La-
beling and Detection Starter Kit II试剂盒使用手册进
行 Southern blot, 质粒对照和基因组 DNA 均使用
EcoR I酶切。
2 结果与分析
2.1 HvBADH1 基因 cDNA 中间保守片段的克
隆、3′RACE和 5′RACE的实验结果
应用简并引物, 以 NaCl 胁迫下的青稞叶片总
RNA为模板, RT-PCR 扩增得到 728 bp扩增片段。
在 www.ncbi.nlm.nih.gov网站进行 Blast的结果显示
这个 cDNA序列与 GenBank中大麦、小麦、水稻、
玉米、菠菜 BADH 基因的同源性较高。该序列的
GenBank登录号为 DQ288724。根据已克隆出的中间
保守区序列设计特异引物进行 3′RACE, 扩增出 538
bp的 cDNA片段。采用 5′RACE法克隆目标基因 5′
端部分序列的实验最大可以得到约 450 bp的有效扩
增条带。

1156 作 物 学 报 第 34卷

2.2 HvBADH1 基因 cDNA 编码区的获得和序列
分析
用 RT-PCR 技术从青稞中扩增得到 HvBADH1
基因 cDNA编码区 ORF长度为 1 512 bp, 拼接先前
3′RACE获得的 3′UTR序列, 获得青稞 HvBADH1基
因 cDNA 全长 1 670 bp, 3′UTR 区有 2 个可能的
polyA加尾信号。在 GenBank上进行 Blast检索, 发
现该序列与大麦 BADH同工酶编码基因 BBD2序列
同源性高达 98.7%。应用 DNAStar 软件推定青稞
BADH 蛋白序列由 503 个氨基酸组成 , 在序列的
172~181 位置, 存在一个在不同物种醛脱氢酶中高
度保守的 VTLELGGKSP 十肽序列。表明实验获得
的 cDNA序列是青稞BADH基因编码序列,将其命名
为 HvBADH1, GenBank登录号为 EF492983。
青稞 HvBADH1 基因推定氨基酸序列与大麦、
水稻、小麦、玉米等 8个已报道高等植物 BADH氨
基酸序列聚类分析结果见图 2, 从中发现 , 青稞
BADH与大麦 BADH同工酶 BBD2相似性最高, 可
达 98.4%,而与最早报道的大麦 BADH 同源性最低,
仅 67.0%。



图 2 青稞 HvBADH1氨基酸序列与部分高等植物 BADH 基因
序列的进化树分析
Fig. 2 Phylogenetic analysis of HvBADH1 with BADH genes
from other plants
1: 大麦甜菜碱醛脱氢酶同工酶 BBD2; 2: 青稞甜菜碱醛脱氢酶;
3: 小麦甜菜碱醛脱氢酶; 4: 羊草甜菜碱醛脱氢; 5: 玉米甜菜碱
醛脱氢酶; 6: 假定的水稻甜菜碱醛脱氢酶同工酶; 7: 大麦甜菜
碱醛脱氢酶; 8: 水稻甜菜碱醛脱氢酶; 9: 苜蓿醛脱氢酶。
1: Hordeum vulgare BBD2; 2: HvBADH1; 3: Triticum aestivum
beyaine-aldehyde dehydrogenase; 4: Leymus chinensis
beyaine-aldehyde dehydrogenase; 5: Zea mays beyaine-aldehyde
dehydrogenase; 6: Oryza sativa putative beyaine-aldehyde
dehydrogenase; 7: Hordeum vulgare beyaine-aldehyde
dehydrogenase; 8: Oryza sativa beyaine-aldehyde dehydrogenase;
9: Medicago truncatula beyaine-aldehyde dehydrogenase.

2.3 HvBADH1基因的原核表达
对青稞 HvBADH1 基因进行原核表达 , SDS-
PAGE结果如图 3。经 IPTG诱导的 TB1(pMAL-Qba)
可以表达出 96.3 kD(青稞 BADH和麦芽糖结合蛋白
MBP)融合蛋白带。而经 IPTG诱导的 TB1(pMAL-c2x
空载体)可以表达出 42.1 kD的麦芽糖结合蛋白MBP
蛋白带。这表明, 青稞 HvBADH1可以在原核表达系
统内正常表达出预期分子量为 54.2 kD的蛋白质。



图 3 HvBADH1在大肠杆菌 TB1中表达的
SDS-PAGE电泳图谱
Fig. 3 Expressing of HvBADH1 in E.coli TB1,
detecting by SDS-PAGE
M: 中分子量蛋白质 marker; 1,8：未诱导的 TB1(pMAL-Qba);
2~5：IPTG诱导的 TB1(pMAL-Qba); 6：未诱导的 TB1(pMAL c
-2-X空载体); 7：IPTG诱导的 TB1(pMAL c -2-X空载体)。
M: Middle molecular weight protein marker; 1,8: Uninduced
TB1(pMAL-Qba); 2–5: IPTG induced TB1(pMAL-Qba);
6: Uninduced TB1(pMAL-c-2-X empty); 7: IPTG induced
TB1(pMALc-2-X empty).

2.4 HvBADH1 基因对烟草的遗传转化及转基因
株系的初步鉴定
应用农杆菌 LBA4404(pCAM-ba)植物转化系统
对秦烟 95进行遗传转化, 初步获得 2个潮霉素抗性
烟草再生苗系(图 4)。



图 4 转基因烟草苗的获得
Fig. 4 Obtaining of transgenic tobacco
A: 筛选中的潮霉素抗性烟草愈伤组织和芽; B: 基因烟草再生苗。
A: Hyq-resistant calli and buds of tobacco under selection;
B: Regenerated transgenic plantlet.

2.4.1 转基因株系的 PCR 检测 以野生型植株
及转基因苗的基因组DNA作为模板, 分别以潮霉素
B 抗性基因 (hpt II)阅读框 (509 bp)和目的基因
HvBADH1(1 512 bp)作为靶 DNA进行 PCR的结果表
明, 野生型植株基因组没有扩增信号, 2个转基因苗
基因组都能够扩增出预期的两种目标产物(图 5)。说
第 7期 赵宇玮等: 青稞 HvBADH1基因的克隆及其转化烟草的初步研究 1157


明 hpt II基因和 HvBADH1基因均已整合到受体植物
基因组中。
2.4.2 转基因苗中HvBADH1基因转录水平上表达的
RT-PCR检测 对烟草 1、2号转基因苗及野生型植
株进行 HvBADH1(1 512 bp)基因 RT-PCR扩增的结果
(图 6)显示, 野生型植株没有扩增信号, 而 2个转基因
苗的总 RNA逆转录产物都扩增出 1.5 kb目标产物。



图 5 HvBADH1(A)和 hpt II(B)基因在转基因苗基因组中
整合情况的 PCR检测
Fig.5 Intergration of HvBADH1 (A) and hpt II (B) genes in
transgenic plant’s genome detected by PCR
M: 1 kb DNA marker; 1: 野生型植株; 2: 1号转 HvBADH1基因烟
草苗; 3: 2号转 HvBADH1基因烟草苗。
M: 1 kb DNA marker; 1: wild type tobacco; 2: transganic tobacco
strain No.1; 3: transganic tobacco strain No.2.



图 6 HvBADH1在转基因苗中表达的 RT-PCR检测
Fig. 6 Expression of HvBADH1 in the transgenic plants
detected by RT-PCR
M: 1 kb DNA marker; 1: 野生型植株; 2: 1号转 HvBADH1基因烟
草苗; 3: 2号转 HvBADH1基因烟草苗。
M: 1 kb DNA marker; 1: wild type tobacco; 2: transganic tobacco
strain No.1; 3: transganic tobacco strain No.2.

2.4.3 转基因植物的 Southern blot杂交检测 分
别制备野生型及 2个经 PCR检验初步确定为转基因
苗的烟草植株基因组 DNA, 进行 Southern blot检测
(图 7)。可以看出, 野生型植物基因组 DNA 没有阳
性信号; 2 个转基因苗的基因组 DNA 中, 均出现阳
性杂交信号。说明这 2 个假定转基因株系均是真实
的转基因植株, HvBADH1基因已经整合到烟草的基
因组中。


图 7 2株 T0代转基因植株的 Southern blot分析
Fig. 7 Southern blot analysis of two T0 generation
transgenic plants
1: 无 DNA阴性对照; 2: pCAM-ba质粒 DNA阳性对照; 3: 野生
型植株; 4~5: 1~2号 T0代转基因植株。
1: negative control; 2: positive control of plasmid pCAM-ba;
3: wild-type plant; 4–5: T0 generation transgenic plants No.1 and No.2.

3 讨论
目前, 利用常规 PCR 技术结合 3′和 5′RACE 技
术扩增、克隆基因全长 cDNA 序列的研究有许多成
功的报道[11-16], 我们的研究结果显示该方案在扩增
5′端富含 GC的 mRNA全序列时具有一定的局限性。
其原因可能在于以下两个方面：(1)实验选择的预处
理条件并不是目标基因表达的最适诱导条件; (2)逆
转录酶不能在通常实验条件下顺利通过 mRNA近 5′
端的复杂二级结构区, 导致第一链 cDNA 质量低,
全长 cDNA 相对不足。我们尝试用半定量 RT-PCR
实验来摸索青稞 BADH 表达的最佳诱导条件, 内参
基因为 EF1α。分别取 200 mmol L−1 NaCl处理 12、
24、48、72和 96 h的青稞种子苗叶片总 RNA为模
板, RT-PCR 扩增 HvBADH1 基因中间保守片段和内
参基因(图 8)。结果用 200 mmol L−1 NaCl胁迫处理
48~72 h, HvBADH1 基因的表达明显上调, 当 NaCl
处理时间延长至 96 h时HvBADH1基因的表达下调。
与此相吻合的是, 有报道认为[17], BADH基因的表达
受较低水平 NaCl 胁迫的诱导, 受高盐胁迫的抑制;
Yi等[18]的研究结果也显示, 200 mmol L−1 NaCl处理
大麦种子苗 48 h可以提高 BADH的活性, 而处理 96
h 则抑制叶片中 BADH 的活性。据此, 可以确定
HvBADH1 基因最佳诱导表达条件是 200 mmol L−1
NaCl处理 72 h。在此诱导条件下, 我们应用 3′RACE
技术成功克隆到 HvBADH1 基因 3′端的 cDNA 全序
1158 作 物 学 报 第 34卷




图 8 HvBADH1基因的半定量 RT-PCR表达分析
Fig. 8 Expression analysis of HvBADH1 by semi-
quantitative RT-PCR
M: 1 kb DNA marker; 1~5: 200 mmol L−1 NaCl处理 12、24、48、
72和 96 h青稞 HvBADH1基因中间区段 RT-PCR扩增; 6~10: 200
m mol L−1 NaCl处理 12、24、48、72和 96 h青稞 EF1α
基因 RT-PCR扩增。
M: 1 kb DNA marker; 1–5: products of RT-PCR amplification of
HvBADH1 gene from the H. vulgare L. var. nudum Hook.f plants
treated with 200 mmol L−1 NaCl for 12, 24, 48, 72, and 96 h; 6–10:
products of RT-PCR amplification of EF1α gene from the H. vul-
gare L. var. nudum Hook.f plants treated with 200 mmol L−1 NaCl
for 12, 24, 48, 72, and 96 h.

列。为了获得 HvBADH1基因的全长 cDNA序列, 我
们尝试了 99℃预处理总 RNA 使其先变性然后进行
逆转录反应和使用适合于高 GC含量模板的 LA Taq
酶＋GC buffer进行 PCR反应等改良方案, 但没能得
到完整的青稞 BADH基因 5′端 cDNA序列。我们又
尝试使用了两种耐热逆转录酶 , 细菌来源的
BcaBEST polymerase和改良的鼠源 M-MLV: Prime-
Script reverse transcriptase 分别在 65℃和 55℃催化
cDNA 第一链的合成, 以提高 mRNA 5′端的逆转录
效率。结果 5′RACE的 PCR有效延伸距离、扩增反
应的精确性和特异性得到了一定程度的提高。使用
Cheng等[19]报道的 RNase H-鼠白血病毒(M-MLV)逆
转录酶和 Meyers等[20]报道的使用嗜热 DNA多聚酶
如 rTth(Perkin-Elmer)和 TetZ(Amersham)在高温(一
般 60℃到 70℃)中有效逆转录 mRNA 的方法, 可以
克服由于高 GC/AU 比 mRNA 形成二级结构而导致
在逆转录时产生截短的 cDNA 这一难题。这与我们
使用耐热逆转录酶可以提高 BADH基因部分 5′端序
列克隆效率的结果相吻合。由于已克隆的 HvBADH1
基因 cDNA 中间保守片段与 2001 年发现的在大麦
BADH 同工酶 BBD2 基因[21]cDNA 对应区域的序列
同源性达 98%, 我们推测 HvBADH1 基因的结构应
该与大麦 BBD2基因高度相似, 进而根据 BBD2基因
cDNA 编码框序列设计一条上游引物 Qbamh1, 结合
根据已克隆的青稞 BADH 基因 3′序列设计的下游引
物 Qxba1运用 RT-PCR技术成功克隆到 1 512 bp的
HvBADH1 基因 cDNA-全长编码框。值得注意的是,
总 RNA 的 99℃预变性、使用耐热逆转录酶、在
55~65℃进行逆转录及使用 LA Taq DNA聚合酶进行
PCR 扩增是克隆 HvBADH1 基因 cDNA 全长编码序
列的必要条件, 而这些措施很可能是应用 RACE 及
其衍生技术克隆其他mRNA5′端富含 GC/AU的基因
的有效手段。
HvBADH1基因的表达受 200 mmol L−1 NaCl胁
迫诱导(图 7)及其在原核细胞中可以正常表达的结
果显示, 该基因具有应用于作物耐盐性状改良基因
工程的可能。用农杆菌介导的叶圆盘法将克隆到的
HvBADH1基因导入烟草, 成功获得 2个转基因株系,
PCR、Southern blot和 RT-PCR检测显示 HvBADH1
基因已经成功整合到转基因烟草的基因组中, 并且
可以进行转录水平的表达。转基因苗后代的抗性分
离比和耐盐性分析工作正在进行中。
4 结论
运用 RT-PCR 结合 RACE 技术克隆了青稞甜菜
碱醛脱氢酶基因HvBADH1, 其表达产物与大麦甜菜
碱醛脱氢酶同工酶 BBD2 的同源性为 98.4%, 而与
小麦、玉米和水稻的 BADH 同源性分别为 97.0%、
84.7%和 85.1%。HvBADH1 基因可以在原核细胞内
正常表达出分子量为 54.2 kD 的蛋白质。构建
HvBADH1基因的双元植物表达载体 pCAM-ba质粒,
进而应用工程农杆菌 LBA4404(pCAM-ba)对烟草进
行了遗传转化。获得 2 个潮霉素抗性烟草苗 ,
HvBADH1 基因已经成功整合到受体烟草的基因组
中, 并且可以进行 mRNA水平的转录表达。
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