全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2010, 36(7): 1114−1125 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由北京市农业育种基础研究创新平台项目 II (D08070500690801)和国家科技支撑计划项目(2006BAD01A02-4)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 赵昌平, E-mail: bjhwc2003@yahoo.com.cn, Tel: 010-51503968
第一作者联系方式: E-mail: wanglx53@263.net, Tel: 010-51503966 **共同第一作者
Received(收稿日期): 2010-02-03; Accepted(接受日期): 2010-04-12.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2010.01114
小麦区试品系 DUS测试的分子标记
王立新 常利芳** 李宏博 季 伟 刘丽华 赵昌平*
北京市农林科学院 / 北京杂交小麦工程技术研究中心, 北京 100097
摘 要: 为了确定测试小麦(Triticum aestivum L.)区试品系特异性、一致性、稳定性(DUS)的分子标记, 采用 156个来
自我国不同麦区的品种对 SSR、EST-SSR和 AFLP-SCAR标记的 1334对引物进行筛选, 根据在染色体上分布均匀、
多态性信息指数较高、带型清晰、不同等位变异的带型易于区分及 PCR 产物稳定的原则, 筛选出 105 对小麦品种
DUS测试的分子标记引物, 包括 63对 SSR引物、21对 EST-SSR引物和 21对 AFLP-SCAR引物, 可以检测 122个位
点的 754个等位变异, 平均每条染色体上被检测位点 5.8个, 平均每个位点包含 7.2个等位变异。根据 DUS测试的需
求、引物的染色体分布、PIC 值大小和带型特点, 将 105 对引物分为 21 对核心引物、29 对一级备用引物和 55 对二
级备用引物。核心引物分辨力较高, 可以完成约 80%品系的特异性检测, 约 95%品系的种子纯度检测和约 60%品系
的一致性、稳定性检测; 备用引物用于确定品系 DNA位点纯合率和相似品种(系)之间的遗传相似系数, 以判断 DNA
指纹相同或相似的品种(系)之间的相似性和特异性, 评价核心标记中具有非纯位点的品系的 DNA 位点纯合度, 同时
完成核心引物未能完成的少数品系的种子纯度检测。通过在 2006—2007、2007—2008、2008—2009年度对 464个冬
小麦区试品系 DUS测试中的应用, 证明 105对引物具有很好的代表性和实用性, 可以完成 90%以上参试品系的 DUS
检测。
关键词: 小麦; DUS测试; 分子标记; DNA指纹
Molecular Markers for Estimating Distinctness, Uniformity, and Stability of
Wheat Lines in Regional Trials
WANG Li-Xin, CHANG Li-Fang**, LI Hong-Bo, JI Wei, LIU Li-Hua, and ZHAO Chang-Ping*
Beijing Engineering and Technique Research Center for Hybrid Wheat / Beijing Academy of Agricultural and Forestry Sciences, Beijing 100097, China
Abstract: To determine the molecular markers for testing the distinctness, uniformity, and stability (DUS) of wheat (Triticum
aestivum L.) lines in regional trials, 156 wheat cultivars were used to screen 1 334 pairs of primers of SSR, EST-SSR, and
AFLP-SCAR markers. According to the even distribution of molecular markers on 21 wheat chromosomes, the higher polymor-
phism information content (PIC), the clear PCR bands, the easy discrimination of different alleles, and the stable PCR amplifica-
tion, 105 pairs of primers, including 63 pairs of SSR primers, 21 pairs of EST-SSR primers, and 21 pairs of AFLP-SCAR primers,
were selected for wheat cultivar (lines) DUS testing. A total of 754 alleles at 122 loci can be identified with 105 pairs of primers,
with 5.8 loci per chromosome and 7.2 alleles per locus on average. The three kinds of molecular markers can amplify the DNA
fragments that are inside/outside of genes and repeative/non-repetitive sequences. The 105 pairs of primers were classified into 21
pairs of core primers and 84 pairs of standby primers based on their pattern definition, distribution on 21 chromosomes, and PIC
value. The 21 core primers distributing on 21 chromosomes could determine the distinctness test for about 80% of total cultivars
(lines), the seed purity test for 95%, and the uniformity and stability test for 60%. The 84 standby primers were used as the first
grade (29 pairs) and the second grade (55 pairs) to the homozygous DNA locus ratio of lines with no-homozygous loci of core
markers and the genetic similarities or the distinctness of similar cultivars (lines) pairs revealed by the core primers. At the same
time, we determined the seed purity for the other 5% of lines. These 105 pairs of primers could finish DUS test for more than 90%
of lines in the winter wheat regional trials in 3 cropping seasons from 2006 to 2009. Although less than 10% of lines should be
evaluated in combination with phenotypic identification in the field, the effectiveness and efficiency of the 105 pairs of primers
are satisfactory in bulk screening for wheat DUS test.
Keywords: Wheat; DUS; Molecular markers; DNA fingerprint
第 7期 王立新等: 小麦区试品系 DUS测试的分子标记 1115


植物新品种必须具备特异性、一致性和稳定性
(distinctness, uniformity, and stability, DUS), 才能获
得品种权。现行的 DUS测试依据国家标准考察品种
的表型和主要农艺性状, 以此判断测试品种是否具
备特异性、一致性和稳定性。自相关标准颁布以来,
在新品种 DUS测试中起着重要作用。但因存在鉴定
周期长、易受环境影响、测试性状多、工作量大等
问题[1], 无法适应大量品种的测试需求。而分子标记
检测技术因具有测试周期短、不受环境影响和季节
限制、供选择的标记数量多、可以进行高通量测试
分析的优势, 已经逐步用于新品种鉴定、种子纯度
及品种真实性检测[2-5]。目前, 我国已颁布了采用分
子标记技术鉴定玉米、水稻品种的农业行业标准 ,
但尚未颁布小麦的相关标准。本中心为建立小麦品种
DUS 测试的分子标记技术体系开展了各项研究[4-9],
其中, 筛选一套具有较高多态性、代表性、稳定性
的分子标记是建立这一体系的基础。
我国小麦品种 DUS测试的国标《植物新品种特
异性、一致性和稳定性测试指南——普通小麦》
(GB/T19557.2-2004)规定 : 在进行品种的特异性测
试时, 被测试品种有 1 个质量性状或 2 个及 2 个以
上数量性状与近似品种达到差异; 或 1 个数量性状
与近似品种相差 2 个及 2 个以上代码, 即可判定测
试品种与近似品种具有特异性。而在以分子标记为
基础的测试体系中, 是以两品种DNA位点比对结果
来判断品种间是否具有特异性的 [5,10-14], 因此要求
检测品种特异性的核心标记应具有较高的分辨率和
代表性 , 最好能与表型性状之间有一定的相关性 ,
使检测结果最大程度的与田间特异性测试结果相吻
合。但目前小麦主要表型性状和农艺性状的分子标
记较少 , 且多是显性标记 , 多态性低 , 只能作为品
种特异性检测的辅助标记, 若要准确判断品种是否
具有特异性则必须筛选分辨率较高的分子标记。
随着分子标记技术的发展, 多种类型的分子标
记被开发应用, 但并非所有的分子标记都适用于品
种 DUS测试。为了使检测结果更加科学、准确, 必
须筛选具有较高多态性、带型清晰、不同等位变异
易于识别、重复性好、在各条染色体上均匀分布的
分子标记, 且标记之间不可存在紧密连锁。在各种
分子标记中, SSR (simple sequence repeats) 标记具
有多态性高、呈共显性遗传、重复性好、成本低廉、
实验周期短等优点, 是目前品种鉴定中应用最多的
分子标记[10-13]。EST-SSR (expressed sequence tags-
simple sequence repeats)是基因表达区域的 SSR标记,
可以反映品种间基因序列的多样性[14]。本中心自主
开发的 AFLP-SCAR (amplified fragment length poly-
morphism-sequence characterized amplified region)标
记[15-16]带型清晰、特异性高、操作简便, 且弥补了
AFLP 标记的缺陷, 可以检测与 SSR 标记不同区域
的 DNA位点。为了更加全面、真实、快速地反映品
种的基因型, 本研究通过对大量的 SSR、EST-SSR
和 AFLP-SCAR 标记的比较, 确定了一套在小麦染
色体上均匀分布、PIC 值高、带型清晰、易于区别
等位变异间带型差异、PCR 产物稳定的分子标记,
并在 2006—2007、2007—2008 年度国家冬小麦区
试、2008—2009年度国家、北京市、河北省冬小麦
区试品系的 DUS测试中应用, 证明了这套分子标记
具有实用性和代表性。
1 材料与方法
1.1 试验材料
小麦品种(系)共 759 个, 用于核心引物筛选的
为 11个系谱差异较大的作图群体亲本和 145个来自
我国不同麦区的审定品种 , 其余 603 个分别是
2006—2007、2007—2008年度国家冬小麦区域试验
品系、2008—2009年度国家、北京市、河北省冬小
麦区域试验品系和近几年的审定品种, 用于核心引
物的实用性验证。采用简化 CTAB 法[6]提取小麦品
种的基因组 DNA。
1.2 引物筛选及 PCR扩增
选用分布于小麦全基因组的 1 334对引物, 其
中 SSR引物 778对、EST-SSR引物 284对和 AFLP-
SCAR引物 272对(表 1)。所有引物均由北京赛百盛
基因技术有限公司合成。
PCR反应体系 20 μL, 含 10×PCR buffer 2 μL,
10 mmol L−1 dNTP 0.3 μL, 1.25 μmol引物 4 μL, 2 U
μL−1 Taq DNA聚合酶 0.5 μL, 10 ng μL−1模板 DNA 6
μL, 超纯水 7.2 μL。10×PCR buffer、dNTP 和 Taq
DNA 聚合酶均购自北京鼎国生物技术有限责任公
司。反应程序为 94℃预变性 5 min, 94℃变性 30 s, 退
火 1 min, 72℃延伸 30 s, 35或 45个循环, 72℃延伸 5
min, 10℃保存。根据引物选择不同退火温度(表 2)。
PCR 产物经 6%聚丙烯酰胺变性凝胶电泳分离, 以
2 000 V电压电泳 1.5~3.0 h。凝胶染色为简化硝酸银
染色法[6]。
首先用 11 个系谱差异较大的品种对所有引物
1116 作 物 学 报 第 36卷

表 1 引物类型及其来源
Table 1 The primer categories and their origins
引物类型
Primer type
引物系列
Primer series
引物对数
Primer pair
来源
Reference
BARC 122 Perry Cregan (USDA), http://www.scabusa.org
CFA 28 Pierre Sourdille (INRA), http://wheat.pw.usda.gov
CFD 99 Pierre Sourdille (INRA), http://wheat.pw.usda.gov
DP 14 Li et al. [17]
GDM 32 Pestsova et al. [18]
GWM 204 Röder et al. [19]
SSR
WMC 279 http://wheat.pw.usda.gov


CNL 44 http://wheat.pw.usda.gov/itmi/est-ssr/cornell/
CWEM 46 http://wheat.pw.usda.gov/itmi/est-ssr/
CWM 31 Gao [20]
KSUM 85 http://wheat.pw.usda.gov/itmi/est-ssr/cornell/
SWES 47 Chen et al. [21]
EST-SSR
WES 31 Chen et al. [22]

AFLP-SCAR BHW 272 Wang et al. [16]

进行初筛, 选出带型清晰、具有多态性的引物。入
选引物用 48个审定品种复筛, 除评价带型清晰度、
多态性高低外, 重点考察不同等位变异的带型是否
易于区分。入选引物用 145个品种决选, 要求入选
引物在染色体上分布均匀、带型清晰、不同等位变
异的带型易于区分、PCR产物稳定, 并且 SSR引物
的 PIC≥0.5, EST-SSR和 AFLP-SCAR引物的 PIC≥
0.3, 最终确定一套引物。
1.3 扩增产物分析
采用 Wang 等[7]的方法检测位点的各个等位变
异, 并按带型编号。
PIC = 1−Σfi2, 其中 fi为 i位点的基因频率[23]。
按照 Nei 等[23]的方法计算品种(系)间的相似系
数。GSij =2Nij/(Ni+Nj)。式中 Nij为两品种(系)相同带
型的 DNA位点数目, Ni、Nj分别为 i和 j两品种(系)
相比对的 DNA位点总数。
按照Wang等[9]的方法统计品种的非纯 DNA位
点, 计算 DNA位点纯合率。DNA位点纯合率(%) =
(检测 DNA位点总数−非纯 DNA位点数)/检测 DNA
位点总数×100%。
1.4 农艺性状的考察
按国标“植物新品种特异性、一致性和稳定性测
试指南—普通小麦”(GB/T19557.2-2004)的方法, 每
份材料考察 30~50个单株的株高、株型、旗叶角度、
旗叶长宽、茎叶蜡质、抽穗期、单株有效穗数、穗
型、穗部蜡质、芒性、穗长、每穗小穗数、不孕小
穗数、每穗粒数、粒色、粒型、粒质和千粒重。
2 结果与分析
2.1 小麦区试品系 DUS测试的分子标记
2.1.1 分子标记的筛选 利用 156个小麦品种对
1 334对引物进行筛选与评价, 筛选了 105对作为小
麦区试品系 DUS 测试的引物(表 2), 其中 Genomic-
SSR引物 63对、EST-SSR引物 21对和 AFLP-SCAR
引物 21 对, 检测到 122 个 DNA 位点的 754 个等位
变异, 平均每条染色体上被检测位点 5.8个, 平均每
个位点含有 7.2个等位变异 , 说明这套引物具有较
好的鉴别能力。在检测到的 122个 DNA位点中, 除
17个尚未定位外, 其余位点均匀分布在小麦 21条染
色体上, 且各个位点间不存在紧密连锁[24]。大多数
染色体上被检测位点为 3~6 个, 因有多位点引物之
故, 少数染色体上被检测位点较多, 如 1A、1B、5B、
7B染色体上分别有 7、10、8、7个位点。
在 105对引物中, Genomic-SSR引物的 PIC值平
均为 0.76, EST-SSR和 AFLP-SCAR引物的平均 PIC
值分别为 0.53和 0.57 (表 3)。与 Genomic-SSR标记
相比, EST-SSR和 AFLP-SCAR标记的分辨能力稍差,
但 EST-SSR 标记是基因转录区的重复序列 DNA,
AFLP-SCAR标记为非重复序列 DNA, 3种标记相结
合可以检测到小麦基因组不同区域的多态性。
105 对引物包括 95 对单位点引物和 10 对多位
点引物。单位点引物的产物带型简单, 各种等位变

第 7期 王立新等: 小麦区试品系 DUS测试的分子标记 1117


表 2 105对引物的详细信息
Table 2 The detailed information of 105 pairs primers
引物
Primer
引物类型
Primer type
位点数目
Locus No.
染色体位置
Chromosomal
location
等位变异
数目
Allele No.
PIC值
PIC value
退火
温度
Tm (℃)
片段大小
Fragment size
(bp)
引物级别
Primer level
cwm65 EST-SSR 1 1A 7 0.73 65 220−260 core
barc80 Genomic-SSR 1 1BL 6 0.65 65 100−125 core
cfd72 Genomic-SSR 1 1DM 7 0.68 65 210−240 core
gwm294 Genomic-SSR 1 2AL 14 0.79 65 50−120 core
gwm429 Genomic-SSR 1 2BS 11 0.76 58 190−230 core
gwm261 Genomic-SSR 1 2DS 11 0.74 65 160−200 core
gwm155 Genomic-SSR 1 3AL 9 0.77 60 120−160 core
gwm285 Genomic-SSR 1 3BS 12 0.76 65 210−250 core
gdm72 Genomic-SSR 1 3DL 8 0.74 60 110−150 core
gwm610 Genomic-SSR 1 4AL 5 0.62 60 160−175 core
ksum62 EST-SSR 1 4B 8 0.82 65 160−220 core
barc91 Genomic-SSR 1 4DL 10 0.78 60 110−160 core
cwem40 EST-SSR 1 5A 9 0.79 58 110−180 core
gwm67 Genomic-SSR 1 5BS 7 0.66 60 70−100 core
cfd29 Genomic-SSR 1 5DL 12 0.85 63 180−200 core
gwm334 Genomic-SSR 1 6AS 18 0.83 50 100−150 core
barc198 Genomic-SSR 1 6BL 11 0.75 65 110−160 core
cfd76 Genomic-SSR 1 6DL 11 0.84 68 140−170 core
cfa2028 Genomic-SSR 1 7AS 7 0.61 65 220−240 core
gwm333 Genomic-SSR 1 7BL 6 0.67 63 About 150 core
gwm437 Genomic-SSR 1 7DL 13 0.67 50 90−140 core
bhw14 AFLP-SCAR 1 1A 2 0.35 63 81−84 1st-grade standby
cwm75 EST-SSR 1 1A 4 0.50 65 21−240 1st-grade standby
ksum182 EST-SSR 1 1A 4 0.53 65 About 185 1st-grade standby
cnl150 EST-SSR 1 1B 4 0.50 63 About 200 1st-grade standby
barc240 Genomic-SSR 1 1BL 8 0.70 63 240−280 1st-grade standby
cwm170 EST-SSR 1 1D 2 0.37 65 About 240 1st-grade standby
cwm334 EST-SSR 1 2A 3 0.53 65 175−180 1st-grade standby
wmc764 Genomic-SSR 1 2BS 7 0.81 65 130−180 1st-grade standby
ksum73 EST-SSR 1 2D 3 0.55 60 About 180 1st-grade standby
swes185 EST-SSR 1 3B 4 0.58 65 180−190 1st-grade standby
gwm566 Genomic-SSR 1 3BS 7 0.76 58 120−140 1st-grade standby
gwm161 Genomic-SSR 1 3DS 8 0.69 60 150−170 1st-grade standby
ksum134 EST-SSR 1 4A 2 0.36 65 250−280 1st-grade standby
wmc468 Genomic-SSR 1 4AL 12 0.84 60 130−170 1st-grade standby
bhw135 AFLP-SCAR 1 4B 2 0.46 60 About 180 1st-grade standby
gwm495 Genomic-SSR 1 4BL 9 0.75 65 150−180 1st-grade standby
cfa2155 Genomic-SSR 1 5AL 5 0.74 65 220−240 1st-grade standby
1118 作 物 学 报 第 36卷

(续表 2)
引物
Primer
引物类型
Primer type
位点数目
Locus No.
染色体位置
Chromosomal
location
等位变异
数目
Allele No.
PIC值
PIC value
退火
温度
Tm (℃)
片段大小
Fragment size
(bp)
引物级别
Primer level
wes26 EST-SSR 1 5B 2 0.38 65 160−175 1st-grade standby
cwm232 EST-SSR 1 5BL 2 0.36 65 About 185 1st-grade standby
cfd8 Genomic-SSR 1 5DL 7 0.66 68 150−160 1st-grade standby
gwm570 Genomic-SSR 1 6AL 8 0.74 63 120−150 1st-grade standby
gwm325 Genomic-SSR 1 6DS 8 0.76 62 130−150 1st-grade standby
gwm469 Genomic-SSR 1 6DS 9 0.80 68 150−180 1st-grade standby
swes209 EST-SSR 1 7B 4 0.63 60 About 300 1st-grade standby
gwm297 Genomic-SSR 1 7BL 9 0.75 65 130−180 1st-grade standby
wmc702 Genomic-SSR 1 7DS 8 0.80 60 150−190 1st-grade standby
bhw15 AFLP-SCAR 1 unknown 3 0.61 63 115 1st-grade standby
bhw163 AFLP-SCAR 1 unknown 2 0.50 55 118 1st-grade standby
swes228 EST-SSR 1 unknown 3 0.30 65 130−145 1st-grade standby
cwm593 EST-SSR 1 1A 2 0.36 65 110−125 2nd-grade standby
barc17 Genomic-SSR 1 1AL 8 0.77 60 250−280 2nd-grade standby
barc28 Genomic-SSR 1 1AS 6 0.67 65 250−280 2nd-grade standby
bhw3 AFLP-SCAR 1 1B 2 0.49 63 54 2nd-grade standby
bhw36 AFLP-SCAR 1 1B 2 0.48 60 97 2nd-grade standby
bhw6 AFLP-SCAR 1 1B 2 0.50 58 67 2nd-grade standby
cnl105 EST-SSR 1 1B 2 0.37 60 110−140 2nd-grade standby
cnl134 EST-SSR 1 1B 6 0.76 65 200−250 2nd-grade standby
gwm268 Genomic-SSR 1 1BL 19 0.82 63 230−250 2nd-grade standby
bhw18 AFLP-SCAR 1 2A 4 0.48 55 151 2nd-grade standby
gwm339 Genomic-SSR 2 a: 2AS b: 2AS
a: 8
b: 7 0.82 50 130−170
2nd-grade
standby
gwm120 Genomic-SSR 1 2BL 10 0.84 62 130−160 2nd-grade standby
barc168 Genomic-SSR 1 2DS 4 0.56 63 150−180 2nd-grade standby
gwm539 Genomic-SSR 1 2DS 13 0.83 58 130−170 2nd-grade standby
wmc532 Genomic-SSR 1 3AS 8 0.59 63 160−200 2nd-grade standby
bhw123 AFLP-SCAR 1 3B 2 0.32 55 134 2nd-grade standby
ksum29 EST-SSR 1 3B 4 0.20 65 180−200 2nd-grade standby
wmc326 Genomic-SSR 1 3BL 9 0.76 65 170−210 2nd-grade standby
gwm645 Genomic-SSR 1 3DL 12 0.89 60 135−170 2nd-grade standby
gwm160 Genomic-SSR 2 One: 4AL Another: unknown
a: 8
b: 4
a: 0.49
b: 0.52 60 170−200
2nd-grade
standby
barc20 Genomic-SSR 1 4BL 6 0.74 68 180−210 2nd-grade standby
wmc349 Genomic-SSR 1 4BS 7 0.57 65 85−110 2nd-grade standby
第 7期 王立新等: 小麦区试品系 DUS测试的分子标记 1119


(续表 2)
引物
Primer
引物类型
Primer type
位点数目
Locus No.
染色体位置
Chromosomal
location
等位变异
数目
Allele No.
PIC值
PIC value
退火
温度
Tm (℃)
片段大小
Fragment size
(bp)
引物级别
Primer level
wmc457 Genomic-SSR 1 4DL 4 0.58 65 160−170 2nd-grade standby
wmc720 Genomic-SSR 1 4DS 13 0.81 60 100−140 2nd-grade standby
cwem44 EST-SSR 1 5A 4 0.74 58 50−70 2nd-grade standby
gwm304 Genomic-SSR 1 5AS 16 0.80 65 200−230 2nd-grade standby
bhw124 AFLP-SCAR 1 5B 2 0.33 60 76 2nd-grade standby
bhw129 AFLP-SCAR 1 5B 2 0.48 65 140 2nd-grade standby
barc59 Genomic-SSR 1 5BL 6 0.76 65 160−200 2nd-grade standby
barc21 Genomic-SSR 1 5BS 7 0.65 65 200−215 2nd-grade standby
barc4 Genomic-SSR 1 5BS 8 0.80 65 130−220 2nd-grade standby
gwm272 Genomic-SSR 2 One: 5DL Another: unknown
a: 5
b: 3 0.70 50 120−150 2nd-grade standby
bhw13 AFLP-SCAR 1 6A 2 0.47 63 52 2nd-grade standby
gwm169 Genomic-SSR 1 6AL 8 0.70 60 180−235 2nd-grade standby
gwm617 Genomic-SSR 1 6AL 11 0.76 65 100−180 2nd-grade standby
cnl138 EST-SSR 1 6B 10 0.85 65 180−250 2nd-grade standby
wmc494 Genomic-SSR 1 6BS 9 0.67 65 200−230 2nd-grade standby
wmc486 Genomic-SSR 1 6BS 6 0.71 65 195−215 2nd-grade standby
bhw20 AFLP-SCAR 1 7A 2 0.43 58 151 2nd-grade standby
barc174 Genomic-SSR 1 7AS 7 0.76 65 160−230 2nd-grade standby
wmc603 Genomic-SSR 1 7AL 10 0.74 65 90−120 2nd-grade standby
gwm344 Genomic-SSR 1 7BL 8 0.61 60 130−150 2nd-grade standby
gwm44 Genomic-SSR 1 7DS 12 0.84 63 160−210 2nd-grade standby
wmc506 Genomic-SSR 1 7DS 14 0.68 65 180−230 2nd-grade standby
cfd65 Genomic-SSR 4
a: 1D
b: 1B
c: unknown
d: unknown
a: 8
b: 2
c: 2
d: 2
a: 0.70
b: 0.25
c: 0.23
d: 0.18
63 150−200 2nd-grade standby
gwm614 Genomic-SSR 2 a: 2BS b: 2AS
a: 8
b: 7
a: unknown
b: 0.73 60 110−170 2nd-grade standby
wmc264 Genomic-SSR 2 a: 3AL b: unknown
a: 11
b: 2
a: 0.82
b: 0.49 68 120−150 2nd-grade standby
bhw120 AFLP-SCAR 3
a: 4A
b: 4A
c: 3D
a: 2
b: 3
c: 2
a: 0.39
b: unknown
c: 0.5
60 130−160 2nd-grade standby
bhw17 AFLP-SCAR 3
a: 7B
b: 7B
c: 5D
a: 2
b: 2
c: 2
a: 0.43
b: 0.47
c: low
58 81 2nd-grade standby
bhw171 AFLP-SCAR 4
a: unknown
b: 2B
c: unknown
d: 7B
a: 2
b: 2
c: 2
d: 2
a: 0.27
b: 0.50
c: 0.50
d: 0.16
58 110−155 2nd-grade standby
bhw11 AFLP-SCAR 1 unknown 2 0.32 65 101 2nd-grade standby
bhw137 AFLP-SCAR 1 unknown 2 0.36 58 211 2nd-grade standby
bhw138 AFLP-SCAR 1 unknown 2 0.48 55 118 2nd-grade standby
bhw162 AFLP-SCAR 3 unknown
a: 2
b: 2
c: 2
a: 0.26
b: 0.48
c: 0.46
65 About 115 2nd-grade standby
bhw19 AFLP-SCAR 1 unknown 2 0.45 58 92 2nd-grade standby
a、b、c和 d表示不同位点。a, b, c, and d denote different loci.

1120 作 物 学 报 第 36卷

表 3 3种分子标记的分辨能力
Table 3 Discrimination power of three types of molecular markers
引物类型
Primer type
引物对数
Primer pair
检测位点数
Locus number
检测等位变异数
Allele number
平均每条染色体被检测位点数
Tested locus number per chromo-
some
每对引物检测
等位变异数
Allele number per primer
PIC平均值
Average of
PIC
Genomic-SSR 63 71 601 3.4 9.5 0.76
EST-SSR 21 21 89 1.0 4.2 0.53
AFLP-SCAR 21 30 64 1.4 3.0 0.57

异的带型差异容易区分, 部分引物可以进行多重电
泳(图 1)。多位点引物的产物带型较复杂 , 但一次
PCR反应可以扩增多个位点的产物(图 2), 10对引物
可以检测 27 个 DNA 位点的多态性, 增加了被检测
品种(系)的信息量。在 10对多位点引物中, gwm334
为双位点引物 , 但绝大多数品种 Xgwm334a 和
Xgwm334b 的位点纯合性检测结果相同, 证明这两
个位点紧密连锁, 因此本文将 gwm334 作为单位点
引物对待。双位点引物 gwm339 和 gwm272 在部分
品种中扩增的两位点DNA片段长度接近, 带纹相互
交叉不易分开, 本文暂按单位点计算其 PIC 值(表
2)。尽管这两对引物的带型有些不足, 但其多态性高,
带型清晰稳定, 且为满足 2 对引物所处染色体的检
测位点数量, 因此选作二级备用引物。
2.1.2 分子标记的分级 根据小麦区试品系特异
性、一致性、稳定性测试的需要, 以及引物的染色
体分布、PIC值和带型清晰度等因素, 将 105对引物
划分为核心、一级备用、二级备用 3个等级(表 2)。

图 1 Genomic-SSR引物 barc91的 PCR产物双重电泳图
Fig. 1 Electrophoretogram of two sets of PCR products am-
plified by genomic-SSR primer barc91

图 2 Genomic-SSR引物 cfd65四个位点的带型
Fig. 2 Four loci patterns of genomic-SSR primer cfd65

核心引物 21 对 , 含 Genomic-SSR 引物 18 对和
EST-SSR 引物 3 对, 均为单位点引物, 分别位于 21
条染色体。本研究为 21对核心引物各个等位变异的
带型确定了编号、对照品种及带型图(表 4 和图 3),
为每个品种构建了 21个位点的 DNA指纹。一级备
用引物 29对, 含 Genomic-SSR引物 13对、EST-SSR
引物 12对和 AFLP-SCAR引物 4对, 所扩增的产物
均为单位点的共显性标记, 带型清晰、不同等位变
异间的带型容易区分。二级备用引物 55 对 , 含
Genomic-SSR 引物 32 对、EST-SSR 引物 6 对和
AFLP-SCAR引物 17对。核心引物以 Genomic-SSR
引物为主, PIC 值较高, 具有较强的分辨率, 备用引
物中包含了较多 EST-SSR 和 AFLP-SCAR 引物, 分
辨率低于核心引物(表 5)。

表 4 核心引物 gdm72的等位变异带型编号及相应对照品种
Table 4 Pattern codes and control cultivars for each allele of
the core primer gdm72
带型编号
Pattern code
对照 1
Control 1
对照 2
Control 2
06 晋麦 53号 Jinmai 53
08 西峰 20 Xifeng 20
09 淮麦 18 Huaimai 18 淮麦 20 Huaimai 20
10 济麦 1号 Jimai 1 周麦 16 Zhoumai 16
11 潍麦 8号 Weimai 8 京花 1号 Jinghua 1
12 徐州 25 Xuzhou 25 扬麦 9号 Yangmai 9
13 洛旱 2号 Luohan 2 京冬 8号 Jingdong 8
14 泽优 1号 Zeyou 1 济宁 13 Jining 13

图 3 核心引物 gdm72的等位变异带型图及编号
Fig. 3 Patterns and codes for each allele of the core primer
gdm72
图中每两个泳道为一种带型, 图下方数字为各带型的编号。
Each two lanes are the same pattern. The number at the bottom is
pattern code.
第 7期 王立新等: 小麦区试品系 DUS测试的分子标记 1121


表 5 三个级别引物的分辨能力
Table 5 Discrimination power of three classes of primers
引物级别
Primer level
引物对数
Primer pair
检测位点数
Loci number
检测等位
变异数
Allele number
每对引物检测等位变异数
Allele number per primer
PIC平均值
Average of
PIC
核心引物 Core primers 21 21 202 9.6 0.74
一级备用引物 1st-grade standby primers 29 29 151 5.2 0.60
二级备用引物 2nd-grade standby primers 55 72 401 7.2 0.69
合计 Total 105 122 754 7.1 0.68

2.2 核心引物在小麦区试品系 DUS 检测中的作
用
21对核心引物作为检测品种(系)特异性、一致
性和稳定性的首选引物 , 主要用于 : (1) 建立品种
(系)的 DNA 指纹, 鉴定品种(系)的特异性及相似性;
(2) 品种(系)种子纯度检测; (3) 筛查 DNA位点纯合
率较低的品种(系)。
2.2.1 品种(系)特异性检测 品种特异性检测是
DUS 测试中最重要的项目, 其目的在于判断参试品
系的新颖性和筛查无特异性品系。在每年的区试品
系中都会发现一些品系高度相像或与已审定品种相
像, 如何从众多品种(系)中找出这些品系是区域试
验的难点, 根据本中心的研究证明, 品种间遗传相
似系数(GS)随着核心标记相似率的增加而提高, 品
种间的相似程度随着 GS 的提高而提高; GS 小于
0.90 的品种间差异显著互为特异品种 ; GS 为
0.91~0.95 的大多数品种之间具有特异性, GS 大于
0.95 的品种之间多高度相似甚至无特异性(另文发
表)。据此, 在国家区试中检出的 GS大于 0.95的品
种(系), 将于下一年度送往农业部 DUS 测试中心进
行特异性测试。
2008—2009年度利用核心标记为国家、北京市、
河北省冬小麦区试 196个品系构建了 DNA指纹, 通
过与小麦DNA指纹数据库中的品种比对, 筛查出区
试品系试与审定品种间或区试品系间指纹完全相同
的品种(系) 31对, 20个位点相同的品种(系) 35对,
19 个位点相同的品种(系) 18 对, 其余品种(系)间均
有 2 个以上的位点不同。用 84 对备用引物为以上
84 对品种(系)和随机选取的 14 对相同位点为 18 的
品种(系)进行位点比对, 综合核心引物和备用引物
的比对结果计算每对品种(系)的GS, 比较以上 98对
品种(系)的指纹相似水平与 GS 表明, 两品种(系)间
指纹完全相同时, GS大于 0.95的可能性为90.3 %; 20
个位点相同时, 两品种(系)间GS大于0.95的可能性为
14.3%; 19 个位点相同时, 两品种(系)间 GS 大于 0.95
的可能性为 5.6%; 18位点相同时, 两品种(系)的GS均
小于 0.95 (表 6)。再次证明品种间 GS随着核心标记相
似率的增加而提高。

表 6 98对品种(系)的指纹相似水平和遗传相似系数(GS)
Table 6 Fingerprint similarity and GS for 98 pair cultivars in 2008−2009
两品种(系)间指纹中
相同的位点数目
The same locus number of finger-
prints between two cultivars (lines)
品种(系)
对数
Pair of culti-
vars (lines)
GS平均数
Average of
GS
GS范围
Range of
GS
GS＞0.95的品种
(系)对数
Pair of cultivars (lines)
(GS＞0.95)
两品种(系)间 GS＞0.95
的可能性
Probability of GS＞0.95
between 2 cultivars (lines)
(%)
21 31 0.97 0.92−1.00 28 90.3
20 35 0.93 0.88−0.99 5 14.3
19 18 0.92 0.88−0.97 1 5.6
18 14 0.90 0.83−0.94 0 0
GS: 遗传相似系数。GS: genetic similarity.

19~21个核心标记相同的 84对品种(系)中, 涉
及区试品系 45个, 占 196个品系的 23%, 说明比对
核心引物构建的指纹, 可在大量品系中为近 80%的
品系判定特异性, 并将相似或无特异性的品系锁定
在较小的范围内。构建 DNA指纹是一项精细而耗时
的工作, 且因多数区试品系将被淘汰, 没有必要构
建更多位点的 DNA 指纹。21 个核心标记构建的
DNA指纹, 主要用于为大多数品系确定特异性和筛
查出指纹相似性较高的品系。在 19~21 个核心标记
相同的品种(系)中, 均有 GS大于 0.95的可能, 需利
1122 作 物 学 报 第 36卷

用备用引物进行更多位点比对 , 以确定 GS 大于
0.95的品种(系)。
2.2.2 品种(系)一致性、稳定性检测 种子纯度
和 DNA 位点纯合率是影响品种一致性的主要因素,
在 2006—2007、2007—2008、2008—2009年度国家
冬小麦区试品系的一致性测试中, 利用核心分子标
记, 采用作者提出的方法[5], 为 95%~100%的品系完
成了种子纯度检测, 并锁定了其余品系中疑似杂株
的单株。证明用核心引物可以完成绝大多数品系的
纯度检测。对于少数尚不能下结论的品系, 可借助
备用引物加以检测。
DNA 位点纯合率的高低既影响小麦品种的一致
性 , 还决定着品种的遗传稳定性 [9]; 因此可以根据
DNA 位点纯合率评价品种的遗传稳定性和一致性。
DNA位点纯合率高于 95%的绝大多数品种和 DNA位
点纯合率为 90%~95%的少数品种具备一致性和稳定
性; DNA位点纯合率低于 90%的品种不具备一致性和
稳定性[9]。据此, DNA位点纯合率低于 90%的国家区
试品系将被停试 1 年。本研究比较了 2007—2008、
2008—2009年度国家冬小麦区试品系中 104个品系的
核心标记纯合位点数与相应品系的 DNA 位点纯合率,
结果表明, 品种 DNA 位点纯合率随着核心标记中纯
合位点数的增加而提高(表 7)。21个核心标记均为纯
合位点的品系其位点纯合率均高于95%; 具有20个纯
合位点的品系中, 位点纯合率高于 95.0%的占 80.4%;
具有 19个纯合位点的品系中, 位点纯合率高于 95.0%
的占 65.2%; 纯合位点少于 19的品系中, 只有约 10 %
的品系 DNA位点纯合率高于 95.0%。参加区试的多数
品系的 21个核心标记均为纯合位点, 因此, 根据核心
标记的纯合位点数目, 可以使大多数品种通过稳定性
检测, 对于具有非纯位点的品系, 再借助备用引物确
定其 DNA位点纯合率。

表 7 核心标记中纯合位点数与品种 DNA位点纯合率的关系
Table 7 Relationship between number of the homozygous DNA locus for the core markers and the homozygous DNA locus ratio of
cultivars
核心标记中的
纯合位点数
Number of homozygous
DNA locus of the core
markers
品系
数目
Line number
DNA位点纯合率
平均数
Average ratio of homo-
zygous DNA locus
(%)
位点纯合率≤95%
的品系数目
Number of lines with
homozygous DNA locus
ratio ≤ 95%
位点纯合率>95%
的品系数目
Number of lines with
homozygous DNA locus
ratio >95 %
位点纯合率>95%
的品系比例
Percentage of culti-
vars with homozygous
DNA locus ratio >
95% (%)
＜19 24 89.3 22 2 9.1
19 23 95.1 8 15 65.2
20 46 96.2 9 37 80.4
21 11 97.3 0 11 100.0

品种的一致性由种子纯度和 DNA 位点纯合率
所决定, DNA 位点纯合率又与品种的遗传稳定性紧
密相关 [9], 参试的大多数品系均具备较高种子纯度
和 DNA 位点纯合率, 用核心引物检测种子纯度和
DNA位点纯合率, 可以完成约 60%品系的一致性、
稳定性检测。
2.3 备用引物在小麦区试品系 DUS 检测中的作
用
核心引物可完成大多数区试品系特异性、一致
性和稳定性检测, 对于尚未有结果的部分品系需要
采用 84对备用引物进行检测。备用引物主要用于: (1)
为 19~21 个核心标记相同的品种(系)确定 GS, 筛查
GS 大于 0.95 的品种(系); (2) 完成核心引物未确定
的少数品系种子纯度检测; (3) 与核心引物一起共
同完成品系 DNA位点纯合率的检测。
2.3.1 品种(系)特异性检测 在 2008—2009 年
度国家冬小麦区试品系的特异性测试中 , 检测到
DNA指纹中 19~21个位点相同的品种(系) 46对。为
了减少DNA位点比对的工作量, 首先采用一级备用
引物完成每对品种(系)的 29个DNA位点的比对, 综
合 50个位点的比对结果, 计算每对品种(系)的 GS。
21对品种(系)的相同位点数目为 44~47, GS≤0.95,
其余 25 对品种(系)的相同位点数目均大于 47, GS>
0.95。因 GS>0.95 的品种(系)将送往农业部 DUS 测
试中心进行特异性测试, 为了获得更加准确的 GS,
还需采用二级备用引物比对这些品种 (系 )更多的
DNA 位点。2008—2009 年度国家冬小麦区试品系
139个, 利用核心引物确定 113个品系与其他品种(系)
的 GS≤0.95, 占参试品系的 81.3%。启用一级备用
引物后, 又在其余 26个品系中确定 6个品系与其他
品种(系)的GS<0.95, 至此通过特异性检测的品系达
到 85.6%。显示了一级备用引物在检测品种(系)特异
第 7期 王立新等: 小麦区试品系 DUS测试的分子标记 1123


性方面的重要作用。
通过比对 21对核心标记和 29对一级备用标记,
2008—2009 年度国家冬小麦区试品系中仍有 25 对
品种(系)的 GS>0.95, 采用二级备用引物为上述 25
对 GS>0.95 的品种(系)比对了 70 个 DNA 位点, 综
合核心、备用引物比对结果, 计算每对品种(系)的
GS, 在 25 对品种(系)中 11 对品种(系)≤0.95, 其中
涉及 8个参试品系, 至此 2008—2009年度国家冬小
麦区试的 139个品系中, 127个品系与其他品种(系)
GS≤0.95, 占参试品系的 91.4%; 14对品种(系)GS>
0.95, 涉及参试品系 12个, 占参试品系的 8.6%。据
此将 14 对 GS>0.95 的品种(系)送往农业部 DUS 测
试中心进行特异性测试。通过连续 3 个年度的应用
和检验, 证明利用 105 对引物可以为绝大多数区试
品系完成特异性检测, 并锁定了少数相似性较高的
品种(系)。
2.3.2 品种(系)一致性、稳定性检测 在 2008—
2009 年度国家冬小麦区试一致性检测中, 利用核心
引物在 41个品系中检出 94个杂株 , 还有 7个品系
的 26个单株尚不能确定是否为杂株, 为此, 增加 9
个 PIC 值较高的一级备用引物(cwm75、ksum182、
cnl150、ksum73、bhw135、wes26、swes209、swes185
和 cwm334), 对 26个单株共检测 30个位点。某单
株的 30个被检测位点中有 2个以上与测试品系其他
单株基因型不同, 即可判断为杂株[5], 结果在 26 个
单株中确定 21株为杂株。本中心从 407个国家区试
品系中检出 110个品系混有杂株 , 但多数品系种子
纯度高于 95 %, 少数品系较差。
种子纯度是影响品种一致性的因素之一, DNA
位点纯合率是另一重要因素。为了确定检测品种
DNA位点纯合率的标记数目, 比较了表 2中 89对共
显性引物与 50 对核心及一级备用引物对 15 个品系
的检测结果, 两方案检测的品系DNA位点纯合率差
异不显著(P=0.185)。证明采用核心及一级备用引物,
足以完成小麦品种 DNA 位点纯合率的检测。在
2006—2007、2007—2008、2008—2009年度国家冬
小麦区试中, 作者利用核心引物在 116 个品系中检
出非纯DNA位点, 再用一级备用引物检测了每个品
系的 29个 DNA位点, 综合 50个位点的结果, 计算
116 个品系的 DNA 位点纯合率, 其中 60 个品系的
DNA位点纯合率高于 95%, 22个品系的 DNA位点
纯合率为 90%~95%, 35个品系的 DNA位点纯合率
低于 90%。据此判定, 前 60个品系具备一致性和稳
定性, 后 35个品系不具备一致性和稳定性, DNA位
点纯合率为 90%~95%的 22个品系需进行田间试验,
以确定是否具备一致性和稳定性。在 3 个年度区域
试验中, 采用 21 对核心引物和 29 对一级备用引物,
为 95%的品系判定了一致性和稳定性。
3 讨论
利用分子标记进行品种 DNA指纹构建、品种鉴
定或种子纯度鉴定的多数研究中仅采 Genomic-SSR
标记[10-13]。为了保证选中的分子标记中有一定比例
的基因内标记, 本研究筛选了 21对 EST-SSR引物和
21对 AFLP-SCAR引物。21对 AFLP-SCAR引物根
据 19个 AFLP片段的 DNA序列设计, 其中, 15个为
新发现的小麦 DNA 片段, 另 4 个片段与 GenBank
中 EST 片段高度同源, 同源性≥96%, 证明 AFLP-
SCAR中有 EST。此外, Genomic-SSR标记中也有一
定比例的 EST-SSR。因此, 在 122 个位点中既有基
因内标记也有基因外标记, 既有重复序列分子标记
又有非重复序列分子标记, 与仅用一种分子标记构
建DNA指纹的方法相比, 能够更加全面的反映品种
的基因型。
利用分子标记进行小麦遗传多样性研究和筛选
核心标记的报道已有不少 [17-18,26-27], 品种的遗传多
样性分析重在揭示品种间的亲缘关系及遗传基础 ,
在研究中只要品种间一个 DNA 位点的基因型不同,
便视为不同品种, 筛选核心引物的重要指标之一是
可以区分更多的品种。而判断品种特异性是依据品
种间农艺性状和表型的差异程度, 即使两品种有数
个DNA位点的基因型不同, 只要农艺性状和表型无
显著差异, 仍被视为无特异性, 所以作为小麦品种
特异性检测的分子标记, 不仅应该可以区别尽可能
多的特异性品种, 还应能从众多品种中筛查出高度
相似的品种, 为此, 要求用于检测的分子标记应具
有较好的代表性。在 2007年颁布的农业行业标准中,
玉米新品种鉴定的 DNA 指纹方法选用了20 对
Genomic-SSR核心引物和 20对候补引物, 水稻则选
用了 12对Genomic-SSR核心引物和 12对候补引物。
小麦是由 3个基因组构成的异源六倍体 , 基因组庞
大(16 000 Mb), 3个基因组之间同源性很强, 分子标
记的数量和类型直接影响检测结果准确与否, 尤其
对区试品系的相似性判断, 关系到保护已审定品种
育种者的知识产权和被检品系育种者的名誉, 应具
有法律的严肃性。因此本研究提出检测小麦特异性
1124 作 物 学 报 第 36卷

采用 3种分子标记的 105对引物, 其中 21对核心引
物、84对备用引物。虽然比玉米、水稻所用的引物
多 1~3倍, 105对引物扩增的 122位点的 DNA长度
仅为小麦基因组的数百万分之一, 仍难免出现例外
现象。在 2007—2008 年度国家冬小麦区域试验和
2008—2009 年度北京市冬小麦区域试验中, 分别有
1对 GS>0.95的品种(系)在田间表现显著差异。然而,
在小麦全基因组测序技术尚不能用于大量品种(系)
DNA指纹比对的现实情况下, 以一定数量的分子标
记代表全基因组是切实可行的。经过在 3 个年度国
家区试品系特异性测试中的应用, 证明这套引物可
以在大量品种中筛查出高度相似甚至无特异性的品
种, 与田间试验的吻合度为 95%。
本研究所采用的Genomic-SSR和EST-SSR均为
共显性标记, 而多数AFLP-SCAR为显性标记, 为了
避免 PCR反应失败等因素造成的无产物情况干扰阴
性结果的判断, 本文选用的 AFLP-SCAR 引物均可
扩增多个片段, 除品种间特异性片段外, 还要有非
特异性片段, 非特异性片段存在于所有品种中, 可
以帮助判断 PCR产物是否正常。
本研究为核心分子标记制定了等位变异的带型
编号、图谱及代表品种, 可以在不同实验室之间通
用, 以此构建的 DNA 指纹数据可相互比对。目前,
作者已采用 21对核心引物为我国近 350份审定品种
构建了DNA指纹数据库, 并将在此基础上形成条形
码, 为审定品种建立身份证号。为此, 在本中心建立
的分子标记技术体系不发生技术性改变的情况下 ,
21 对核心引物不会更换, 而备用引物将根据国内外
分子标记的最新研究结果和特殊性状鉴定的需要进
行适当调整, 以提高分子标记检测结果与田间测试
结果的吻合程度。
除了辅助小麦区试品系的 DUS 测试外, 105 对
引物还可以用于品种的真实性检测, 近年来, 本中
心协助育种单位、种子经营或管理部门多次甄别假
冒品种。此外, 本中心还利用这套引物构建了光温
敏二系杂交小麦骨干亲本的DNA指纹数据库, 分析
了光温敏二系杂交小麦骨干亲本的遗传距离和群体
结构[28], 并采用关联分析方法为小麦重要基因进行
了定位[29]。
4 结论
确定了 105 对小麦区试品系 DUS 测试的 PCR
引物, 含 63 对 Genomic-SSR 引物、21 对 EST-SSR
引物和 21对 AFLP-SCAR引物, 包括了基因内外以
及 DNA 重复和非重复序列标记, 具有较好的代表
性。根据新品种 DUS测试的需求及引物扩增产物的
带型特点, 将 105 对引物分为 21 对核心引物和 84
对备用引物 , 通过在 2006—2007、2007—2008、
2008—2009年度国家冬小麦区试品系检测中的应用,
证明 105 对引物可以有效地辅助小麦新品种特异
性、一致性和稳定性检测。
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