全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2012, 38(9): 1617−1624 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家转基因生物新品种培育重大专项(2011ZX08002-001), 国家现代农业产业体系建设项目(CARS-03)和江苏省农业科技自
主创新资金(CX11-1025)资助。
第一作者联系方式: E-mail: mpzhou@hotmail.com, Tel: 025-84390298
Received(收稿日期): 2012-01-19; Accepted(接受日期): 2012-04-20; Published online(网络出版日期): 2012-07-03.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20120703.0858.201209.0_004.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2012.01617
转 Gastrodianin基因提高小麦赤霉病和纹枯病的抗性
周淼平 1 杨学明 1 姚金保 1 任丽娟 1 张增艳 2 马鸿翔 1
1江苏省农业科学院省农业生物学重点实验室, 江苏南京 210014; 2中国农业科学院作物科学研究所 / 农作物基因资源与基因改良国
家重大科学工程 / 农业部作物遗传育种重点开放实验室, 北京 100081
摘 要: 天麻抗真菌蛋白 Gastrodianin在体外可以抑制多种病原真菌的生长。为检验转 Gastrodianin基因小麦对真菌
病害的抗性, 采用基因枪法将由 ubiquitin启动子驱动的 Gastrodianin基因导入小麦品种扬麦 158和 Alondra, 获得 14
株纯合的转基因株系。外源基因的 PCR检测、染色体荧光原位杂交、半定量 RT-PCR分析结果表明, 外源 Gastrodianin
基因在转基因小麦 T5代植株中已经纯合并有不同水平的表达; 赤霉病和纹枯病抗性鉴定结果显示, Gastrodianin基因
的表达能抑制病原菌在转基因植株中生长, 从而减轻病原菌引起的病症发展, 且 2种病害的减轻程度与 Gastrodianin
基因的表达水平正相关。
关键词: 小麦; 转基因; Gastrodianin; 赤霉病; 纹枯病
Enhancement of Resistance to Fusarium Head Blight and Sharp Eyespot in
Gastrodianin Transgenic Wheat
ZHOU Miao-Ping1, YANG Xue-Ming1, YAO Jin-Bao1, REN Li-Juan1, ZHANG Zeng-Yan2, and MA
Hong-Xiang1
1 Provincial Key Laboratory for Agrobiology, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China; 2 National Key Facility of Crop
Gene Resources and Gene Improvement / Key Laboratory of Crop Genetic and Breeding, Ministry of Agriculture / Institute of Crop Sciences, Chi-
nese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China
Abstract: Gastrodianin, also called Gastrodia antifungal protein (GAFP), can inhibit the growth of many fungal pathogens in
vitro. The Gastrodianin gene driven by maize ubiquitin promoter in the transformation vector pAC-GAFP was introduced into
wheat cultivars Yangmai 158 and Alondra via particle bombardment to investigate the resistance to fungal pathogens in transgenic
wheat. A total of 14 transgenic lines were obtained and verified through PCR, FISH, and semiquantitative RT-PCR analyses. The
results showed that the alien Gastrodianin gene was integrated into wheat genome in the transgenic lines and heritable to the off-
spring. The alien Gastrodianin gene was expressed at different levels in the transgenic lines of the homozygous T5 generation.
The assessment of resistance to Fusarium graminearum and Rhizoctonia cerealis indicated that Gastrodianin suppressed the
growth of pathogens in transgenic plants and reduced the severity of both diseases. The enhanced resistance degree was associated
with the expression level of Gastrodianin gene in transgenic plants.
Keywords: Wheat; Transformation; Gastrodianin; Fusarium head blight; Sharp eyespot
兰科植物天麻(Gastrodia elata Bl.)是我国的传
统中草药, 其生育期大部分时间以球茎状态生长在
地下 , 不含叶绿素 , 不能进行光合作用 , 主要依靠
与其共生的蜜环菌(Arimillariella mellea)提供营养。
研究发现, 蜜环菌菌丝只定殖于初生球茎, 被阻抑
在皮层而不能进入次生球茎, 表明该部位可能含有
抑制共生真菌生长的物质。胡忠等[1]首先将该物质
分离纯化 , 称之为天麻抗真菌蛋白(Gastrodia anti-
fungal protein, GAFP)或Gastrodianin。进一步的研究
发现 , Gastrodianin在体外不仅抑制蜜环菌的生长 ,
对瑞士木霉(Trichoderma viride)、松枯梢病菌(Sphae-
ropsis sapinea)、小麦赤霉病菌(Gibberella zeae, 也
1618 作 物 学 报 第 38卷

称禾谷镰刀菌Fusarium graminearum)、苹果树轮纹
病菌 (Marophoma kuwatsukai)、葡 萄霜霉 病 菌
(Plasmopara citicola)、棉花黄萎病菌 (Verticullium
dahliae)、杉木炭疽病菌 (Colletotrochum gloeo-
sporioides)、灰霉病菌(Botrytis cinerea)、立枯丝核
菌(Rhizoctonia solani)、灵芝菌(Ganoderma lucidum)、
梨腐烂病菌(Valsa ambiens)等均有抑菌活性[1-2]。目
前 , 已经从天麻的3个亚种中克隆了10余个Gastro-
dianin基因, 它们的cDNA序列相似性很高, 同属于
甘露糖结合蛋白超家族[3-7]。由于该基因具有广谱真
菌抗性, 已经被部分研究单位用于抗真菌病害的转
基因植物研究。Wang等[8]将该基因导入彩色棉花中,
发现转基因棉花具有稳定的黄萎病抗性。该基因也
被导入到烟草中 , 转基因烟草对根部疫霉菌
(Phytophthora nicotianae)和立枯丝核菌以及南方根
瘤线虫(Meloidogyne incognita)都有显著抗性[9]。
小麦赤霉病和纹枯病是我国南方麦区和黄淮麦
区的重要病害 , 目前能用于育种的抗源较为贫乏 ,
Gastrodianin在体外均能抑制小麦赤霉病菌和纹枯
病菌的菌丝生长, 将Gastrodianin基因导入普通小麦,
能否增加小麦对这2种病害的抗性值得研究。本研究
采用基因枪转化方法将由组成型表达启动子驱动的
红天麻Gastrodianin基因导入小麦, 以验证该基因能
否提高小麦对赤霉病和纹枯病的抗性, 为今后开展
抗小麦真菌病害基因工程研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 植物材料及表达载体
转基因小麦 (Triticum aestivum)受体品种为
Alondra和扬麦 158, Alondra感赤霉病和纹枯病, 扬
麦 158 中抗赤霉病、感纹枯病。受体材料为小麦开
花后 12~14 d的幼胚。
根据 Gastrodianin基因 DNA序列(GenBank登
录号为 AF225410)设计 PCR 扩增引物对 GAFP-F:
5′-atcccgggATGGCAGCATCCGC-3′ (下画线为引入
的 Sma I酶切位点)和 GAFP-R: 5′-gtgagctcCTAGCC
AGCTATTC-3′ (下画线为引入的 Sac I 酶切位点),
采用 TaKaRa LA Taq 酶扩增质粒 pBI35sGAFP-
NP1-bar (中国科学院遗传与发育生物学研究所孙勇
如研究员提供)中的 Gastrodianin 基因, 将该基因替
换质粒 pACH25 [10]中 Sma I和 Sac I限制性内切酶位
点间的 gus 基因即获得表达载体 pAC-GAFP, 该表
达载体含有玉米 ubiquitin 组成型启动子驱动的
Gastrodianin 基因以及抗除草剂 L-PPT (L-phosphi-
nothricin)的选择标记 bar基因(图 1)。

图 1 质粒 pAC-GAFP构造
Fig. 1 Structure of plasmid pAC-GAFP

1.2 小麦的转化及转基因植株的检测
采用基因枪方法转化小麦受体材料, 按我们已
报道的方法[11]进行质粒包裹、基因枪轰击和转基因
植株筛选。采用除草剂喷施和 PCR相结合的方法进
行转基因植株的筛选和鉴定, 直至获得纯合的转基
因植株。将在筛选培养基[11]上产生的 T0代植株移栽
于盆钵生长至成熟, 收获种子。T0代种子播于 72孔
塑料穴盆中, 萌发产生 T1代植株, 于 2~3 叶时喷施
含 100 mg L−1 L-PPT有效成分的 Basta除草剂溶液
继续筛选, 根据 T1代植株抗 Basta 的分离结果推断
T0代植株是否为转基因阳性植株。
采用 CTAB 法抽提抗 Basta 植株叶片的 DNA,
进行 Gastrodianin 基因 PCR 检测(GAFP-P1: 5′-CT
AGCACAAGGCGGCTACCTATTC-3′; GAFP-P2: 5′-
GCAGTGATTTCAGCATTTCCAACG-3′), 预期扩增
片段为 304 bp。PCR总体积为 20 µL, 含 1×buffer、
1.5 mmol L−1 MgCl2、0.2 mmol L−1 dNTPs、0.5 µmol
L−1引物、50 ng模板 DNA、1 U Taq酶(TaKaRa)。
PCR条件为 95℃预变性 3 min; 94℃ 30 s, 55℃ 45 s,
72℃ 30 s, 35个循环; 最后 72℃延伸 5 min。采用
1.2%琼脂糖凝胶电泳检测分析扩增产物。
1.3 转基因株系的 FISH分析
以 pAC-GAFP 质粒为探针, 对纯合转基因小麦
植株的根尖有丝分裂中期染色体制片进行荧光原位
杂交, 以检测 Gastrodianin基因在染色体上的位置。
杂交信号检测后, 以 pSc119.2 和 pAs1 分别作探针,
对同一染色体制片进行双色荧光原位杂交, 以鉴别
Gastrodianin基因所处的染色体。pSc119.2是一个来
第 9期 周淼平等: 转 Gastrodianin基因提高小麦赤霉病和纹枯病的抗性 1619


源于黑麦、含有 120 bp的高度重复序列, 可以鉴别
普通小麦 B组和 4A、5A染色体, pAs1是来源于山
羊草、含有 1 000 bp的高度重复序列, 可以鉴别普
通小麦 D 组染色体[12-13]。pSc119.2、pAs1 分别以
digoxigenin-11-dUTP 和 biotin-12-dUTP 标记 , 以
anti-dig-Rhodamine和 anti-biotin Fluorescein抗体检
测信号, 在荧光显微镜的不同滤光片下分别显示红
色和绿色杂交信号。参照杨学明等[14]的方法进行根
尖制片、探针标记和原位杂交。
1.4 转基因小麦 Gastrodianin基因的表达分析
用 SV Total RNA Isolation System 试剂盒
(Promega)提取 T5 代转基因植株叶片总 RNA, 按照
PrimeScript RT-PCR 试剂盒 (TaKaRa)说明书合成
cDNA并进行半定量 RT-PCR分析。采用 18S rRNA
基因作为内参基因 (18S-QF: 5′-GTGACGGGTGA
CGGAGAATT-3′; 18S-QR: 5′-GACACTAATGCGCC
CGGTAT-3′)。PCR总体积为 25 µL, 含 1×buffer II、
0.4 mmol L−1 dNTPs、0.6 μmol L−1引物、2 µL cDNA
模板、1.25 U Ex Taq HS酶(TaKaRa)。PCR程序为
95℃预变性 3 min; 94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 30 s,
30个循环; 最后 72℃延伸 5 min。用 1.2%琼脂糖凝
胶电泳检测分析扩增产物。
1.5 转基因小麦的抗病性鉴定
1.5.1 赤霉病抗性 2010 年和 2011 年分别在温
室和大田 , 选择致病力较强的禾谷镰刀菌 (F.
graminearum) F15小种(江苏省农业科学院植物保护
研究所陈怀谷研究员提供), 采用单花滴注方法进行
赤霉病抗性鉴定。病原菌分生孢子悬浮液浓度为
50 000个 mL−1。选取刚开花的穗,10 μL孢子悬浮液
滴加在中部小花上, 套袋保湿 3 d, 于接种后 7、14
和 21 d 调查病小穗率, 病小穗率= (发病小穗数/总
小穗数)×100%。每个转基因纯合株系调查 15穗, 重
复 2次。采用 SAS 9.0软件进行方差分析。
1.5.2 纹枯病抗性 2010—2011年连续 2年在大
田中, 采用病麦粒接种法鉴定纹枯病抗性。于拔节
期将带有纹枯病病菌 R. cerealis R0301 (江苏省农业
科学院植物保护研究所陈怀谷研究员提供)的病麦
粒均匀播于小麦植株基部, 保湿 7 d。小麦乳熟期调
查纹枯病病害, 每个转基因纯合株系随机调查 15个
发病茎秆, 重复 2 次, 计算株系平均病情严重度和
平均病情指数 , 病情指数= [(Σ各级病株数×各级代
表值)/(总株数×最高级代表值)]×100。病情严重度按
0~5级标准: 0级(无病症); 1级(叶鞘有典型病斑, 但
不侵茎); 2 级(病菌侵入茎秆, 病斑宽度环茎不超过
茎秆周长的 1/2); 3级(病斑环茎宽度为 1/2~3/4茎秆
周长); 4级(病斑环绕茎秆 3/4以上或茎秆已软腐); 5
级(枯孕穗或枯白穗)。采用 SAS 9.0软件进行方差分
析。
2 结果与分析
2.1 转基因小麦植株的获得与分子检测
采用基因枪法将构建的 pAC-GAFP表达载体导
入小麦品种 Alondra 和扬麦 158, 分别转化幼胚
1 000枚和 617枚, 经含 3 mg L−1 L-PPT愈伤诱导和
再生培养基筛选, 分别获得再生植株 43 株和 28 株,
对其后代喷施 Basta 除草剂溶液, 发现分别有 10 株
和 5 株的后代除草剂抗性出现分离, 其余植株后代
均不抗除草剂, 可能是假阳性转基因植株或 bar 基
因已丢失的转基因植株。对抗除草剂的 15株后代进
行 Gastrodianin基因 PCR检测, 发现只有 14株后代
中仍有 Gastrodianin基因, 其中以 Alondra为受体的
10 株, 以扬麦 158 为受体的 4 株(图 2)。对这 14 株
转基因阳性植株继续采用喷施除草剂和 PCR检测相
结合的方法, 所有植株在 T5代均获得 Gastrodianin
纯合的转基因植株。
2.2 转基因小麦植株的 FISH检测
FISH 检测结果表明, T5 代转基因株系 Gastro-
dianin基因已纯合, 大多为单个位点插入。转基因株

图2 以扬麦158为受体的部分T1代转化植株Gastrodianin基因的PCR检测
Fig. 2 PCR analysis for Gastrodianin gene in partial T1 transgenic plants of Yangmai 158
M: DL2000 marker; 1: 质粒pAC-GAFP; 2: 扬麦158; 3~17: 转基因T1代植株。
M: DL2000 marker; 1: plasmid pAC-GAFP; 2: Yangmai 158; 3–17: transgenic T1 plants derived from Yangmai 158.
1620 作 物 学 报 第 38卷

系 T15在有丝分裂中期, 2条染色体的每个染色单体
上均有杂交信号, 该质粒插入至染色体长臂近着丝
粒的位置(图 3-A); 对同一染色体制片进行双色荧光
原位杂交, 结果表明, 含有 pAC-GAFP 杂交信号的
2条染色体的长臂上有 2对红色信号, 短臂末端有 1
对红色信号, 根据 pSc119.2和 pAs1杂交信号分布特
点, 含有 pAC-GAFP 杂交信号的 2 条染色体为一对
6B染色体(图 3-B)。
2.3 转基因小麦 Gastrodianin基因的表达分析
采用半定量 RT-PCR 分析导入的 Gastrodianin
基因的表达情况, 发现转基因植株的 Gastrodianin
mRNA 表达存在差异(图 4), 以扬麦 158 或 Alondra
为受体的转基因植株中都存在这种表达差异, 表明
Gastrodianin 表达差异与所采用的受体亲本没有关
系。以 Alondra 为受体的转基因株系根据表达的强
弱, 可分为 3组, T15、T26和 T37表达最强, T27、
T33、T34、T36和 T39其次, T14和 T24较弱; 以扬
麦 158为受体的转基因株系只分为 2组, T1和 T2表
达较强, T5和 T9表达相对较弱。
2.4 转基因小麦的赤霉病抗性鉴定
14个转基因株系及其未转基因对照在接种病原
菌后均有典型的赤霉病症状出现, 表明导入的 Gast-
rodianin 基因表达产物不足以阻止禾谷镰刀菌的侵染
(图 5)。接种 7 d后, 部分转基因株系与未转基因对照
的平均病小穗率差异已经非常明显, 而且这种差异随
时间愈来愈显著, 至接种 21 d, 转基因株系的平均病
小穗率显著低于未转基因对照(表1), 表明转基因株系
中的 Gastrodianin有效抑制了禾谷镰刀菌的生长。

图3 转基因株系T15(T5代)的荧光原位杂交检测
Fig. 3 FISH analysis of T15 transgenic line (T5 generation)
A: 转基因植株 pAC-GAFP质粒的荧光原位杂交, 箭头示杂交信号在两条染色体上; B: 对同一染色体制片进行顺序荧光原位杂交,
箭头所示的 2条染色体为 1对同源染色体。
A: FISH image of pAC-GAFP on chromosomes in transgenic wheat line. The arrows show hybridization signals on two chromosomes.
B: Sequential FISH on the same slide. The arrows show that the two chromosomes with signals are a pair of homologous chromosomes.

图4 转Gastrodianin基因植株的RT-PCR分析
Fig. 4 RT-PCR assay on Gastrodianin transcript in transgenic wheat plants
WT泳道为未转基因扬麦158的RT-PCR产物, 其他泳道为以扬麦158 (T1、T2、T5和T9)和Alondra (T14、T15、T24、T26、T27、T33、
T34、T36、T37和T39)为受体的转基因株系。
Lane “WT” was loaded with RT-PCR product of wild-type Yangmai 158, and other lanes were loaded with RT-PCR products of transgenic
lines derived from Yangmai 158 (T1, T2, T5, and T9) and Alondra (T14, T15, T24, T26, T27, T33, T34, T36, T37, and T39).

除 T33 个别转基因株系外, 其他转基因株系的
赤霉病抗性与其体内 Gastrodianin 基因的表达水平
呈正相关(表 1)。扬麦 158中抗赤霉病, 以其为受体
的各转基因株系在接种 21 d后赤霉病病小穗率与对
照亲本的差异均显著, 且表达较强的 T1 和 T2 株系
的病小穗率也显著低于表达较弱的 T5和 T9株系。
以感病品种 Alondra 为受体的转基因株系中, 无论
表达较强的株系(T15、T26 和 T37), 还是表达中等
(T27、T34、T36 和 T39)和表达较弱的株系(T14 和
T24), 其在接种 21 d 后的病小穗率均显著低于未
第 9期 周淼平等: 转 Gastrodianin基因提高小麦赤霉病和纹枯病的抗性 1621



图 5 转 Gastrodianin基因株系的赤霉病抗性
Fig. 5 Resistance of Gastrodianin transgenic lines to Fusarium
head blight
T15、T34和 T24: 转基因株系; WT: 未转基因 Alondra。
T15, T34, and T24: transgenic lines; WT: wild-type Alondra.

图 6 转 Gastrodianin基因株系的纹枯病抗性
Fig. 6 Resistance of Gastrodianin transgenic lines to sharp eyespot
T2: 转基因株系; WT: 未转基因扬麦 158。
T2: transgenic line; WT: wild-type Yangmai 158.

表 1 转 Gastrodianin基因株系的赤霉病病小穗率
Table 1 Percentage of scabbed spikelet in Gastrodianin transgenic lines (%)
温室 Greenhouse 田间 Field 株系
Line 7 d 14 d 21 d 7 d 14 d 21 d
扬麦 158 Yangmai 158 5.3 b 8.3 a 11.3 a 5.5 a 11.4 a 17.4 a
T-9 6.5 a 8.3 a 8.3 b — — —
T-5 5.5 b 7.0 ab 8.0 b — — —
T-2 5.5 b 7.1 ab 7.1 bc 5.3 a 7.9 b 12.6 b
T-1 4.9 b 4.9 b 4.9 c 5.3 a 6.9 b 10.6 c

Alondra 7.5 a 34.7 a 69.4 a 8.1 c 31.5 a 75.8 a
T-24 4.2 d 25.6 ab 49.1 b — — —
T-14 6.5 abc 22.3 bc 42.6 bc — — —
T-27 4.4 cd 19.5 bc 42.6 bc — — —
T-34 7.4 ab 18.2 bc 35.7 cd — — —
T-39 4.4 cd 19.4 bc 35.2 cd — — —
T-37 5.2 bcd 14.6 bcd 34.0 cd 8.7 c 17.4 c 28.5 d
T-36 4.8 cd 16.8 bc 30.3 d — — —
T-15 5.2 cd 12.7 cd 29.6 d 9.0 bc 14.9 c 30.8 cd
T-26 4.7 cd 19.1 bc 28.5 d 10.4 b 17.5 c 36.6 bc
T-33 4.9 cd 4.9 d 26.8 d 12.5 a 24.5 b 41.5 b
数据后不同字母表示相同受体品种的不同株系间病小穗率有显著差异(P<0.05)。“—”表示未鉴定。
Different letters after percentages of scabbed spikelet indicate significant differences among transgenic lines derived from the same
recipient parent (P<0.05). Symbol “—” indicates data not available.

转基因对照。以Alondra为受体的T33株系中Gastro-
dianin 基因中等表达, 在温室鉴定条件下, 其赤霉
病病小穗率低于表达较强的 T15、T26和 T37株系;
但在田间鉴定条件下, 其赤霉病抗性低于以上 3个
强表达株系(表 1)。对温室鉴定平均病小穗率比对照
亲本提高幅度较大的 T1、T2、T15、T26、T33 和
T37 共 6 个转基因株系在田间继续进行赤霉病抗性
鉴定, 结果表明, 这些转基因株系的赤霉病抗性稳
定 , 比对照亲本平均病小穗率降低 27.6%~62.4%,
感病品种 Alondra 的抗性提高幅度大于中抗品种扬
1622 作 物 学 报 第 38卷

麦 158。
2.5 转基因小麦的纹枯病抗性鉴定
连续 2 年转 Gastrodianin 基因株系接种后都有
典型的纹枯病症状产生(图 6), 尽管各个株系的纹枯
病抗性比未转基因对照提高程度不同, 但与未转基
因对照的差异均达显著水平(表 2)。与赤霉病抗性鉴
定趋势一致, Gastrodianin 基因表达量高的株系, 纹
枯病抗性提高幅度大。以 Alondra 为受体的转基因
株系中, 表达较强的 T15、T26和 T37的平均纹枯病
病情指数为 33.8, 表达稍差的 T27、T33、T34、T36
和 T39 的平均病情指数为 41.2, 表达最弱的 T14 和
T24 的平均病情指数则为 44.8, 而未转基因对照的
病情指数为 55.1。以纹枯病感病品种扬麦 158 为受
体的转基因株系中, Gastrodianin 基因表达较强的
T-1和 T-2的平均病情指数只有 36.7, 表达较弱的 T5
和 T9的平均病情指数为 48.2, 而未转基因对照的病
情指数高达 66.2。转基因株系的 2 年平均纹枯病病
情指数比未转基因受体低 17.1%~45.0%。

表 2 转 Gastrodianin基因株系的纹枯病病情指数
Table 2 Disease index of wheat sharp eyespot in Gastrodianin transgenic lines
2010 2011 株系
Line 平均病级
Average disease grade
病情指数
Disease index
平均病级
Average disease grade
病情指数
Disease index
扬麦 158 Yangmai 158 3.3 a 65.4 a 3.4 a 67.0 a
T-9 2.2 b 43.3 b 2.8 b 55.3 b
T-5 2.2 b 42.7 b 2.6 b 51.3 b
T-1 1.8 cd 35.3 c 2.0 c 38.7 c
T-2 1.7 d 32.9 c 2.0 c 40.0 c

Alondra 2.6 a 50.2 a 3.0 a 59.9 a
T-14 2.2 b 43.4 b 2.4 b 48.0 b
T-24 2.1 bc 42.0 bc 2.3 bc 45.6 bc
T-27 2.1 bcd 41.4 bcd 2.4 b 46.7 b
T-39 2.0 bcd 40.7 bcde 2.4 b 46.7 b
T-34 2.0 bcd 39.4 bcde 2.3 bc 44.7 bc
T-36 1.9 bcde 36.7 cdef 2.0 cde 39.4 cde
T-33 1.8 cde 35.3 def 2.1 bcd 41.4 bcd
T-37 1.8 de 34.7 ef 2.0 cde 38.7 cde
T-15 1.6 e 31.3 f 1.8 de 34.7 de
T-26 1.6 e 30.7 f 1.6 e 32.7 e
数据后不同字母表示相同受体品种的不同株系间平均病级或病情指数有显著差异(P<0.05)。
Different letters after average disease grade or disease index indicate significant differences among transgenic lines derived from the
same recipient parent (P<0.05).

3 讨论
赤霉病和纹枯病是我国小麦生产中的重要病害,
每年都会造成大量的产量损失, 常规育种虽然对赤
霉病的防治取得不小成就, 但目前能在育种中使用
的抗源仍然匮乏。由于小麦对这两种病害的抗性是
由多基因控制的数量性状, 抗病基因涉及多条染色
体, 无疑增加了抗病育种的难度。转基因方法为这 2
种病害抗源的创制和抗性品系(种)的培育提供了新
的解决途径。针对小麦赤霉病和纹枯病 , 已有
thaumatin-like protein [15]、几丁质酶和 β-1,3葡聚糖
酶[16-17]、BCL和 RIP[18]、α-1-purothionin[19]、TiERF [20]、
Rs-AFP2 [21]、TaPIEP1 [22]和 TaPIMP1[23]等多个基因
导入小麦中, 部分研究获得抗性提高的转基因小麦,
这些研究虽然一定程度拓宽了小麦真菌病害抗源的
范围, 但远不能满足小麦育种的需求, 寻求更多有
效的抗源仍是今后的重要研究内容。本研究将由禾
本科作物中高效组成型表达的 ubiquitin启动子驱动
的 Gastrodianin 基因导入小麦 , 发现纯合并表达
Gastrodianin 基因的转基因株系对小麦赤霉病和纹
枯病的抗性显著提高。
Gastrodianin 体外可抑制多种真菌的生长, 包
括小麦赤霉病致病菌禾谷镰刀菌和纹枯病致病菌立
枯丝核菌。我们的研究结果显示, 转基因株系都有
第 9期 周淼平等: 转 Gastrodianin基因提高小麦赤霉病和纹枯病的抗性 1623


赤霉病和纹枯病的典型症状出现 , 表明 Gastro-
dianin 不能阻止禾谷镰刀菌和禾谷丝核菌的侵染 ,
转基因株系与受体亲本相比之所以病害较轻, 主要
是 Gastrodianin 抑制病原菌的生长繁殖。小麦纹枯
病也可由禾谷丝核菌侵染引起, Gastrodianin体外能
否抑制禾谷丝核菌的生长还不清楚, 但从本研究转
Gastrodianin 基因株系可以减轻由禾谷丝核菌引起
的纹枯病病害程度推测, Gastrodianin能够抑制该菌
的生长。
本研究发现, 小麦转基因株系对 2 种病害的抗
性与 Gastrodianin 基因的表达量关系密切, 这与路
妍等[24]研究转 Rs-AFP2基因抗纹枯病小麦的结果一
致, 表明这类基因起作用大小主要由最终转基因植
株中抗真菌蛋白的含量决定。体外抑菌试验表明, 20
µg mL−1的 Gastrodianin可以有效抑制禾谷镰刀菌菌
丝的生长 [25], 但要在转基因植株中达到这一浓度 ,
难度较大, 提高目的基因的表达量必然消耗植株更
多的能量, 势必引起植株其他农艺性状特别是产量
性状的改变, 所以仅仅依靠转 Gastrodianin 基因大
幅度提高小麦的抗病性不太现实, 必须与其他抗病
基因协同作用, 才能起到更好的抗病效果。
雪花莲植物凝集素 GNA 对小麦蚜虫有明显的
毒杀作用[26-27], Gastrodianin 与 GNA 同属于甘露糖
结合蛋白超家族, 两者的甘露糖结合位点有 88.9%
的氨基酸同源性[28], 该位点针对蚜虫和线虫的毒杀
作用非常重要。转基因试验证明, Gastrodianin对南
方根瘤线虫具有明显的抑制作用[9]。Gastrodianin对
蚜虫是否有毒杀作用还不清楚, 我们的初步试验表
明, 在温室转基因植物对小麦蚜虫没有抗性。
本研究虽然通过半定量 RT-PCR证实小麦转基
因株系中 Gastrodianin 基因的表达有差异, 但表达
的量化有待今后更精确的 real-time PCR实验加以验
证; Gastrodianin表达产生差异的原因是拷贝数不同
还是插入位置效应等原因也有待今后通过 Southern
杂交以及更多的插入位置信息予以阐明。
4 结论
利用基因枪技术, 将外源 Gastrodianin 基因导
入小麦品种扬麦 158和 Alondra, PCR和 FISH检测
证实该基因能稳定遗传并已纯合。与未转基因对照
相比, 转基因株系在一定程度上减轻了小麦赤霉病
和纹枯病的病症严重程度, 病害严重程度的降低与
外源 Gastrodianin基因的表达呈正相关。
References
[1] Hu Z(胡忠), Yang Z-M(杨增明), Wang J(王均). The isolation
and partly characteristic of an anti-fungal protein extracted from
Gastrodia. Acta Botanica Yunnanica (云南植物研究), 1988, 10
(4): 373–380 (in Chinese with English abstract)
[2] Xu Q, Liu Y, Wang X, Gu H, Chen Z. Purification and charac-
terization of a novel anti-fungal protein from Gastrodia elata.
Plant Physiol Biochem, 1998, 36: 899–905
[3] Hu Z(胡忠), Huang Q-Z(黄清藻), Liu X-Z(刘小烛), Yang
J-B(杨俊波). Primary structure and cDNA cloning of the anti-
fungal protein GAFP-I from Gastrodia elata. Acta Bot Yun-
nanica (云南植物研究), 1999, 2(2): 131–138 (in Chinese with
English abstract)
[4] Wang Y-Q(王义琴), Li W-B(李文彬), Lam H, Zhang X-H(张秀
海), Chen Q(陈潜), Guo S-X(郭顺星), Sun Y-R(孙勇如).
N-terminal sequencing and cDNA cloning of Gastrodia antifun-
gal protein (GAFP). High Technol Lett (高技术通讯), 2000, 10:
10–14 (in Chinese with English abstract)
[5] Wang X, Bauw G,Van Damme E J M, Peumans W J, Chen Z L,
Van Montagu M, Angenon G, Dillen W. Gastrodianin-like man-
nosebinding proteins: a novel class of plant proteins with anti-
fungal properties. Plant J, 2001, 25: 651–661
[6] Sa Q, Wang Y, Li W, Zhang L, Sun Y. The promoter of an
antifungal protein gene from Gastrodia elata confers tissue-
specific and fungus-inducible expression patterns and re-
sponds to both salicylic acid and jasmonic acid. Plant Cell
Rep, 2003, 22: 79–84
[7] Wang H X, Yang T, Zeng Y, Hu Z. Expression analysis of the
gastrodianin gene ga4B in an achlorophyllous plant Gastrodia
elata Bl. Plant Cell Rep, 2007, 26: 253–259
[8] Wang Y Q, Chen D J, Wang D M, Huang Q S, Yao Z P, Liu F J,
Wei X W, Li R J, Zhang Z N, Sun Y R. Over-expression of Gas-
trodia anti-fungal protein enhances Verticillium wilt resistance in
coloured cotton. Plant Breed, 2004, 123: 454–459
[9] Cox K D, Layne D R, Scorza R, Schnabel G. Gastrodia
anti-fungal protein from the orchid Gastrodia elata confers dis-
ease resistance to root pathogens in transgenic tobacco. Planta,
2006, 224: 1373–1383
[10] Christensen A H, Quail P H. Ubiquitin promoter-based vectors
for high-level expression of selectable and/or screenable marker
genes in monocotyledonous plants. Transgenic Res, 1996, 5:
213–218
[11] Zhou M-P(周淼平), Yu G-H(余桂红), Ren L-J(任丽娟), Zhu
W-F(朱伟芳), Ma H-X(马鸿翔). Screening of transgenic wheat
1624 作 物 学 报 第 38卷

plants resistant to herbicide. J Triticeae Crops (麦类作物学报),
2008, 28(6): 935–940 (in Chinese with English abstract)
[12] Bedbrook J R, Jones J, O’Dell M, Thompson R D, Flavell R B. A
molecular description of telomeric heterochromatin in Secale
species. Cell, 1980, 19: 545–560
[13] Rayburn A L, Gill B S. Isolation of a D-genome specific repeated
DNA sequence from Aegilops squarrosa. Plant Mol Biol Rep,
1986, 4: 102–109
[14] Yang X-M(杨学明), Yao J-B(姚金保), Ma H-X(马鸿翔), Chen
P-D(陈佩度). FISH analysis of 45S rDNA and 5S rDNA gene
loci in a wheat-Haynaldia villosa 6V substitution line. J Plant
Genet Resour (植物遗传资源学报), 2011, 12(3): 464–467 (in
Chinese with English abstract)
[15] Chen W P, Chen P D, Liu D J, Kynast R, Friebe B, Velazhahan R,
Muthukrishnan S, Gill B S. Development of wheat scab symp-
toms is delayed in transgenic wheat plants that constitutively ex-
press a rice thaumatin-like protein gene. Theor Appl Genet, 1999,
99: 755–760
[16] Anand A, Zhou T, Trick H N, Gill B S, Bockus W W, Muthuk-
rishnan S. Greenhouse and field testing of transgenic wheat
plants stably expressing genes for thaumatin-like protein, chiti-
nase and glucanase against Fusarium graminearum. J Exp Bot,
2003, 54: 1101–1111
[17] Ye X-G(叶兴国), Cheng H-M(程红梅), Xu H-J(徐惠君), Du
L-P(杜丽璞), Lu W-Z(陆维忠), Huang Y-H(黄益洪). Develop-
ment of transgenic wheat plants with chitinase and β-1,3-
glucosanase genes and their resistance to Fusarium head blight.
Acta Agron Sin (作物学报), 2005, 31(5): 583–586 (in Chinese
with English abstract)
[18] Ye X-G(叶兴国), Sato S, Xu H-J(徐惠君), Du L-P(杜丽璞),
Huang Y-H(黄益洪), Lu W-Z(陆维忠), Clemente T. Transfor-
mation and identification of BCL and RIP genes related to cell
apodosis into wheat mediated by Agrobacterium. Acta Agron Sin
(作物学报), 2005, 31(11): 1389–1393 (in Chinese with English
abstract)
[19] Mackintosh C A, Lewis J, Radmer L E, Shin S, Heinen S J,
Smith L A, Wyckoff M N, Dill-Macky R, Evans C K,
Kravchenko S, Baldridge G D, Zeyen R J, Muehlbauer G J.
Overexpression of defense response genes in transgenic wheat
enhances resistance to Fusarium head blight. Plant Cell Rep,
2007, 26: 479–488
[20] Chen L, Zhang Z Y, Liang H X, Liu H X, Du L P, Xu H J, Xin Z
Y. Overexpression of TiERF1 enhances resistance to sharp eyespot in
transgenic wheat. J Exp Bot, 2008, 59: 4195–4204
[21] Li Z, Zhou M, Zhang Z, Ren L, Du L, Zhang B, Xu H, Xin Z.
Expression of a radish defensin in transgenic wheat confers in-
creased resistance to Fusarium graminearum and Rhizoctonia
cerealis. Funct Integr Genomics, 2011, 11: 63–70
[22] Liu X(刘欣), Cai S-B(蔡士宾), Zhang B-Q(张伯桥), Zhou
M-P(周淼平), Lu Y(路妍), Wu J-Z(吴继中), Du L-P(杜丽璞),
Li S-S(李斯深), Zang S-J(臧淑江), Zhang Z-Y(张增艳). Mo-
lecular detection and identification of TaPIEP1 transgenic wheat
with enhanced-resistance to sharp eyespot and Fusarium head
blight. Acta Agron Sin (作物学报), 2011, 37(7): 1144−1150 (in
Chinese with English abstract)
[23] Zhou M-P(周淼平), Zhou X-Q(周小青), Zhang Z-Y(张增艳),
Dong N(董娜), Ma H-X(马鸿翔), Yao J-B(姚金保). Over-
expression of TaPIEP1 enhanced resistance to wheat sharp eye-
spot in transgenic wheat. J Nucl Agric Sci (核农学报), 2011,
25(3): 421–426 (in Chinese with English abstract)
[24] Lu Y(路妍), Zhang Z-Y(张增艳), Ren L-J(任丽娟), Liu B-Y(刘
宝业), Liao Y(廖勇), Xu H-J(徐惠君), Du L-P(杜丽璞), Ma
H-X(马鸿翔), Ren Z-L(任正隆), Jing J-X(井金学), Xin Z-Y(辛
志勇). Molecular analyses on Rs-AFP2 transgenic wheat plants
and their resistance to Rhizoctonia cerealis. Acta Agron Sin (作
物学报), 2009, 35(4): 640−646 (in Chinese with English ab-
stract)
[25] Wang Y Q, Liu J, Li W B, Sun Y R. In vitro activity and cDNA
cloning of an antifungal protein with strong Gibberella zeae re-
sistance from Gastrodia elata Blume. In: Raupp J W, Ma Z,
Chen P, Liu D, eds. Proceedings of the International Symposium
on Wheat Improvement for Scab Resistance. Manhattan KS USA:
KSU Printing Services, 2000. pp 47–52
[26] Liang H(梁辉), Zhu Y-F(朱银峰), Zhu Z(朱祯), Sun D-F(孙
东发), Jia X(贾旭). Obtainment of transgenic wheat with the
insecticidal lectin from snowdrop (Galanthus nivalis aggluti-
nin; GNA) gene and analysis of resistance to aphid. Acta
Genet Sin (遗传学报), 2004, 31(2): 189–194 (in Chinese with
English abstract)
[27] Xu Q-F(徐琼芳), Tian F(田芳), Chen X(陈孝), Li L-C(李连城),
Lin Z-S(林志姗), Mo Y(莫英), Xu H-J(徐惠君), Liu Y(刘燕),
Xu W-G(许为钢), Du L-P(杜丽璞), Xin Z-Y(辛志勇). Molecu-
lar test and Aphids resistance identification of new transgenic
wheat lines with GNA gene. J Triticeae Crops (麦类作物学报),
2005, 25(3): 7–10 (in Chinese with English abstract)
[28] Liu W, Yang N, Ding J, Huang R H, Hu Z, Wang D C.
Structural mechanism governing the quaternary organization
of monocot mannose-binding lectin revealed by the novel
monomeric structure of an orchid lectin. J Biol Chem, 2005,
280: 14865–14876